Name: クローン性増殖のためのCD133 +肝幹細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶCD133陽性肝幹細胞の単離法。マウス肝臓から組織消化、磁気カラム分離、フローサイトメトリーで精製し、単一細胞のクローン性増殖と機能解析を可能にする技術です。

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Rountree博士は、Children's Miracle Network、National Institute of Health（K08DK080928およびR03DK088013）、およびAmerican Cancer Society Research Scholar Award（MGO-11651）からの現在の支援に感謝いたします。また、Rountree博士は、本手順が当初、Pediatric Scientist Development Program（NICHD Grant Award K12-HD00850）の資金提供を受けて開発および洗練されたことを認めます。

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li>
<li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li>
<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
<li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li>
<li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li>
<li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li>
<li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor%2Fstem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li>
<li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Rountree博士はBayer Pharmaceuticsから研究支援を受けています。Ding博士、Crooks博士、Dang氏、およびVanKirk氏は、報告すべき開示事項はありません。

造血幹細胞が白血球、赤血球、および血小板の正常な生理的代謝回転を補う細胞分化システムの維持を担う造血系とは異なり、肝幹細胞（または成人肝前駆細胞）は通常の肝恒常性維持には関与しません。5,6 急性肝障害や部分肝切除後には、分化した肝上皮である肝細胞が数回の増殖サイクルを経て、失われた肝質量を回復させます。5,6 肝幹細胞が増殖することが観察されるのは、慢性的な障害がある場合のみです。1,5-11 これらの成人期の臓器特異的幹細胞は、肝細胞と胆管細胞の両方に分化することが提唱されています。1,5-8 興味深いことに、肝癌の大部分は慢性障害を背景に発生するため、肝幹細胞は一部の肝癌の前駆細胞であるという仮説も立てられています。2-4,12-17
肝臓における幹細胞研究の大きな課題の一つは、機能解析のために希少な細胞集団を単離することです。例えば、肝臓の細胞の大部分は肝細胞であり、これらは胆管細胞やその他のより小さな非実質細胞よりも大幅に大きいという特徴があります。肝臓全体を細胞区画（大型の肝細胞である実質画分と、より小さな細胞である非実質画分）に分離し、さらにCD45陰性細胞（非造血系細胞）を選別することで、幹細胞の開始集団を600倍以上に濃縮することが可能です。1,18-21なお、CD133+集団が100%純粋な幹細胞集団であると主張しているわけではなく、これは明らかに、異なる系統および再構築能を持つ不均一な細胞集団であることを示しています。この分野における主要な制限の一つは、幹細胞と前駆細胞の定義です。本研究では「幹細胞」という用語をより広義に使用していますが、厳密な定義では、CD133+非実質細胞は2系統性の前駆細胞集団に相当します。肝臓における幹細胞および前駆細胞研究の現状に鑑みると、本報告はこの分野に関心を持つ研究者にとっての出発点となるものです。EpCAM22,23のような新しいマーカーや、Sox924のような転写因子などの新たな指標が登場すれば、それらを組み込むことができます。例えば、EpCAM+細胞とCD133+細胞の間にはかなり高い重複率があることが判明しています。
本レポートでは、正常なマウス肝臓および肝幹細胞の増殖が亢進した慢性肝損傷モデルからの幹細胞分離プロセスについて詳述します。この手法は、凍結またはホルマリン固定した肝臓の標準的な免疫組織化学的検討よりも明確な利点があり、分離後に生細胞を用いた機能解析を行うことが可能です。1,3,4 本プロセスの具体的な目的は、in vitro でクローン増殖可能な、相対的に純度の高い肝幹細胞集団を分離することです。
この手順における主な制限は、分離された細胞の大部分がフローサイトメトリー後に生存できないことである（トラブルシューティングのセクションを参照）。これは、細胞の調製に数時間を要すること、および分離前に集団を精製するために多数の手順が必要な結果である。肝臓を単細胞懸濁液として消化し、直ちにFACS解析を行った場合、肝細胞と他の非実質細胞とのサイズ差により、効果的なFACSゲートの設定が不可能となる。また、造血細胞を除去せずに肝非実質細胞を利用すると、かなりの数のCD133+細胞が造血細胞由来である可能性があり、画分に混入するリスクがある。さらに、Miltenyiフィルターで細胞を処理することで、単一細胞および非常に小さな細胞クラスターのみが回収される。これにより、サンプルがFACSの吸入ニードルを詰まらせることがないことが保証される。
本手順の代替案として、CD49fやEpCAMなどの他の細胞表面マーカー、あるいはCD133+EpCAM+などのマーカーの組み合わせへの変更が考えられます。別の公開報告では、密度勾配を用いて非実質画分から肝幹細胞を単離する方法が採用されています。この手順には超遠心機（8000 x g）が必要であり、工程に大幅な時間を要するほか、我々の経験では、FACS前の細胞回収率およびFACS後の生存率が著しく低下しました。8
今後の実験には、HNF3、HNF4α、およびαfpなどの胎児肝臓遺伝子を含む、より広範な遺伝子発現解析が含まれます。さらに、培養細胞におけるRT-PCRの結果を確認するために、発現タンパク質のウェスタンブロット解析および免疫細胞化学染色を利用することができます。
注意すべき点として、肝星細胞にCD133の発現が認められたという最近の報告があります。25 現在、我々はルーチンとしてサンプルの星細胞マーカーのスクリーニングを行っていますが（トラブルシューティングのセクションを参照）、分画において有意な混入は認められていません。これは、肝臓の消化および細胞分離の手法の違いに関連している可能性があります。2,3,26
