Name: 意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶ高インスリン血症・正常血糖クランプ法を用いたマウスにおけるインスリン作用評価。動脈カテーテル留置により拘束せずに正確な血糖測定を行い、代謝研究の精度を向上させる手法です。

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この作品は、グラントヴァンダービルトマウスの代謝表現型のセンターに5 - U24 - DK059637 - 10によってサポートされていました。

<ol><li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+in+vivo+in+four+commonly+used+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains.</a> Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).</li>
<li>Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+glucokinase+gene+copy+number+on+glucose+homeostasis+and+hepatic+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism.</a> J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).</li>
<li>Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+interleukin-6+and+-10+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+action+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo.</a> Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+overexpression+of+lipoprotein+lipase+causes+tissue-specific+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+rosiglitazone+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-theta+knockout+mice+are+protected+from+fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance.</a> J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+fatty+acid+transport+protein+1+prevents+fat-induced+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle.</a> J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-specific+overexpression+of+FOXC2+prevents+diet-induced+increases+in+intramuscular+fatty+acyl+CoA+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance.</a> Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fat-induced+insulin+resistance+by+salicylate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate.</a> J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+substrates+to+adipose+tissue+promotes+obesity+in+mice+with+selective+insulin+resistance+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle.</a> J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+and+the+development+of+diabetes+in+mice+with+muscle-specific+inactivation+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4.</a> J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).</li>
<li>Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+deficiency+does+not+alter+insulin+sensitivity+in+mice+maintained+on+regular+or+high-fat+diet%3A+hyperinsulinemic-euglycemic+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies.</a> Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).</li>
<li>Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+in+the+liver-specific+IGF-1+gene-deleted+mouse+is+abrogated+by+deletion+of+the+acid-labile+subunit+of+the+IGF-binding+protein-3+complex%3A+relative+roles+of+growth+hormone+and+IGF-1+in+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance.</a> Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).</li>
<li>Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+insulin+sensitivity+after+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+is+accompanied+by+paradoxical+increase+of+circulating+resistin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels.</a> Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).</li>
<li>Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+in+a+transgenic+model+of+type+2+diabetes+reverses+the+lipotoxic+state+and+improves+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis.</a> Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).</li>
<li>Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epinephrine-induced+insulin+resistance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epinephrine-induced insulin resistance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).</li>
<li>Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+mechanisms+for+the+effects+of+epinephrine+on+glucose+production+and+clearance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+in+the+conscious+mouse+is+biphasic+and+pulsatile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+mice+can+be+distinguished+by+the+period+of+their+islet+calcium+oscillations%3A+is+there+an+intrinsic+islet+period+that+is+imprinted+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo.</a> Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).</li>
