クローン性増殖のためのCD133 +肝幹細胞の単離

このビデオでは、慢性肝障害後のCD 1 33細胞表面発現を使用して、肝臓幹細胞を単離してクローン増殖を研究する手順を示しています。まず、慢性肝障害のあるマウスから肝臓を取り出し、消化して単一細胞懸濁液を生成します。次に、赤血球溶解バッファーを添加して赤血球を除去し、溶液を磁気CD45抗体含有カラムに適用してCD45白血球を除去します。

次いで、CD45の枯渇細胞を選別して、CD1 33陽性肝幹細胞を濃縮する。最後に、単離されたCD1 33陽性肝幹細胞を培養し、増殖させます。In vitroの遺伝子発現およびタンパク質発現解析により、単離されたCD1 33陽性幹細胞が肝細胞と骨細胞の両方に分化できることが実証されています。

免疫組織化学技術を使用したマーカーの共局在化などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、単一細胞をクローン増殖および機能分析のために単離できることです幹細胞およびプロジェネレータ細胞の表現型を確認するために、この技術を実証することは私自身と彼はダンになります。研究室の大学院生です。すべてのバッファーを24時間前に培地に調製し、すべての溶液を使用するまで摂氏4度で保存してください。

メディア、器具、フィルター、チューブは滅菌済みで、滅菌技術で取り扱う必要があります。汚染のリスクを減らすために、安楽死させたマウスの腹部を70%エタノールで拭きます。滅菌器具を使用して、腹腔を開き、ブロック上の肝臓を説明します。

外植した肝臓から胆嚢を取り出し、次に肝臓全体を層流フード内の密閉滅菌皿の層流フードに移し、滅菌カミソリの刃を使用して、複数の水平および垂直のカットを組み合わせて肝臓をミンチにします。1分間、みじん切りにした肝臓を4つの部分に分け、各部分を10ミリリットルの酵素消化液が入った15ミリリットルのチューブに入れます。次に、チューブを摂氏37度のウォーターバスに45分間入れ、1秒あたり1〜2サイクルに設定したシェーカーに入れます。

インキュベーション後、70%エタノールでチューブを拭きます。次に、層流フードの下で、消化された肝果肉を70ミクロンのメッシュフィルターにピペットで移し、無菌皿に流れを集めて、より大きな肝細胞を含む実質画分を除去します。滅菌サプリメントのD-M-E-M-F 12培地の2ミリリットルアリコートでフィルターをすすぎます。

シリンジプランジャーのゴム端を使用して、消化されたパルプをフィルターでつぶします。この作業を5回繰り返すと、総量は約20ミリリットルになります。濾液を2本の等しい15ミリリットルのチューブに分け、次にGの50倍で摂氏4度で1分間遠心分離します。

スピンに追従。SUPナチンをスナット番号1とラベル付けされたチューブに移し、実質パルトを廃棄します。次に、幹細胞と前駆細胞を含む非実質画分を回収するために、SUPナチン番号1を遠心分離し、1分間Gを50倍加えます。

上清を上清とラベル付けされたチューブに移します。2番目、そして再びペレットを捨てます。次に、スーパーナット番号2をGの50倍で1分間遠心分離します。

スピン後、上清を上清番号3とラベル付けされたチューブに移し、ペレットを廃棄します。最後に、最終SNAT番号3をGの180倍で8分間遠心分離し、スピン後の非実質画分を取得し、上清を廃棄し、赤血球とペレットを混合するプロトコルの次のステップに直ちに進む。この手順のこの部分に使用した赤血球溶解バッファー、バッファー、ミルテンバッファーは、前日の夜に調製し、添付の文書の指示に従って摂氏4度で保存しておくべきでした。

氷上の細胞と溶液を備えた層流フードでの作業。Resusは、1 x 希釈赤血球溶解バッファーの1ミリリットルに上記のステップから非実質ペレットを懸濁し、5ミリリットルのチューブに移します。チューブにキャップをし、5秒間静かに渦巻きます。

摂氏4度で15分間インキュベートします。15分経過後は光から保護されます。スピン後5分間、Gの200倍でチューブを遠心分離し、溶解した赤血球と蘇生を含む上清を傷つけます。

ペレットを1ミリリットルの氷に懸濁し、冷たく滅菌します。Gの200倍を5分間メルトeバッファー遠心分離機。スピン後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの氷冷で滅菌した状態に再懸濁します。

ミルトンeバッファ。次に、この細胞懸濁液を10マイクロリットル取り出し、10マイクロリットルのストライプアムブルーを追加します。ヘモサイトメーターを使用して非実質細胞をカウントし、非実質画分からCD 45造血細胞の枯渇を行います。

