Name: 高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ酵母リボソームのクロマトグラフィー精製法。SulfoLinkカラムとプルマイシン処理により、核酸分解酵素やプロテアーゼから高純度に分離し、生化学・構造生物学研究に有用な高活性リボソームを調製する手法です。

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我々はこのプロジェクトで彼らの助けと入力用のアシュトンブリュー、カレンジャック、Sharmishtha Musalga、セルゲイSulima、シヴァーニレディ、そしてマイケルRhodin含むDinmanの研究室のメンバーのすべてを、感謝します。この作品は、米国心臓協会（AHA 0630163N）からAMにと国立衛生研究所（5R01 GM058859 - 12）からしてくれたための補助金によって支えられている。 JALは、親の助成金から2009サプリメントのアメリカの再投資および回復法（3R01GM058859 - 11S1）によってサポートされていました。

1。 Sulfolink樹脂の帯電システインの準備<ol><li>室温でSulfolink樹脂（Pierce）を準備します。 </li><li>各バイアルに分散5mlで、として2 10ミリリットルのプラスチックバイアルの製造元によって提供されるSulfolinkカップリングゲルの50％のスラリーを10mlの合計を置きます。 </li><li>簡単に言えば850 × gでバイアルを遠心し、注意深く上清を取り除く。 </li><li> 、5mlにビーズを再懸濁XGの850℃を軽く遠心し、ピペットで上清を除去することにより（50 mMトリス、pH 8.5、5mMのEDTA）カップリングバッファーでゲル3回洗浄する。 </li><li>各チューブにカップリング緩衝液中のL -システインの50 mM溶液五mlを加え、25℃で1時間スラリーを混合℃に</li><li>上記のステップ1.4で説明したように洗浄することにより残存L -システインを削除します。 </li><li>結合緩衝液10mlでゲル[20mMのHEPES、pHは7.6、5 mMのマグネシウム（OAC）2、60mMのNH 4 Clを 、2mMのDTT]を再懸濁し、そして結合緩衝液10mlで洗浄することによって樹脂を平衡化3回は、ステップ1.4で説明したように。デカント10 mlの遠心カラムへの樹脂、キャップと4℃で保存RNA結合用樹脂の能力は〜20ミリリットル当たり260単位です。 </li></ol> 2。 Sulfolink樹脂の帯電システインを使用して、リボソームのクロマトグラフィー精製注：プロテアーゼ活性が問題であると証明する菌株を扱う場合、プロテアーゼ阻害カクテルは、後続のすべてのバッファで使用することができます。 <ol><li>氷の上ですべてのコンポーネントを維持し、RNaseフリー水、無菌ろ過を使用して、すべてのソリューションを準備する。 </li><li>適切なメディアで-中期対数増殖期（1.2 OD 595 = 0.6）に一夜酵母細胞を成長する。ペレットを遠心分離により細胞、および4℃で5分間3700 × gで結合バッファーと遠心で1グラムの細胞を洗浄℃に</li><li>結合緩衝液1mlで2 mlのおおよその合計量に対して、および4に冷やして0.5 mmのガラスビーズの等量を使用して混乱させる再懸濁し、細胞° C UBiospecミニビーズビーター（バートル、[OK]を）歌う。必要に応じてサンプルは複数のチューブに分割することができます。 </li><li> Beckman - Coulter社オプティママックスEの超遠心機（フラートン、カリフォルニア州）で30分間、30,000 xgで遠心分離によって破砕されなかった細胞、オルガネラ、および細胞の残骸を削除します。 </li><li>使用直前に、ペレットは1,000で1分間樹脂は、ストレージソリューションを削除するには、XGの。樹脂の二mlの細胞のすべての1グラムのために使用されます。 </li><li>直接充電Sulfolinkスラリー中に非常に上部または細胞残渣管の下部にある脂質画分のいずれかからの汚染、および場所を最小限に抑えるように注意しながら、30,000 × gでのスピン（S30）から細胞ライセートの上清を取り除く。脂質層を除去したり、先端が上清中に交差した後、ピペットから押し出すことで回避できます。 </li><li> 15分間混合することなく氷上にS30/Sulfolinkの混合物をインキュベートする。 </li><li> 15 mlコニカルチューブにカラムを配置し、1,000 × gで遠心分離R 1分。 </li><li>バック列を、手で混合し、氷上でさらに15分間インキュベートにフロースルー画分を置きます。 </li><li> 15 mlコニカルチューブにカラムを置き、1分間1,000 × gで遠心。ろ過液を廃棄します。 </li><li>キャップの列と結合バッファー5 mlを加える。再懸濁し、キャップを外して、そして1分間1,000 × gでのカラムの遠心機を遠心分離するまで、手で列を混在させること。この洗浄プロトコルをあと2回繰り返します。 </li><li>各カラムに溶出バッファーを1.5 ml（20 mMのHEPES - KOH、pHは7.6、10mMのマグネシウム（OAC）2、500mMのKClを、2mMのDTT、0.5 mg / mlのヘパリン）を追加します。手でスラリーを混合し、氷上で2分間インキュベート</li><li> 1分間1,000 × gで新しい15 mlコニカルチューブと遠心分離機に入れます列。溶出液を集める。もう一度最終的な混合サンプルのボリュームが〜3ミリリットルであることを溶出ステップを繰り返します。使用される樹脂は、ヘパリンなしで溶出緩衝液で洗浄し、結合buffeで平衡化を続けることができますR、および後で再利用するため4で結合バッファー10 mlのボリューム° Cに保存。 </li></ol> 3。ピューロマイシンの治療注：代替方法汚染のtRNA種を除去するためには、メディアがリボソーム流出を促進するために枯渇グルコースへの豊富なグルコースから切り替えることです。しかし、これはリボソームの機能と濃度に影響を与える可能性の酵母細胞の代謝状態を変更しません。 内因性ペプチジル- tRNAのからリボソームを除去するために、ピューロマイシンによる治療が行われます。 <ol><li>室温で1M KOH滴下してpH7.5の100mMのピューロマイシンのソリューションに中和する。 </li><li>溶出液中の〜1mMの最終濃度になるように中和ピューロマイシン溶液を加える。 </li><li> 1mMの最終濃度を100 mMのGTPを追加。 </li><li> 30℃で30分間インキュベート℃、 </li></ol> 4。グリセロールのクッションを介して沈降によるリボソームの精製<ol><li>場所1ミリリットルクッションの緩衝液（20mM HEPES、pHは7.6、10mMのマグネシウム（OAC）2、500mMの塩化カリウム、2mMのDTT、25％グリセロール）の4 mlの容積ポリカーボネート超遠心チューブに。 </li><li>一晩4 XGの100,000クッションの上に溶出分画、及び遠心分離サンプルを扱う優しく層ピューロ℃に</li><li>遠心ローターからチューブを外し、上清を吸引除去する。 </li><li>クッション緩衝液1mlで2回精製リボソームを含むペレットを洗う。 </li><li>ガラス棒を使用して穏やかな破壊によってクッションバッファー100μlでリボソームを再懸濁します。 </li><li>中断した後、パラフィルムでチューブをカバーし、一時間低温室の渦の中程度のスピードで振る。 </li><li> 、マイクロ遠心チューブに内容を移し、4℃での最大速度で5分間遠心し、そして新鮮なチューブに上清を取り除く。 </li><li> 2クッションの緩衝mlのと、保存緩衝液（50mMのHEPES - KOH pHは7.6、50mMのNH 4 Clを、5mMのMgのその100μlを除いてを使用して、ステップ4.1から4.7を繰り返します。（OAC）2、1mMのDTT、25％グリセロール）が代わりにクッションのバッファのステップ4.4および4.5で使用されています。 </li><li>定量精製リボソーム分光光度法（1 A 260 = 20酵母のリボソームのピコモル）、-80℃で保存します。酵母の1グラムの標準的な結果は、リボソームの300〜400ピコモルです。 </li></ol> 5。代表的な結果： プロトコルの3つの主要ステップのそれぞれから抽出したRNA種の例を図2に示されています。 rRNAsは、これらはまた、他のRNA種の多数を含む全細胞ライセート（T）内に存在する主要な種である一方。 Sulfolink列（SL）から精製されたリボソームはまた、同様にこれらの種のカラムベッドの高い親和性によるtRNAの大量が含まれています。ペプチジル- tRNAのからのペプチドの加水分解におけるピューロマイシンの結果、この画分の治療、およびリボソームからこれらの種の解離を促進する。ピューロマイシン処理した試料（PM）の欠如共同purifyinこのようにグラムのtRNA種、および完全に純粋なリボソームを表す。以前に8を報告したように、これらのリボソームは、それらの詳細な機能と構造解析のための理想的な基板製造、無傷および生化学的にアクティブになります。 <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。方法のフローチャート。sulfolinkの樹脂が描かれているリンクされたシステインを使用して、リボソームのクロマトグラフィー精製。 <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。リボソームの調製の代表的な分析全 RNA種が続いてピューロマイシンによる治療を受けた全細胞ライセート（T）、Sulfolink精製リボソーム（SL）とSulfolink精製がリボソームから抽出され、グリセロールのクッション（PM）を介して沈降させた。レーンMはRNAサイズマーカーを表します。 25Sと18S rRNAs、同様のtRNAおよび他のRNA種を表すバンドが示されている。すべてレーンは、RNAを2μgを充填した。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