FACSによる分離直後は、大部分の細胞が生生存できないため、動物に使用する前に、バルクのCD133+細胞として、または単一細胞として播種することを推奨します。in vitroで5〜7日間培養することで、腫瘍解析の結果を大幅に改善できます。さらに、単一細胞の分離は負荷が高いため、バルクで分離したCD133+細胞からコロニーを増殖させることができるようになってから行うべきです。肝幹細胞および前駆細胞の培養に使用できる様々な培養条件やスキャフォールドタンパク質についてのより詳細な議論は、Lola Reidによって十分に特徴付けられています。この研究では、研究者が基本的な分離技術を習得した後に自身の研究プログラムに組み込むことができる、代替条件や修正方法が提示されています27,28。また、Reid博士の研究では、肝幹細胞と分化した前駆細胞の間のリネージ生物学および成熟に関するより詳細な解析も提供されています。
in vivoでの腫瘍解析については、新鮮に単離した細胞、およびin vitroでクローン増殖させたCD133+細胞を用い、主に1x106個の細胞を使用して成功を収めてきました。我々は、慢性肝損傷の2つの遺伝的系統であるMAT1a-/-および肝臓特異的Pten-/-マウスに焦点を当て、腫瘍増殖のホストとしてヌードマウスと野生型マウスの両方を利用しました。我々の経験では、CD133+肝幹細胞は、前がん状態にある重大な肝損傷モデルから単離された場合にのみ腫瘍を形成します。CD133+細胞から形成される腫瘍は、一般に肝細胞癌と胆管癌の両方の特徴を有しており、これらの腫瘍が幹細胞または前駆細胞由来であることを示唆しています2-4,29
腫瘍の記録後のフォローアップ作業には、腫瘍組織の標準的な病理分析（H&amp;E染色）および免疫組織化学的染色が含まれます。さらに、腫瘍を微切し、消化することで、FACS分析や再培養に供することも可能です。2-4,30
結論として、本手法ではCD133+肝幹細胞およびCD133+がん幹細胞の単離、増殖、および基本的な特性評価の手順を詳細に説明しました。
トラブルシューティング：
CD45汚染：
ステップ3において、CD45+細胞の混入がある場合（これはFACS解析および単離の前にCD45-FITC抗体を添加することで評価可能）、CD45マイクロビーズ抗体が期限切れでないか、また、フィルターが磁気ホルダーに入っている間にのみ濾液を回収したかを確認してください。フィルターが磁気ホルダーに入っていない状態で回収された濾液には、CD45+細胞が含まれます。
低細胞数：
非損傷肝において、単離されるCD133+ 非実質細胞の総数は10,000個未満である可能性があります。これらの細胞は、静止期にある肝臓では稀です。DDC 0.1%食などの慢性損傷モデルでは、その数は100,000個まで大幅に増加します。総細胞数がこれらの数値を大幅に下回る場合、検討すべき事項の一つとしてFACS抗体染色の問題が挙げられます。染色の質が低いと回収率が低下するため、CD133抗体の有効期限が切れていないか確認してください。また、FACSによる単離を試みる前に、肝非実質細胞のFACS解析を行い、相対的な細胞集団を決定することを推奨します。
FACS後の細胞生存率の低下：
生存率に関する問題の一つは、細胞の処理方法および処理時間に起因している可能性があります。理想的には、ステップ1〜4を含む細胞分離手順全体を、ステップ間に時間を置かず、同日中に完了させる必要があります。ステップ1〜4の間で大幅な遅延が生じると、細胞の生存率は著しく低下します。生存率に関わるもう一つの要因として、FACS分離に使用されるシース圧が考えられます。シース圧は低めに設定することを推奨します。最後に、細胞を分離した後は速やかに播種してください。ソート後に氷上で長時間保存すると、生存率が低下します。
CD133+ 非実質細胞の不均一性：
最近の報告では、肝星細胞においてもCD133が発現しており、ある程度の可塑性を有している可能性が示唆されています25。したがって、AlbuminおよびKrt19を用いて二分化能遺伝子を確認することに加えて、静止期星細胞におけるglial fibrillary acidic proteinや、活性化星細胞におけるalpha-smooth muscle actinおよびdesminなど、星細胞に関連する遺伝子の追加検証を行うことができます3,4,26。さらに、CD133+集団はより広範な前駆細胞集団を表しています。EpCAMなどの第2のマーカーを追加することで、集団をさらに精査し、不均一性を制限できる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565-018</td><td>フェノールレッド含有</td></tr><tr><td>CD45マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞増殖因子（HGF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子（EGF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>1 gram</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>Roche Group</td><td>1088874</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>Roche Group</td><td>0165921</td><td></td></tr><tr><td>70 µmメッシュストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>50反応分</td></tr><tr><td>HotStarTaq</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi LDカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>CD133-PE FACS抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>ラミニンコートプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>354410</td><td>96ウェル</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-354</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>5x10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;個以下の細胞向け 50カラム分</td></tr><tr><td>Pharm Lyse</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>10X 濃縮</td></tr></tbody></table>

