パーキンソン病の単方向、病変6-OHDAモデルマウスの開発

本手順の目的は、パーキンソン病のマウスモデルを作製することです。まず手術に使用する薬剤を準備し、次に手術器具をセットアップします。その後、片側性の6-ヒドロキシドパミン欠損手術を行い、適切な術後ケアを実施します。

6匹の6-ヒドロキシドパミン処理を施した動物を行動実験に使用できます。最終的に、結果として内側前脳束において片側性で95%以上のドパミン枯渇が示されます。この手順において特に注意すべき重要な点は、まず、動物の生存を確実にするための適切な術後管理です。

次に、6-ヒドロキシドーパミンの注入に向けた器具の準備を行い、神経毒が完全に投与されるようにします。まず、手術器具をオートクレーブで滅菌します。次に、すべての表面と器具をイソプロピルアルコールで清浄します。

次に、底面にペーパータオルを敷いたマウス回復用ケージを用意し、術後の準備をします。ケージを加熱ランプの下または加熱パッドの上に配置し、麻酔用トロリーをセットアップします。酸素の流入が接続され、バルブが開いていること、およびイソフルランのリザーバーが完全に満たされていることを確認してください。

その後、酸素流量を1%、イソフルランを2～4%に設定します。次のステップは、注入装置を組み立てることです。PEEKチューブの片側にRN金属ナットを1つねじ込み、続いてPEEKカップフェルールを取り付けます。次に、円錐形PFAフェルールを取り付け、円錐形PFAフェルールの円錐部分がPEEKカップフェルールの嵌合部に滑り込むようにフェルールの向きを調整します。

次に、接合したピークカップと標準的なPFAフェルールをデュアル・スモールハブRNカプラーの両端に配置し、デュアル・スモールハブRNカプラーの反対側にあるRNメタルナットを締めます。33ゲージの注入針を挿入します。針をRNメタルナットの一方に通し、ナットを締めます。

33ゲージの針が、デュアルスモールハブRNカプラーに対して180度の角度になっていることを確認します。次に、ピークチューブの反対端にRNメタルナットを1つねじ込み、続いてピークカップフェルールを取り付けます。その後、標準的なPFAフェルールを2つ目のデュアルスモールハブRNカプラーの深い方の溝に挿入し、RNメタルナットを締めて接続を固定します。

次に、2つ目の小型デュアルRNハブカプラーの反対端に、小型ハブRNアダプターへのルアーを挿入し、ルアーのRNメタルナットを締めて接続を固定します。これで注入装置のセットアップは完了です。次の準備ステップとして、注入装置のプライミングを行います。

まず、250 µLおよび1 µLのHamiltonシリンジに滅菌水を満たします。気泡が入っていないことを確認してください。次に、250 µLシリンジをルアーアダプターに取り付け、250 µLシリンジのプランジャーを押し下げて、チューブの反対端にある33ゲージの注入針から水が出るようにします。

250 µLシリンジをルアーアダプターから引き抜きながら、システムに水を流し続けます。ルアーアダプターの先端に小さな水滴を残した状態で、1 µLシリンジのプランジャーを押し、小さな水滴が排出されるまで操作します。次に、1 µLシリンジをルアーアダプターに慎重に挿入します。

1 µLシリンジ上の水滴がルアーアダプター上の水滴と接触していることを確認します。次に、1 µLシリンジをルアーアダプターに完全に挿入し、小型デュアルRNハブカプラー内に気泡がないことを確認してください。その後、灌流装置を脳立体定位固定装置に固定し、輸液ポンプを用いて、33ゲージ注射針を備えた小型デュアルRNハブカプラーを脳立体定位固定装置のマニピュレーターアームに固定します。

次に、1 µLシリンジを灌流ポンプに固定します。その後、操作の30分前に、注入速度を0.1 µL/minに設定して注入ポンプをプログラムします。動物を計量し、その体重を記録します。

マウスに、2.5 mg/mLの塩酸ドーパミンと0.5 mg/mLの塩酸パルリンの混合液を10 mL/kgで腹腔内投与します。次に、手術中に動物の体温を維持するため、および定位固定装置のイヤーバーおよび切歯バーに適合する最適な高さに動物を保持するため、イヤーバーと切歯バーの下に温熱ディスクを配置します。塩酸ドーパミンと塩酸パルリンの混合液を投与した後、15分間待機します。