<li>Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+function+and+stress+hyperglycemia%3A+plasma+glucose+and+epinephrine+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction.</a> Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterregulatory+deficits+occur+within+24+h+of+a+single+hypoglycemic+episode+in+conscious%2C+unrestrained%2C+chronically+cannulated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-deficient+corticotropin-releasing+hormone+knockout+mice+maintain+glucose+requirements+but+not+autonomic+responses+during+repeated+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucagon-like+peptide-1+receptor+regulates+endogenous+glucose+production+and+muscle+glucose+uptake+independent+of+its+incretin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action.</a> Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+overexpression+improves+exercise-stimulated+but+not+insulin-stimulated+muscle+glucose+uptake+in+high-fat-fed+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 53, 306-314 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+control+of+glucose+uptake+by+working+muscles+of+conscious+mice%3A+roles+of+transport+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+partial+knockout+impairs+exercise-stimulated+glucose+uptake+in+oxidative+muscles+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).</li>
<li>Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+exercise-stimulated+muscle+glucose+uptake+by+GLUT4+is+dependent+on+glucose+phosphorylation+capacity+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse.</a> J. Biol. Chem. , (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+kinetics+and+exercise+tolerance+in+mice+lacking+the+GLUT4+glucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter.</a> J. Physiol. 582, 801-812 (2007).</li>
<li>Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+fatty+acid+uptake+in+vivo%3A+comparison+of+%5B125I%5D-BMIPP+and+%5B3H%5D-bromopalmitate%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate.</a> Lipids. 43, 703-711 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための&quot;ゴールドスタンダード&quot;の方法と考えられている。この手法は、ヒト、イヌ、ラットやマウスを含むいくつかの種に適用されています。代謝性疾患のためのトランスジェニックマウスモデルの増加を考えると、マウスで使用するための技術の微細化は代謝の研究に大きな進歩を提供しています。 インスリンクランプの背後にある概念は単純ですが、実際にインスリンクランプ実験を行うためのさまざまなアプローチがあります。実験が行われる方法は、1を得られた結果に影響しますので、これは、些細な点ではありません。ここでは、ヴァンダービルトMMPCで使用されるプロトコルを提示する。我々のプロトコルや他の人のそれとの間の重要な違いは、我々は血液サンプルを得るために動脈カテーテルを使用することです。これはOBTのより広く使用されているアプローチとは対照的であるテール4、7、11、12、14から17の先端を切断することで血液サンプルをaining。動脈カテーテルからのサンプリングの利点は、実験が意識奔放マウスで実施されていることです。尾からのサンプリングはしばしば拘束を必要とし、大規模な血液サンプルが1を取得しているときにストレスの指標を向上させます。ストレスホルモンは、内因性グルコース産生を刺激し、グルコース処理18、19を損なう、潜在的にインスリン抵抗性の表現型の外観を与える。切断尾からサンプリングするため、そのストレスの多い性質の特殊な動物実験および使用委員会の承認を必要とする場合があります。動脈カテーテル法の手順は、尾を切断のマウスにストレスを回避するために開発されました。 インスリンクランプを行うことの重要な側面は、正常血糖を維持する能力です。正しくGIRは、血糖測定値に基づいて調整されるべきかを予測できるものアルゴリズムがありません。手術のような、インスリンクランプ実験を行う要員は、唯一の経験を通じて合理的な血糖値を維持するのに熟達するでしょう。ために彼らのより高い代謝率のマウスの研究から得られたデータは本質的に雑音になることに注意することは重要です。これは時間のグルコースとGIRのコースと血漿インスリン、endoRa、Rdと結果を解釈するためにあらゆるリーダーの能力のための重要なRgの絶対値を含むデータの完全なプレゼンテーションを、です。マウス（ヒトでの速度よりも約5倍）の高グルコースの流束率はグルコースのサンプリングの高周波数を保証。マウスの血液量が限られている間、一度、10分ごとの最小サンプリング周波数は、適切なクランプが確立されていることを確信する必要があります。 図4に示すように、クランプのインスリンレベルは、グループ間で異なる可能性があります。このような食事の介入、トランスジェニック操作やバックグラウンドの系統の違いなどの要因は、FASに影響を与える可能性がその後、クランプのインスリンレベルに影響を与える可能ティンのインスリンレベル、。クランプのインスリン濃度が異なる場合の結果を解釈するのが問題になる可能性があります。これは、実験群の間に相当するクランプのインスリンレベルを達成するインスリン注入速度を選択するためのパイロット実験を行うことにより対処することができます。また、ソマトスタチンは、膵臓のホルモンの分泌を抑制するために使用することができます、そしてインシュリンとグルカゴンは、実験的に制御するレートで交換することができます。この後者のアプローチは、より一般的にはマウスよりもラットにインスリンクランプで行われます。これらの実験的アプローチが取られていない場合、定常状態のGIRは、クランプインスリンレベルに正規化することができます、またはインスリン感受性指数（S I）は、S I = GIR /（G•ΔI）、などのクランプのデータから導出することができますGは、定常状態のグルコース濃度であり、ΔIは、空腹時やクランプのインスリン濃度との差です。どちらのアプローチで一つの仮定は達成クランプのインスリンレベルがあることです。インスリン感受性が直線的に研究されているグループに応じてインスリンのレベルに関連している範囲内で。インスリン抵抗性とインスリン感受性のグループを比較するときは、この後者の仮定は適用されない場合があります。理想的には、インスリンの用量反応曲線は、適切なインスリン注入を選択するために生成する必要があります。しかし、追加実験の必要性から、これはめったに行われません。 動脈カテーテルが提供する汎用性は、正常血糖クランプを超えた実験的なアプローチにも及ぶ。例えば、高血糖クランプは、グルコースが空腹時血糖値からの相対高血糖を維持するために可変速度で注入されている、 生体 2、20、21 の内因性膵臓機能を評価するために使用することができます。このテスト中に第一段階のインスリン分泌の測定は、血液サンプルの頻繁な買収（毎2〜5分間すなわち）、尾の先端からサンプルを取得するときには不可能ですが必要です。また、尾サンプリングに起因する上昇カテコールアミンがインスリン分泌を障害するとグルカゴンの分泌22を高めることができる。インスリンクランプのプロトコルはまた、反規制への反応2、23、24を評価するために相対的な低血糖に低下する血糖値を可能にするために変更することができます。動脈カテーテルはまた、運動25から30の間にグルコース代謝の動態を評価するために使用することができます。これは、単一の時点の前後の運動時または分離された筋肉を ex vivoで実施された従来の手法よりも著しく有利で ​​ある。ここで紹介するテクニックは、だけでなくグルコースでなく、脂肪酸の代謝31を評価するために使用することができます。