クローン性増殖のためのcd133 +肝幹細胞の単離

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

肝幹細胞（またはオーバル細胞）は、慢性の肝損傷時に増殖し、肝細胞と胆管細胞の両方に分化すると考えられています。さらに、肝幹細胞は肝癌の一種である肝細胞癌のサブセットの前駆細胞であるという仮説が立てられています。肝臓のような実質臓器における幹細胞研究の主な課題の一つは、詳細な解析のために希少な細胞集団を単離することです。例えば、肝臓における細胞の大部分は肝細胞（実質分画）であり、これらは非実質細胞よりも著しく大きいという特徴があります。肝臓の特定の細胞区画（すなわち、実質分画および非実質分画）を濃縮し、CD45陰性細胞を選別することで、開始時の幹細胞集団を600倍以上に濃縮することが可能です。本レポートで詳述する手順により、実質臓器からの比較的希少な細胞集団を効率的にソートできます。このプロセスは、正常なマウス肝臓および肝幹細胞の増殖が認められる慢性肝損傷モデルからの肝幹細胞の単離に利用可能です。この手法は、凍結またはホルマリン固定した肝臓の標準的な免疫組織化学染色よりも明確な利点があり、初期の共局在実験の後に、生細胞を用いた機能研究を行うことができます。本レポートに概説した手順を遂行するためには、FACS単離の詳細が専用の装置およびフローサイトメトリーの基本手順に関する深い知識に強く依存しているため、研究ベースのフローサイトメトリーコア施設との協力体制を築くことが強く推奨されます。本プロセスの具体的な目的は、in vitroでクローン増殖可能な肝幹細胞集団を単離することです。

ここでは、マウスの肝臓全体からCD133発現肝幹細胞およびがん幹細胞を単離する方法について説明します。このプロセスには、組織の消化、細胞の濃縮、およびフローサイトメトリーによる単離が必要です。また、高度な単一細胞単離およびクローン増殖の手法についても解説します。

クローン性増殖のためのCD133 +肝幹細胞の単離

肝幹細胞（または卵細胞）は、慢性的な肝損傷時に増殖し、肝細胞と胆管細胞の両方に分化することが提唱されている。...