リボソームの精製プロトコルは基本的に低速のスピンからサ ​​イトゾル画分を収穫し、溶解細胞が関与し、高速遠心分離1によってリボソームをペレット化。いくつかの新規な方法は細菌のリボソームを精製するのに使用されているが、同じことが真核生物2〜4真されていませんでした。追加の手順が長年、例えば塩の洗浄、およびグリセロールのクッション（例えば5を参照）に沿って追加されているが、酵母のリボソームの生化学的および構造的研究は、おそらく、精製の ​​過程で内因性の分解酵素によって分解さになるために彼らの傾向によって妨げられているリボソーム、酵素6のこれらのクラスにさらされている時に超遠心分離工程の間、長期間に起因する。 従来のプロトコルに関連付けられている主要な問題は、リボソームとプロテアーゼおよびヌクレアーゼの共精製です。それらの分解におけるこの結果の間に生化学的にアクティブなリボソームの利回りの低下、その結果精製プロセス、。 Sulfolink樹脂7を充電システインを使用してリボソー...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Sulfolinkカップリング樹脂</td><td>ピアース</td><td> 20402 </td></tr><tr><td>ミニビーズビーター16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td>オプティママックスE超遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td></tr><tr><td>レジェンドRT </td><td>ソーバル</td><td></td></tr><tr><td> 0.5 mmのガラスビーズ</td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Clを </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9434 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 60128 </td></tr><tr><td> MG（OAC）2 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 221473 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5516 </td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

真核生物のリボソームは、このように研究者に大きな課題を投げかけ、はるかに不安定な彼らの真正細菌とarchaelの対応と比較しています。特に厄介な細胞の溶解は、リボソームを低下させる可能性プロテアーゼおよびヌクレアーゼの多数のリリースという事実です。従って、それは可能な限り迅速にこれらの酵素からリボソームを分離することが重要です。残念ながら、従来の差動遠心分離法は、それらの構造的完全性と機能性に影響を与える、時間の許容できないほど長時間、これらの酵素にさらされるリボソームを残します。この問題に対処するため、我々はSulfolink樹脂充電システインを使用してクロマトグラフィー法を利用しています。このシンプルかつ迅速なアプリケーションが大幅にそのまま、非常に生化学的にアクティブ酵母のリボソームの高収量の生産、CO浄化のタンパク質分解と核酸分解活性を低減します。我々は、このメソッドはまた、哺乳動物リボソームに適用されるべきことを示唆している。のシンプルさクロマトグラフィーで精製したリボソームの方法、および強化された純度と活性は、真核生物のリボソームの研究のための重要な技術的進歩を表しています。

CO浄化ヌクレアーゼ及びプロテアーゼによって従来の方法で精製した真核生物リボソームの調製品の汚染は否定的に下流の生化学的および構造解析に影響を与えます。迅速かつ簡単なクロマトグラフィー精製法は、モデル系として、酵母のリボソームを使用してこの問題を解決するために使用されます。

