意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

本実験の全体的な目的は、ハンドリングによるストレスを与えない意識下のマウスにおいて、全身および組織特異的なインスリン作用を評価することです。これは、注入用のカテーテルを頸静脈に、血液サンプル採取用のカテーテルを頸動脈に外科的に留置することによって達成されます。5〜7日間の回復期間の後、5時間絶食させたマウスにインスリンを注入し、生理的な高インスリン血症状態を誘導します。

その後、動脈カテーテルから血糖値を測定し、グルコース注入速度を調整することで血糖値を維持します。この実験では、血糖値の維持に必要なグルコース注入速度とインスリン作用との直接的な関係に基づき、全身のインスリン感受性の差を測定することが可能です。尾を切断するなどの既存の採血方法に対するこの手法の主な利点は、外科的に留置された動脈カテーテルによってマウスへの血管アクセスが確保されるため、マウスを操作することなく血液サンプルを採取できる点にあります。

これにより、ストレスがなく拘束されていないマウスを用いてこれらの実験を行うことが可能になります。動脈カテーテルは、PE 10チューブの斜めにカットした部分を6 cmのSELチューブに挿入し、PE 10がSELから0.9 cm突出するようにして作製します。静脈カテーテルは、カラー付きの6 cmのSELチューブを使用します。

masaは、3 cmのPE 20を2つの1.3 cm 25ゲージステンレス製コネクターに挿入し、約120度の角度に固定して構築します。これらを、ここに示すように医療用シリコン接着剤の塊の中に挿入します。カテーテルの植え込みを開始するには、無菌操作を用いて、麻酔をかけたマウスを清潔な作業面に置きます。正中線から右に5 mmの位置に切開を加えます。

右頸静脈を単離します。頭側の端を絹縫合糸で慎重に結紮し、尾側の端にも別の縫合糸を緩く結びます。次に、スプリングシザーを用いて頭側結紮部の直下を切断し、ストッパービーズまでカテーテルを挿入します。

ビーズの後方で縫合糸を結び、カテーテルの自由端をサンプリング用シリンジに接続して、カテーテルでサンプリングが可能であることを確認します。動脈カテーテルを留置するには、胸骨の左側5 mm、かつ最初の切開部位よりも頭側に小さな切開を加えます。左総頸動脈を分離し、その後、頭側を結紮します。

シルク縫合糸で縫合し、緩く結びます。露出した血管の根端（caudal end）に別の縫合糸をかけます。次に、血管の尾端（codal end）をクランプします。

次に、スプリングシザースを用いて結紮端の直下を切断します。クランプの位置までカテーテルを慎重に挿入します。慎重にクランプを解除し、カテーテルをAstic P接合部まで進めます。

リガチャーをカテーテルにしっかりと結び、カテーテルの自由端をサンプリング用シリンジに接続して、サンプリングが可能であることを確認します。次に、動物を反転させ、肩甲骨の間に小さな切開を加えます。前方および後方の切開部位の間で、皮膚下に14ゲージの針を用いてトンネルを作成します。カテーテルを針に通し、マウスの背側へ外気に露出させます。

サンプリングアクセスまたはmasa用に、動脈および静脈カテーテルをマウスアンテナの適切なコネクタに接続します。次に、肩甲骨の間の切開口にmasaを挿入します。ナイロン縫合糸で両方の切開口を閉鎖します。

両方のカテーテルの開通性を確認します。マウスを回復のために温かく清潔なケージに入れ、インスリンクランプを行う少なくとも5日前まで回復させます。マウスで高インスリン血症・正常血糖クランプを実施する際に最も困難なステップは、正常血糖を維持することです。

マウスは代謝が非常に速く、実験中に血糖値が著しく変動することがあります。そのため、実験を通じてマウスの血糖値がどのように変化するかという感覚を養い、血糖値を一定に維持するためにグルコース注入速度をどのように調整すべきかを習得するには、ある程度の練習が必要です。標準的なクランプ法のセットアップをここに示します。

3本のInfuse 8（グルコース用、インスリン用、および洗浄赤血球用）を、スイベルに接続された4方コネクターに取り付け、マウスの上方に吊り下げます。スイベルの注入ポートを静脈カテーテルに接続します。マウスに接続する前に、すべてのInfuse 8ラインを生理食塩水で満たしてください。