このビデオでは、慢性肝損傷後のCD 133細胞表面発現を用いたクローン増殖を研究するための、肝幹細胞の単離手順を実演します。まず、慢性肝損傷を誘発したマウスから肝臓を摘出し、消化して単一細胞懸濁液を作成します。次に、赤血球溶解バッファーを加えて赤血球を除去し、その後、溶液をCD 45抗体含有磁気カラムに通してCD 45白血球を除去します。次いで、CD 45除去細胞をソーティングし、CD 1 33陽性肝幹細胞を濃縮します。最終的に単離されたCD 1 33陽性肝幹細胞を培養し、増殖させます。in vitroでの遺伝子およびタンパク質発現解析により、単離されたCD 1 33陽性幹細胞が肝細胞と骨細胞の両方に分化可能であることが示されました。免疫組織化学法を用いたマーカーの共局在などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一細胞を分離してクローン増殖および機能解析が行える点にあります。幹細胞および前駆細胞の表現型を確認するため、私自身と研究室の大学院生であるhe dangが本手法のデモンストレーションを行います。すべての緩衝液および培地は、使用の24時間前に調製し、使用まで4°Cで保存してください。培地、器具、フィルター、およびチューブはすべて滅菌されており、無菌操作で取り扱う必要があります。コンタミネーションのリスクを軽減するため、安楽死させたマウスの腹部を70% ethanolで拭きます。滅菌済み器具を用いて腹腔を開き、肝臓を露出させます。摘出した肝臓から胆嚢を取り除いた後、肝臓全体を密閉された滅菌ディッシュに入れ、ラミナーフローフード内に移動させます。滅菌済みのカミソリを用いて、水平方向と垂直方向に繰り返し切断し、肝臓を細かく刻みます。刻んだ肝臓を4等分し、それぞれを10 mLの酵素消化液が入った15 mLチューブに分注します。その後、チューブを37 °Cのウォーターバスに入れ、1〜2 Hzに設定したシェーカーで45分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを70% ethanolで拭き取ります。次に、ラミナーフローフード内で、消化した肝臓パルプを70 micronのメッシュフィルターでろ過し、大きな肝細胞を含む実質画分を除去するため、ろ液を滅菌ディッシュに回収します。フィルターを、滅菌済みのサプリメント添加D-M-E-M-F 12培地 2 mLずつで洗浄してください。シリンジプランジャーのゴム端を使用して、消化したパルプをフィルターに通して押し潰します。この操作を5回繰り返し、全量を約20 millilitersにします。ろ液を2本の15 milliliterチューブに等量ずつ分注し、4 °Cで50 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を「上清1」とラベルを貼ったチューブに移し、実質ペレットを廃棄します。次に、幹細胞および前駆細胞を含む非実質画分を回収するため、上清1を50 ×gで1分間遠心分離します。上清を「supernatant number two」とラベルを貼ったチューブに移し、再びペレットを廃棄します。次に、supernat number twoを50 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を「上清3」とラベルしたチューブに移し、ペレットを廃棄します。最後に、上清3を180 ×gで8分間遠心分離して非実質画分を得ます。遠心分離後、上清を廃棄し、赤血球とペレットを溶解させるプロトコルの次のステップに直ちに移行します。この手順で使用する赤血球溶解バッファーおよびMiltenyiバッファーは、付属の書面指示に従い、前夜に調製して4 °Cで保存しておく必要があります。細胞と溶液を氷上に置き、ラミナーフローフード内で作業を行う。前ステップで得られた非実質細胞のペレットを1 mLの1倍希釈赤血球溶血バッファーで再懸濁し、5 mLチューブに移す。チューブに蓋をし、5秒間静かにボルテックスする。4 °Cで15分間インキュベートします。15分経過後、遮光します。チューブを200 ×gで5分間遠心分離し、溶血した赤血球を含む上清を吸引除去し、再懸濁します。ペレットを1 mLの氷冷滅菌PBSバッファーに懸濁し、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを再び1 mLの氷冷滅菌PBSバッファーで再懸濁します。Milton緩衝液を用いて洗浄します。次に、この細胞懸濁液から10 µLを分取し、10 µLのstripe am blueを加えます。ヘモサイトメーターを用いて非実質細胞を計数し、非実質分画からCD 45造血細胞の除去を行います。ラミナーフローフード内で、細胞濃度をmelty buffer 100 µLあたり10⁷〜10⁸個に調整することから始めてください。全工程を通じて、細胞とバッファーを低温に保つようにしてください。次に、1,000万細胞あたり20 µLのanti-CD45 microbead antibodyを加え、4 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、さらに2 mLのbufferを加え、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、最大10⁸個の細胞を1 mLで再懸濁します。