意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

2型糖尿病はインスリン作用の欠損によって特徴付けられる。高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための&quot;ゴールドスタンダード&quot;の方法と考えられている。インスリンクランプ時には、高インスリン血症は、一定のインスリン注入することによって達成される。正常血糖値は、可変レートで併用グルコース注入を介して維持されます。この変数はグルコース注入率（GIR）は、実験を通して短い間隔で血糖値を測定し、それに応じてGIRを調整することによって決定されます。強化インスリン作用を有するマウスは、より大きなGIRを必要とGIRは、全身インスリン作用の指標である。インスリンクランプは同位体2の管理を組み込むことができます[14 C]デオキシグルコースは、組織特異的グルコース取り込みを評価すると[3 - 3 H]グルコースは、内因性のグルコースの外観（endoRa）の速度を抑制するインスリンの能力、のマーカーを評価する肝臓でのグルコース産生、および刺激する全身グルコースの消失（路）の割合。 代謝性疾患の遺伝的マウスモデルで使用するためにインスリンクランプの小型化は、糖尿病の研究に大きな進歩をもたらした。インスリンクランプを実行するためのメソッドは、研究室によって異なります。インスリンクランプが行われる方法が大幅に得られた結果に影響を与えることができることに注意することは重要です。私たちは、意識的なマウス1と同様に様々なクランプ技法2を使用して、4つの一般的に使用される近交系マウスの代謝反応の評価にインスリンクランプを行うためにさまざまなアプローチの包括的な評価を発表している。ここでは、ヴァンダービルトマウス代謝表現型センター（;：www.mc.vanderbilt.edu / MMPC URL MMPC）により開発された意識、無拘束マウスにインスリンクランプを行うためのプロトコルを示す。これは、インスリンクランプ時に使用されるカテーテルを注入するための方法の説明が含まれています。で採用されているプロトコルバンダービルトMMPCは、ユニークな2カテーテルシステム3を利用しています。 Oneカテーテルは、注入のための頸静脈に挿入されます。第二カテーテルは、マウスを抑制または処理することなく、血液サンプリングを可能に頸動脈に挿入されます。このテクニックは、尾の切断端からのサンプリングです。インスリンクランプ時の血液サンプルを得るために最も一般的な方法に重要な利点を提供します。この後者のメソッドとは異なり、動脈カテーテルからサ ​​ンプリングすると、マウス1〜ストレスではありません。我々はまた、組織特異的なインスリン作用を評価するために同位体トレーサーの注入を使用するための方法を説明します。我々はまた、インスリンの留め金から得られた結果の適切なプレゼンテーションのためのガイドラインを提供しています。

高インスリン血症 - 正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、インスリンの作用を評価するためのゴールドスタンダードです。<em&gt; in vivoで</em&gt;。マウスではインスリンクランプを行う方法について説明する。これは最小限のストレスで意識、無拘束マウスで実行する実験を許可する動脈カテーテル法のためのメソッドが含まれています。