層流フードで、セルの濃度を10から7、10から8に調整して開始します。100マイクロリットルの溶融緩衝液中の全細胞。手順全体を通して、細胞とバッファーを冷たく保ってください。

次に、1000万細胞あたり20マイクロリットルのミル、任意のCD 45マイクロビーズ抗体を適用し、摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、さらに2ミリリットルミル、任意のバッファーを加え、Gを200回5分間遠心分離します。スピン後、スナットを取り外し、1ミリリットル中に最大10個を8番目のセルに再懸濁します。

ミルト、層流フード内の任意のバッファー、ミルト、任意のLD磁気カラムを磁気ホルダーに入れます。フィルターの下に滅菌済みの5ミリリットルチューブを置き、濾液をキャッチします。次に、2ミリリットルをロードします。

任意のバッファーを溶かして、フィルターの予備洗浄を行います。洗浄が完了したら、細胞をカラムにロードします。細胞懸濁液がカラム内に入ったら、1ミリリットルのメルトEバッファーを加えてカラムを洗浄し、この洗浄をさらに2回行います。

カラムに付属のプランジャーを使用してろ過速度を上げないでください。すべての洗浄を行ったら、回収したCD 45枯渇した非実質細胞の濾液をGの200倍で5分間遠心分離します。cd 45 陽性セルが保持されているカラムを廃棄します。

次に、フローサイトメトリーを行い、CD1 33陽性細胞を単離し、細胞をミルトに再懸濁し、任意のバッファー、100マイクロリットルあたり10個の細胞を7個、100マイクロリットルを3本のチューブに分注して最初のチューブにする。2マイクロリットルのCD 1 33 PE標識抗体を2本目のチューブに加えます。IgG PE標識抗体をコントロールとして追加します。

細胞の3番目のチューブは、インキュベーション後、暗所で摂氏4度で15分間インキュベートされた未染色コントロールとして機能します。インキュベーション後、2ミリリットルの染色バッファー遠心分離機でGの200倍を5分間再懸濁します。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルのミルトンeバッファーに再懸濁します。次に、フローサイトメーターでは、未染色細胞とIGPE染色細胞を使用して、CD 1 33陽性細胞集団の最適なゲーティングのためのソーティングパラメーターを調整します。

当社のFICO ERYNまたはRPEは、通常、488ナノメートルを放射するレーザーを備えたフローサイトメーターで使用できます。最後に、CD 1 33陽性歩行を使用してCD 1 33陽性細胞集団を単離し、無菌ろ過された楕円形細胞培地に細胞を回収します。これで、細胞を培養し、クローン性単離を行い、続いてリアルタイムPCRを行い、潜在的な状態CD1 33を評価することができるようになった。

陽性の肝幹細胞は、このビデオで説明されているように、野生型およびMAT1 Aノックアウトマウスから単離されました。CD 1 33陽性細胞は、遺伝子ノックアウトMATの野生型マウスの無傷肝臓に由来する高濃縮CD 45枯渇非実質制御画分の0.4%を占めており、これは慢性肝障害のモデルである。CD 1 33陽性の人口は、同じ高濃縮分画で10倍以上に拡大します。

その後、選別細胞を培養し、クローンを増殖させました。表示。これは、ラミニン被覆96ウェルプレート上に増殖した単一のCD 1 33陽性細胞から得られた4つのコロニーの位相コントラスト画像である。これらの細胞は単離後7日で、コロニーが約25細胞である7日目に小さなコンパクトな上皮細胞コロニーを示します。

これらのR-T-P-C-R実験で見られるように、細胞からRNAを単離し、胆管部位マーカーCK19の遺伝子発現を解析しました。遺伝子発現は、CD1の数週間後に33陽性の単一細胞が単離および増殖するCD1の数週間後にCD1の潜在的な状態を確認する肝細胞マーカーアルブミンおよび胆管部位マーカーCK19の発現を示す1つのマット1から6つの細胞に10回、免疫不全ヌードマウスにマイナスマイナスモデルを皮下注射する。矢印は、細胞が注入されてから4週間後に腫瘍が成長することを示しています。

CCL 4または0.1%DDC食などの毒素誘発性慢性肝障害からのCD1 33陽性細胞は腫瘍を形成しません。生体内での腫瘍形成は、幹細胞集団内の悪性の可能性またはがん幹細胞の表現型を特定するために使用されます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば8時間で完了できます。

この手順に従って、EPAM やその他のファクトなどのファクト・マーカーを追加します。サイドポピュレーションflxなどの手法は、肝臓前駆細胞集団の表面マーカーの精製などの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見れば、フローサイトメトリーを使用して肝幹細胞と前駆細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。

動物の組織を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、手袋の着用や適切な実験技術などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。