真核生物のリボソームは、真真正核生物や古細菌のものに比べて非常に不安定であるため、研究者にとって大きな課題となっている。

この手順の全体的な目的は、完全で活性の高い酵母リボソームを精製することです。まず細胞を溶解し、高速遠心分離によって溶解物を清澄化することでこれを達成します。次いで、システインを担持させたSFOリンクカラムを用いてリボソームを精製し、S 30 分画を得ます。続いて、最終精製ステップとしてピューロマイシン処理を行い、混入したtRNAを除去します。その後、リボソームを高速超遠心分離にかけます。超遠心精製などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、サルファリンクカラムを用いることで、リボソームを混入したエキソヌクレアーゼやプロテアーゼから迅速に分離できることです。さらに、ピューロマイシン処理ステップにより、リボソームをtRNAなどの不純なRNA種から分離します。これらのステップを経ることで、生化学的および構造的研究に使用するための、活性が高く完全な精製リボソームを大量に得ることが可能になります。本手順の実演は、私の研究室のポストドクトラル研究員であるJonathan Leschenが行います。本プロトコルの開始にあたり、メーカー提供のSulfaLinkカップリングゲルの50%スラリーを、10 mLのプラスチックバイアル2本に5 mLずつ分注します。バイアルを850 ×gで短時間遠心分離した後、上清を慎重に除きます。カップリングバッファーを用いてゲルの洗浄を3回行います。具体的には、ビーズを5 mLのバッファーに再懸濁させ、その後850 ×gで短時間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。レジンの洗浄後、各チューブにカップリングバッファーで調製した50 mM L-cysteine溶液を5 mLずつ加えます。スラリーを25 °Cで1時間混合します。その後、カップリングバッファーのみで樹脂を3回洗浄し、残留したL cysteineを除去します。次に、ゲルを10 mLの結合バッファーに再懸濁し、3回洗浄して樹脂を平衡化します。最後に、レジンを10 milliliterの遠心分離カラムにデカンテーションし、キャップを閉めます。このレジンは4 °Cで保存することができ、システイン担持sulfa linkレジンを用いたリボソームのクロマトグラフィー精製におけるレジン容量は、約20〜60 units/milliliterです。すべての構成要素を氷上で保持し、すべての溶液はRNaseフリーの水を用いて調製し、滅菌ろ過を行ってください。酵母細胞を適切な培地で対数増殖期中期まで一晩培養します。遠心分離で細胞を回収した後、1 gの細胞を結合バッファーで洗浄して再度遠心分離し、その後、細胞を1 mLの結合バッファーに再懸濁して、総量を約2 mLにします。4 °Cに冷却した0.5 mmのガラスビーズと同 volumes の細胞懸濁液をミニビーズビーダーを用いて破砕します。超遠心機を用いて30,000 ×gで30分間遠心分離し、未破砕細胞、オルガネラ、および細胞残渣を除去します。一方、レジンを1,000 ×gで1分間遠心し、ペレット化します。使用直前に保存液を除去してください。細胞1gに対して2mLのレジンを使用します。サンプルの超遠心後、30,000 ×gで遠心分離して得られた細胞溶解液の上清（S 30）を回収します。この際、最上層の脂質画分やチューブ底部の細胞残渣による混入を最小限に抑えるように注意してください。上清をチャージ済みのSFO linkスラリーに直接移します。S 30 SFO link混合物を氷上で15分間インキュベートします。カラムを50 milliliterコニカルチューブに入れ、1000 ×gで1分間遠心分離し、通り抜けた分画をカラムに戻し、カラムにキャップをして反転させて混合します。サンプルを氷上でさらに15分間インキュベートします。次に、カラムを50 milliliter conical tubesに入れ、1000 ×gで1分間遠心分離し、ろ液を廃棄します。5 milliliterのbinding bufferを添加した後、カラムにキャップをして、再懸濁されるまで反転混和します。キャップを取り外し、カラムを1000 ×gで1分間遠心分離します。この洗浄手順をさらに2回繰り返します。次に、各カラムに1.5 mLの溶出バッファーを加えます。スラリーを手動で混合し、氷上で2分間インキュベートします。最終ステップとして、カラムを新しい50 milliliterコニカルチューブに入れ、1000 ×gで1分間遠心分離します。溶出液を回収し、最終的な合計サンプル量が約3 milliliterになるまで、溶出ステップをもう一度繰り返します。内因性peptolからリボソームをストリップするため、ピューロマイシンによるT-R-N-A-A処理を行います。まず、1 Mの水酸化カリウムを滴下し、100 mMのピューリマイシン溶液をpH 7.5に中和します。室温で操作してください。中和したピューリマイシン溶液を、溶出液中の最終濃度が約1 mMになるように加えます。次に、100 mMのGTPを加え、最終濃度を1 mMにします。この混合物を30 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、4 mL容量のポリカーボネート製超遠心管に、クッションバッファーを1 mL分注します。ピューリマイシン処理済みの溶出分画をクッションの上に静かに重ね、サンプルを100,000 ×gで一晩遠心分離します。上清を吸引した後、精製リボソームを含むペレットを1 mLのクッションバッファーで洗浄します。さらに1 mLのクッションバッファーを用いて、この洗浄を繰り返します。次に、ガラス棒を用いて緩やかに分散させ、リボソームを100 µLのクッションバッファーに懸濁させます。続いて、チューブにパラフィルムで蓋をし、コールドルーム内のボルテックスミキサーで中速で振盪します。1時間の振盪後、内容物をマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで最大速度にて5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。超遠心管に入れた2 mLのクッションバッファーの上に上清を重層し、100,000 ×gで一晩遠心分離します。翌日、遠心機ローターからチューブを取り出し、上清を吸引して除去します。上述した方法を用いて、ペレットを洗浄し、保存バッファーでリボソームを再懸濁します。最後に、精製したリボソームを分光光度計で定量し、-80 °Cで保存します。ここでは、全細胞溶解物、sulfolink、精製リボソーム、およびピューロマイシン処理後にグリセロールクッションで沈降させたsufulink精製リボソームを含む、プロトコルの3つの主要ステップから抽出したRNA種の例を示しています。RNAサイズマーカーも表示されており、当社のRNAは全細胞溶解物中に存在する主要な種です。これらには、他にも多数のRNA種が含まれています。sulfa linkカラムから精製されたリボソームには、カラム担体とこれらの種の親和性が高いため、大量のtRNAが含まれています。この画分をピロマイシンで処理すると、peptol tRNAからのペプチドの加水分解が起こり、これらの種のリボソームからの解離が促進されます。ピロマイシン処理済みのサンプルには共精製されたtRNA種が含まれていないため、完全に純粋なリボソームとなります。既報の通り、これらのリボソームは非常に完全性が高く、生化学的に活性であるため、詳細な機能的および構造的解析のための理想的な基質となります。本手順に続き、リボソームへのリガンド結合をモニタリングするアッセイや構造解析などの他の手法を用いることで、真核生物リボソームの生化学的および生物物理学的特性はどのようなものであるか、といったさらなる疑問を解消することが可能です。

