Caenorhabditis elegansのニューロンにおける細胞内カルシウムダイナミクスのイメージング

寒天パッド付きのスライドで2つの別々のトランスジェニックCaenorhabditis elegans株を取ります。パッドには、動きを最小限に抑える麻痺剤を含むローリング溶液が含まれています。

ワームの腹側神経索(VNC)には、一方の株では細胞質カルシウム指標を発現し、もう一方の株ではミトコンドリアカルシウム指標を発現する興奮性介在ニューロンが含まれています。

カバーガラスを置き、ワームを転がし、VNCを視覚化できるように向きを変え、蛍光顕微鏡下に置きます。

可視光を使用してワームの位置を特定し、蛍光モードに切り替えます。

安静ニューロンでは、細胞内カルシウムが低いと指標が結合解除され、蛍光が弱くなります。

自発的なニューロン活動により、電位依存性カルシウムチャネルが開き、カルシウムの流入が可能になります。

細胞質指示薬を持つ株では、カルシウムが指示薬に結合し、細胞質蛍光を高めます。

過剰な細胞質カルシウムはチャネルを通ってミトコンドリアに入ります。ミトコンドリア指標を持つ株では、カルシウム結合によりミトコンドリア蛍光が増加します。

両方の株のニューロンを画像化して、細胞内カルシウムの動態を監視します。

13 x 100 mmのガラス培養管で、分子グレードの寒天をM9に溶解し、マイクロ波で数秒間溶解して、3ミリリットルの10%寒天を調製します。寒天パッドを作るには、まず実験用テープを2層追加して2枚のスライドを準備します。次に、2つのスライドの間に顕微鏡スライドを置きます。1,000マイクロリットルのピペットチップの先端を切断し、それを使用して寒天の小さな滴をカバーガラスの中央にピペットで移します。

寒天の上に別のスライドを押して寒天を平らにします。冷却後、寒天を10ミリリットルのチューブの開口部を使用して小さな円盤に切り、周囲の寒天を取り除きます。次に、ムシモール粉末をM9に溶解してウォーム圧延液を調製し、30ミリモルのストックを作成します。ストックをポリスチレンビーズで1対1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。

イメージングのためにワームを配置するには、まず1.6マイクロリットルのローリング溶液を寒天パッドの中心に置きます。次に、好ましいワームピックを使用して、所望の年齢のワームを寒天パッド上のローリング溶液に移します。ムシモールがワームの動きを減らすまで約5分間待ってから、寒天パッドの上に22 x 22ミリメートルのカバーガラスを落とします。

腹側神経索の神経突起を画像化するには、カバーガラスをわずかにスライドさせてワームを転がします。ワームを顕微鏡に取り付けるには、カバーガラスに浸漬油を一滴垂らします。明るい視野で低倍率の対物レンズを使用してワームを見つけます。次に、100倍対物レンズに切り替え、488ナノメートルのイメージングレーザーでGCaMPまたはmito-GCaMPの照明を使用してAVA神経突起を見つけます。