次に、サンプリングラインをヘパリン生理食塩水で満たします。ヘパリン生理食塩水を入れたシリンジをスイベルの上部に接続したままにし、クリーニング用シリンジを準備します。クランプ開始の5〜6時間前からマウスを絶食させてください。

絶食開始から3時間後にマウスの体重を測定し、静脈および動脈カテーテルをそれぞれ注入ラインおよびサンプリングラインに接続します。クランプ開始の15分前に、ブランクのグルコース液を携帯型血糖測定器に挿入します。次に、ライン内の生理食塩水を排除するため、クリアリング用シリンジで血液を約50 µL吸引し、その後クリアリング用シリンジを取り外します。

チューブの先端に形成された血液の滴にグルコース測定 strips を接触させ、血糖値を測定します。次に、鈍針を装着したシリンジをサンプリングラインに挿入し、血液を 50 µL 分採取します。採取した血液を EDTA コーティングチューブに分注し、遠心分離して血漿を回収し、基礎ホルモンおよび代謝物の測定に用います。

ここで、洗浄用シリンジを再度挿入し、プランジャーを引き上げます。気泡を取り除くため、最初に採取した50 µLの血液を再び注入してください。血糖測定計に表示された血糖値を書き留めます。

10分後、血糖測定器と洗浄用シリンジを使用して血糖値を再測定し、さらに50 µLの血液を採取して別の血漿サンプルを得ます。2回目のベースライン測定が完了した後、グルコース、インスリン、および生理食塩水で洗浄した赤血球の注入ラインを4方活栓まで満たします。4方活栓をスイベル注入ポートに取り付けられたチューブに接続します。

まず、生理食塩水で洗浄した赤血球を注入します。注入速度は、研究期間中に採取される総血液量と同量に設定してください。赤血球の注入がマウスに到達したら、インスリンとグルコースの注入を開始します。

これが0分時点の状態です。インスリンをあらかじめ設定した一定の速度で注入します。初期のブドウ糖注入速度は、ベースラインの血糖値および過去の経験に基づいて推定します。

その後2時間にわたり、血糖測定器で血糖値を測定し、目標とする血糖値を維持するようにグルコース注入速度を調整します。10分間隔で新しい血糖値とグルコース注入速度を記録し、100分後および120分後に、血漿インスリンおよびその他のホルモンや代謝物を測定するための血液を追加で採取します。ここに、クランプ処置中の血糖値の時間経過を示しており、通常食および高脂肪食を投与したマウスの両方において、クランプ期間中に血糖値がいかに良好に維持されていたかがわかります。グルコース注入速度の時間経過は、血糖値を維持するために必要な速度が高脂肪食投与群で有意に低かったことを示しており、全身のインスリン作用に障害があることを示唆しています。

空腹時およびクランプ時のインスリン値は、高脂肪食群でいずれも高く、インスリン抵抗性表現型の存在をさらに裏付けています。これらのマウスでは、トリチウム標識グルコースを用いて内因性グルコース出現率を推定します。Endo aは肝糖産生の指標となりますが、対照群のマウスではインスリンによってendo Aが完全に抑制されます。

高脂肪食を投与したマウスでは、この抑制能が低下しています。同様に、全身のグルコース消失速度を推定するためにTRIDグルコースが用いられます。高脂肪食を投与したマウスでは、Rdを刺激するインスリンの能力が損なわれています。

炭素14を含む2-デオキシグルコースを用いて、組織特異的なグルコース取り込みの指標であるグルコース代謝指数RGを評価します。この例に示されているように、高脂肪食を摂取させたマウスでは、インスリン刺激による骨格筋へのグルコース取り込みが損なわれます。一般的に、この手法に不慣れな方は、動脈および静脈カテーテルを留置するために必要な微小外科手術に苦労することになります。

この手術には非常に専門的な技術が必要であり、高インスリン血症性正常血糖クランプ法の手技に習熟するには、数ヶ月にわたる継続的な練習が必要です。ここでの困難な点は、代謝が非常に高い動物モデルにおいて正常血糖を維持しようとすることにあります。