ラミナーフローフード内で、任意のLD磁気カラムを磁気ホルダーにセットします。ろ過液を回収するため、フィルターの下に滅菌済みの5 mLチューブを配置します。その後、2 mLをロードします。任意のバッファーを溶解し、フィルターのプレウォッシュを行います。洗浄完了後、細胞をカラムにロードします。細胞懸濁液がカラム内に入ったら、1 mLのmelt e bufferを加えてカラムを洗浄し、この洗浄をさらに2回繰り返します。ろ過速度を上げるために、カラムに付属のプランジャーを使用しないでください。すべての洗浄工程が完了したら、回収したCD 45除去非実質細胞のろ液を200 ×gで5分間遠心分離します。CD 45陽性細胞が保持されたカラムは廃棄してください。次に、CD133陽性細胞を単離するためにフローサイトメトリーを行います。細胞をMiltのバッファーに再懸濁し、10⁷ cells/100 µLの濃度で100 µLずつ3本のチューブに分注します。1本目のチューブに、CD133 PE共役抗体を2 µL加えます。2本目のチューブには、コントロールとしてIgG PE共役抗体を加えます。3本目の細胞チューブを無染色コントロールとして使用し、暗所で4 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、2 mLの染色バッファーで再懸濁し、200 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1 mLのMilton eバッファーで再懸濁します。次に、フローサイトメーターを用いて、無染色細胞とIGPE染色細胞を使用し、CD 1 33陽性細胞集団のゲーティングを最適化するようにソーティングパラメータを調整します。当社のFICO ERYNまたはRPEは、一般的に488ナノメートルのレーザーを搭載したあらゆるフローサイトメーターで使用可能です。最後に、CD 1 33陽性ゲートを用いてCD 1 33陽性細胞集団を単離し、滅菌ろ過したoval cell mediumで細胞を回収します。これにより、細胞の培養およびクローン分離が可能となり、続いてリアルタイムPCRを行うことでCD 1 33の分化能ステータスを評価できます。本ビデオで説明されているように、野生型およびMAT1Aノックアウトマウスから陽性肝幹細胞を単離しました。野生型マウスの非損傷肝から得られた、高度に濃縮されたCD45除去非実質コントロール画分において、CD133陽性細胞は0.4%を占めています。慢性肝損傷モデルである遺伝的ノックアウトMAT1A- weekend-minus-minusでは、同一の高度濃縮画分においてCD133陽性細胞集団が10倍以上に増加します。細胞のソーティング後、培養およびクローンの増殖を行った。ここでは、ラミニンコートした96ウェルプレート上で増殖させた、単一のCD133陽性細胞由来の4つのコロニーの位相差像を示す。これらの細胞は単離から7日後であり、コロニーが約25細胞となる7日目において、小さく密集した上皮細胞コロニーを形成していることがわかる。細胞からRNAを抽出し、これらのRT-PCR実験に示されるように、胆管部位マーカーであるCK 19の遺伝子発現を解析しました。遺伝子発現により、肝細胞マーカーであるalbuminおよび胆管部位マーカーであるCK 19の発現が認められ、CD 133陽性細胞の初期単一細胞分離およびin vitroでの増殖から数週間後の潜在的な状態が確認されました。mat 1, A- -モデルからの1 × 10⁶個の細胞を、免疫不全ヌードマウスに皮下注入します。矢印は、細胞注入から4週間後に成長した腫瘍を示しています。CCL4や0.1% DDC食などの毒素誘発性慢性肝損傷において、CD133陽性細胞は腫瘍を形成しません。in vivoでの腫瘍形成能は、幹細胞集団における悪性転化能またはがん幹細胞表現型を特定するために用いられます。この手法を習得すれば、適切に実施することで8時間以内に完了させることができます。この手順に続いて、EPAMなどの他の表面マーカーを追加します。肝前駆細胞集団の表面マーカーを詳細に定義するなど、さらなる疑問を解決するために、サイドポピュレーション（side population）分画などの手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて肝幹細胞および前駆細胞を単離する方法について、十分に理解することができたはずです。動物組織の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は常に手袋の着用や適切な実験操作などの予防措置を講じてください。

isolation-of-cd133-liver-stem-cells-for-clonal-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶCD133陽性肝幹細胞の単離法。マウス肝臓から組織消化、磁気カラム分離、フローサイトメトリーで精製し、単一細胞のクローン性増殖と機能解析を可能にする技術です。

クローン性増殖のためのCD133 +肝幹細胞の単離

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