2型糖尿病は、インスリン作用の欠損を特徴とする。高インスリン血症・正常血糖クランプ法（インスリンクランプ法）は、一般的に「ゴールド...」と見なされている。

本実験の全体的な目的は、ハンドリングによるストレスを与えない意識下のマウスにおいて、全身および組織特異的なインスリン作用を評価することです。これは、注入用のカテーテルを頸静脈に、血液サンプル採取用のカテーテルを頸動脈に外科的に留置することによって達成されます。5〜7日間の回復期間の後、5時間絶食させたマウスにインスリンを注入し、生理的な高インスリン血症状態を誘導します。その後、動脈カテーテルから血糖値を測定し、グルコース注入速度を調整することで血糖値を維持します。この実験では、血糖値の維持に必要なグルコース注入速度とインスリン作用との直接的な関係に基づき、全身のインスリン感受性の差を測定することが可能です。尾を切断するなどの既存の採血方法に対するこの手法の主な利点は、外科的に留置された動脈カテーテルによってマウスへの血管アクセスが確保されるため、マウスを操作することなく血液サンプルを採取できる点にあります。これにより、ストレスがなく拘束されていないマウスを用いてこれらの実験を行うことが可能になります。動脈カテーテルは、PE 10チューブの斜めにカットした部分を6 cmのSELチューブに挿入し、PE 10がSELから0.9 cm突出するようにして作製します。静脈カテーテルは、カラー付きの6 cmのSELチューブを使用します。masaは、3 cmのPE 20を2つの1.3 cm 25ゲージステンレス製コネクターに挿入し、約120度の角度に固定して構築します。これらを、ここに示すように医療用シリコン接着剤の塊の中に挿入します。カテーテルの植え込みを開始するには、無菌操作を用いて、麻酔をかけたマウスを清潔な作業面に置きます。正中線から右に5 mmの位置に切開を加えます。右頸静脈を単離します。頭側の端を絹縫合糸で慎重に結紮し、尾側の端にも別の縫合糸を緩く結びます。次に、スプリングシザーを用いて頭側結紮部の直下を切断し、ストッパービーズまでカテーテルを挿入します。ビーズの後方で縫合糸を結び、カテーテルの自由端をサンプリング用シリンジに接続して、カテーテルでサンプリングが可能であることを確認します。動脈カテーテルを留置するには、胸骨の左側5 mm、かつ最初の切開部位よりも頭側に小さな切開を加えます。左総頸動脈を分離し、その後、頭側を結紮します。シルク縫合糸で縫合し、緩く結びます。露出した血管の根端（caudal end）に別の縫合糸をかけます。次に、血管の尾端（codal end）をクランプします。次に、スプリングシザースを用いて結紮端の直下を切断します。クランプの位置までカテーテルを慎重に挿入します。慎重にクランプを解除し、カテーテルをAstic P接合部まで進めます。リガチャーをカテーテルにしっかりと結び、カテーテルの自由端をサンプリング用シリンジに接続して、サンプリングが可能であることを確認します。次に、動物を反転させ、肩甲骨の間に小さな切開を加えます。前方および後方の切開部位の間で、皮膚下に14ゲージの針を用いてトンネルを作成します。カテーテルを針に通し、マウスの背側へ外気に露出させます。サンプリングアクセスまたはmasa用に、動脈および静脈カテーテルをマウスアンテナの適切なコネクタに接続します。次に、肩甲骨の間の切開口にmasaを挿入します。ナイロン縫合糸で両方の切開口を閉鎖します。両方のカテーテルの開通性を確認します。マウスを回復のために温かく清潔なケージに入れ、インスリンクランプを行う少なくとも5日前まで回復させます。マウスで高インスリン血症・正常血糖クランプを実施する際に最も困難なステップは、正常血糖を維持することです。マウスは代謝が非常に速く、実験中に血糖値が著しく変動することがあります。そのため、実験を通じてマウスの血糖値がどのように変化するかという感覚を養い、血糖値を一定に維持するためにグルコース注入速度をどのように調整すべきかを習得するには、ある程度の練習が必要です。標準的なクランプ法のセットアップをここに示します。3本のInfuse 8（グルコース用、インスリン用、および洗浄赤血球用）を、スイベルに接続された4方コネクターに取り付け、マウスの上方に吊り下げます。スイベルの注入ポートを静脈カテーテルに接続します。マウスに接続する前に、すべてのInfuse 8ラインを生理食塩水で満たしてください。次に、サンプリングラインをヘパリン生理食塩水で満たします。