細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーターを使用した神経伝達物質放出のイメージング

視覚化を可能にするために、薄い頭蓋骨層を含む頭蓋窓を持つマウスを取ります。

頭の動きは、付属のヘッドバーを使用して制限されます。

皮質には、神経伝達物質の放出をリアルタイムで検出できるレポーター細胞である細胞ベースの神経伝達物質蛍光工学レポーター(CNiFER)が事前に注入されています。

CNiFERは、Gタンパク質共役神経伝達物質受容体と、ドナーおよびアクセプター蛍光色素に融合したカルシウム結合ドメインからなる細胞質カルシウム検出器を発現します。

2光子顕微鏡を使用して、検出器を励起してドナー蛍光発光を引き起こし、CNiFERの視覚化を可能にします。

皮質に到達するニューロンの活動は、神経伝達物質の放出を引き起こします。

これらの神経伝達物質は CNiFER 受容体に結合し、小胞体からのカルシウム放出を誘導するシグナル伝達経路を活性化します。

増加した細胞質カルシウムは検出器に結合し、コンフォメーション変化を引き起こして蛍光色素を近接させます。

ドナーはエネルギーをアクセプターに伝達してアクセプター蛍光放出を刺激し、神経伝達物質の放出を示します。

頭を拘束した状態でイメージングプラットフォームを、2光子イメージング顕微鏡の10倍水浸対物レンズの下に置きます。505ナノメートルのダイクロイックミラーと、ECFP測定用に460ナノメートルから500ナノメートル、シトロン測定用に520ナノメートルから560ナノメートルにまたがるバンドパスフィルターを備えたフレットイメージング用のフィルターキューブを挿入します。

次に、薄くした頭蓋骨窓を含むウェルにACSFを加え、10倍の水浸対物レンズをACSFに下げます。接眼レンズを水銀ランプおよびGFPフィルターキューブと組み合わせて使用して、cNIFERの位置を特定します。次に、40倍の水浸対物レンズに切り替えます。

次に、2光子イメージングに適した光路を選択します。近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにします。波長は820ナノメートル、パワー設定は5〜15%を選択します。PMT1 および PMT2 電圧を、PMT に応じて最大値以下 (通常は 500 ボルトから 1000 ボルト) に設定します。

次に、各チャンネルのゲインを1に設定し、対物レンズのZ位置を0に設定します。対物レンズを皮質表面から約100〜200マイクロメートル下げ、x、yスキャンを開始します。各チャネルのレーザー出力ゲインとPMT電圧を調整して、cNIFER蛍光の信号対雑音比を最適化します。

次に、ソフトウェアを使用して、イメージングをcNIFER細胞を含む領域とバックグラウンド領域に制限します。適切な信号対雑音比を得るために、2 のカルマン線平均を選択し、ピクセルあたり 4 マイクロ秒で 0.3 から 1 ヘルツのスキャン レートを使用します。その後、cNIFERセルの周囲にROIを描き、平面ごとに約3〜4つのセルを囲みます。

ROI平均強度のリアルタイム分析を設定します。次に、取得を開始してcNIFER蛍光を経時的に監視し、フレットを監視しながら電気刺激または行動実験を開始します。