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JoVE Journal

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生物学

我々は、酵母からのミトコンドリアの精製のための迅速かつ効果的な方法を説明します...

酵母細胞からミトコンドリアの精製

この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。...

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

出典: Becker, B., 他リシン毒素A連鎖(RTA)輸送に必要な細胞成分を特定するための簡易蛍光基レポーターアッセイ。 J. Vis. Exp.

 組換え細菌タンパク質の精製のための親和性クロマトグラフィー技術

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。...

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。...

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric...

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

ここでは、酵母におけるSNX-BARヘテロダイマーの発現、精製及びリポソーム結合のワークフローを提示する。...

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

標準的な実験装置を用いて組換え純粋な無細胞TX-TLシステムを製造するための迅速かつ費用対効果の高い方法を提示します。...

ワンポット純粋な無細胞システム

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

このプロトコルは出芽のイースト、Saccharomycesのcerevisiaeからの原産のchromatinの文脈の興味の単一コピー遺伝子座を浄化するために場所特定の組換えに基づいて位置特定のchromatinの隔離方法を示す。...

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

学ぶ酵母リボソームのクロマトグラフィー精製法。SulfoLinkカラムとプルマイシン処理により、核酸分解酵素やプロテアーゼから高純度に分離し、生化学・構造生物学研究に有用な高活性リボソームを調製する手法です。

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

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