ヘパリン生理食塩水を入れたシリンジをスイベルの上部に接続したままにし、クリーニング用シリンジを準備します。クランプ開始の5〜6時間前からマウスを絶食させてください。絶食開始から3時間後にマウスの体重を測定し、静脈および動脈カテーテルをそれぞれ注入ラインおよびサンプリングラインに接続します。クランプ開始の15分前に、ブランクのグルコース液を携帯型血糖測定器に挿入します。次に、ライン内の生理食塩水を排除するため、クリアリング用シリンジで血液を約50 µL吸引し、その後クリアリング用シリンジを取り外します。チューブの先端に形成された血液の滴にグルコース測定 strips を接触させ、血糖値を測定します。次に、鈍針を装着したシリンジをサンプリングラインに挿入し、血液を 50 µL 分採取します。採取した血液を EDTA コーティングチューブに分注し、遠心分離して血漿を回収し、基礎ホルモンおよび代謝物の測定に用います。ここで、洗浄用シリンジを再度挿入し、プランジャーを引き上げます。気泡を取り除くため、最初に採取した50 µLの血液を再び注入してください。血糖測定計に表示された血糖値を書き留めます。10分後、血糖測定器と洗浄用シリンジを使用して血糖値を再測定し、さらに50 µLの血液を採取して別の血漿サンプルを得ます。2回目のベースライン測定が完了した後、グルコース、インスリン、および生理食塩水で洗浄した赤血球の注入ラインを4方活栓まで満たします。4方活栓をスイベル注入ポートに取り付けられたチューブに接続します。まず、生理食塩水で洗浄した赤血球を注入します。注入速度は、研究期間中に採取される総血液量と同量に設定してください。赤血球の注入がマウスに到達したら、インスリンとグルコースの注入を開始します。これが0分時点の状態です。インスリンをあらかじめ設定した一定の速度で注入します。初期のブドウ糖注入速度は、ベースラインの血糖値および過去の経験に基づいて推定します。その後2時間にわたり、血糖測定器で血糖値を測定し、目標とする血糖値を維持するようにグルコース注入速度を調整します。10分間隔で新しい血糖値とグルコース注入速度を記録し、100分後および120分後に、血漿インスリンおよびその他のホルモンや代謝物を測定するための血液を追加で採取します。ここに、クランプ処置中の血糖値の時間経過を示しており、通常食および高脂肪食を投与したマウスの両方において、クランプ期間中に血糖値がいかに良好に維持されていたかがわかります。グルコース注入速度の時間経過は、血糖値を維持するために必要な速度が高脂肪食投与群で有意に低かったことを示しており、全身のインスリン作用に障害があることを示唆しています。空腹時およびクランプ時のインスリン値は、高脂肪食群でいずれも高く、インスリン抵抗性表現型の存在をさらに裏付けています。これらのマウスでは、トリチウム標識グルコースを用いて内因性グルコース出現率を推定します。Endo aは肝糖産生の指標となりますが、対照群のマウスではインスリンによってendo Aが完全に抑制されます。高脂肪食を投与したマウスでは、この抑制能が低下しています。同様に、全身のグルコース消失速度を推定するためにTRIDグルコースが用いられます。高脂肪食を投与したマウスでは、Rdを刺激するインスリンの能力が損なわれています。炭素14を含む2-デオキシグルコースを用いて、組織特異的なグルコース取り込みの指標であるグルコース代謝指数RGを評価します。この例に示されているように、高脂肪食を摂取させたマウスでは、インスリン刺激による骨格筋へのグルコース取り込みが損なわれます。一般的に、この手法に不慣れな方は、動脈および静脈カテーテルを留置するために必要な微小外科手術に苦労することになります。この手術には非常に専門的な技術が必要であり、高インスリン血症性正常血糖クランプ法の手技に習熟するには、数ヶ月にわたる継続的な練習が必要です。ここでの困難な点は、代謝が非常に高い動物モデルにおいて正常血糖を維持しようとすることにあります。

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高インスリン血症、正常血糖クランプは、インスリン作用の評価のための"ゴールドスタンダード"です。インスリンはグルコース取り込みを刺激する一定の速度で注入する。このドロップダウンに対抗するために注入された外因性グルコースの量は、インスリン感受性の指標である。ここで手順は意識、無拘束のラットで実行されます。...

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