マウスを密閉された痙攣誘発チャンバーに入れます。イソフルラン吸入により動物を麻酔します。後肢のピンチ刺激に反応しなくなり、瞬目反射が消失した時点で、動物は十分に麻酔されたことになります。

次に、マウスの頭頂部を剃毛します。この時点で、マウスを脳定位固定装置にセットします。切歯バーを口に当て、麻酔マスクを顔に被せます。

次に、イソフルランの流量を調整します。脱脂綿を用いて、局所麻酔薬のリドカインを皮膚に直接塗布します。切歯バーと耳カップを調整し、頭蓋骨の頂点を水平にします。

次に、ベタジン溶液で皮膚を滅菌します。続いて、イヤカップを挿入します。頭部が完全に平らになり、どちらの方向にも動かなくなった状態で、イヤカップが正しく挿入されたことになります。

その後、メスを用いて頭部の中線に沿って切開し、皮膚を剥離します。ガーゼパッドを使用して頭蓋骨の表面を乾燥させます。1 µLシリンジのプランジャーを押し下げ、33Gの注射針を15 mg/mLの1 mLチューブに挿入します。

アルミホイルで覆った6-ヒドロキシドパミン溶液。33ゲージの注射針を6-ヒドロキシドパミン溶液に浸したまま、プランジャーをゆっくりと引き戻します。次に、注射針の先端をB bgmaに向けて進め、少量の6-ヒドロキシドパミン溶液を分注して、小さな液滴を形成させます。

その後、注入針の先端をゆっくりと下ろします。ビーズがbgmaに触れたら、針の進行を止めてこれらの座標を記録してください。注入針を背側方向に2mm後退させ、正中縫合に沿ってLambda方向の吻側へ移動させます。

Lambdaの直上に達したとき、注入針から少量の6-hydroxy dopamine溶液を分注し、小さな液滴を形成させます。次に、針先をゆっくりとLambdaに向かって下げます。液滴がLambdaに接触した時点で針の下降を止め、その座標を記録します。

BMAとLambdaの正中・外側および背側・腹側の座標は一致している必要があります。一致していない場合は、切歯バーを適切に調整してください。前後方向の座標および正中・外側座標のための耳バーについては、針を注入座標まで移動させてください。

AP -1.2 mm、ML -1.1 mmの相対的な位置において、注入針から少量の溶液を分注し、小さな液滴を形成します。その液滴を頭蓋骨の上に落とし、穿孔位置をマークします。その後、針を後退させ、25ゲージの針を用いて頭蓋骨に穴を開けます。

注入針を注入座標に戻し、背腹方向に沿って-5 mmまで刺入します。次に、6-hydroxy dopamineまたは溶媒0.2 µLを、0.1 µL/minの速度で正中前脳束に片側的に注入します。6-hydroxy dopamineまたは溶媒の投与完了後、注入部位からの拡散を促すため、針をそのまま5分間留置します。

その後、ゆっくりと針を抜き、頭皮の切開部を3箇所の縫合で閉じた後、乳酸リンゲル液 1 mLを皮下に投与します。最後に、動物をステレオタキシックフレームから取り出し、意識が回復するまで回復ケージに入れます。6-ヒドロキシドパミン病変手術から15〜21日後。

神経毒による細胞死が完了した時点で、6-ヒドロキシドパミンによる病変作成の成功度を評価するために、自発的な360度回転を測定できます。この行動評価において、6-ヒドロキシドパミン誘発によるドパミン減少率が95%以上のマウスは、部分的な6-ヒドロキシドパミン病変を持つマウスや偽手術群のマウスよりも、有意に多くの同側性（ipsilateral）回転を示します。各個体におけるSALドパミンレベルと自発的な同側性回転の割合を相関させることで、6-ヒドロキシドパミン病変により70%以上の同側性回転を示したマウスは、Salドパミンが95%以上消失していることが分かります。

このビデオを視聴することで、マウスにおいて立体定位的に、かつ灌流制御下で6-ヒドロキシドパミン病変を効果的に作成する方法を十分に理解できるはずです。これにより、95%以上のレベルでドパミン枯渇が誘導されます。また、マウスにおけるパーキンソン症の行動評価の方法についても理解を深めることができます。