Name: リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶ リグノセルロース系材料のハイスループット糖化アッセイ手法。自動化プラットフォームを用いて植物バイオマスの糖化能を迅速に評価し、バイオ燃料生産向け品種選別に有用な知見を提供します。

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著者らは、セルロース分解酵素の贈り物をViksø -ニールセンを（ノボ）に感謝いたします。この作品は、FP7のリニューアルでとBBSRCプロジェクトBB/G016178とBB/G016194によって賄われていた。

1。サンプルの調製我々は、通常、草本や木本植物のいずれの茎で動作。草本材料の場合、我々は成熟して植物を栽培し、老化が完了すると種子の開発の後に我々は、乾燥茎を収集する。茎は、4 mmのセグメントに切断三粉砕用ボールで2mlバイアルに配置されます。木質材料の場合、サンプルはもちろんの木製のファイルと粗いおがくずに粉砕され、その後、さらなる処理のためにボールミルに投入。 試料は、粉砕/フォーマットするステーション（図1）内のラックに配置されます。この駅には順次、ミックスを磨く、および各サンプルの重量を量る。サンプルごとに必要な繰り返し回数が一定の粒​​子サイズのための本質的なばらつきが決定される予備的な一連の実験における地盤材料をテストすることによって確立されます。 2 mLバイアルは、下部に穴を開けていると材料が選択さをはるかに越えてバイアルの振動によって分配される。振動腕は粉体の正確な分注を可能にするバランスからのフィードバックによって制御されます。ロボットは、標準的な分析で4 mgの/ウェルと4回の繰り返しがほとんどのケースで必要とされる分注します。これは、20植物サンプル/プレートを分析することができます。 2。前処理サンプルがフォーマットされると、96ウェルプレートは、自動液体ハンドリングシステム（図2）によって処理されます。ここでは軽度の前処理は、酸またはアルカリ溶液350μLを追加し、適応ブロック上にプレートを加熱することにより、植物材料に実行されます。分析中に蒸発を避けるために、96ウェルプレートは、シリコンマットで密封されています。前処理の温度及び時間は、調査される材料に応じて変更することができます。最高温度は、しかしながら、100℃です。厳しい前処理をテストするための代替手順は、オフラインの材料を前処理し、プロセスからpretreatmetを排除することです。 3。加水分解<ol><li>材料を前処理したら、ロボットは自動的に前処理溶液、850μLの25 mM酢酸緩衝液で洗浄、すべてのウェル、5回を削除します。すすぎは、前処理溶液にバッファを追加し、続いてサンプル中の固形物を沈降させた後、総容積の50％を除去することによって行われている。吸引の高さは、井戸の底から固形物を吸引避けるために、液体の質量の半分に設定され、このアプローチを使用して固形物のごくわずかの損失があります。これらは洗浄後ものpHは4.5であり、材料は、酵素加水分解のための準備ができています。 </li><li>セルラーゼおよびヘミセルラーゼのソリューションを含む酵素混合物はロボットによって追加されます。各ウェルに、酵素の混合物の850μL分注し、プレートを50℃の振盪インキュベーターに移動​​されます。標準的な加水分解は、8時間のために実行されますが、この時間は、実験の目的に適合させることができる。草のために使用される標準的な酵素の負荷は、材料の7 FPU / gである。 </li></ol> 4。還元糖の検出加水分解後にリリースされた還元糖の定量は、修正された3 -メチル-2 -ベンゾチアゾリノンhydrozone（MTBH）方法3を用いて行った。それは自動化するための最も簡単で、タンパク質などの化合物からの干渉に少なくとも影響を受けていたためMBTHは、最​​も適切な方法として選択されまし​​た。我々は標準的な光学96ウェルプレートに適している250μLの最終体積で、それは正確にバイオマスの加水分解物中に存在する濃度で糖を定量化することができるように、ロボットプラットフォーム上で使用できるように、この高感度の方法を変更。以下のすべてのステップが自動的に実行され、還元糖の3つの独立した決定は、それぞれの糖化反応のために実施した。 <ol><li>加水分解物の30μlをディープウェルプレートから採取し、スカートPCRを96ウェルプレートの25 mM酢酸ナトリウム緩衝液の45μLと混合した。 </li><li> 1N NaOHを25μL、0.43 mg / mlのMBTH、0.14 mg / mlのDTTを含む溶液50μlを加えた。 </li><li>混合した後、PCRプレートは60℃に加熱させたすべての96ウェルに熱の正確に同じ量を提供クラーまたは類似の装置で20分間。 </li><li>得られた反応は、光学プレートに移した。 </li><li>酸化試薬（0.2％FeNH4（SO4）2、0.2％スルファミン酸と0.1％塩酸）100μLを加える。よく混和して、少なくとも1時間の開発を残す</li><li> 各プレートはまた、50 nmolの、100 nmolの、150 nmolのグルコースの標準的な反応が含まれている必要があります。光学プレートは620nmで読み取られます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 分析の様々なタイプの例を図3および4に示されている。すべての結果は、自動化されたプラットフォームを用いて得られた。図3再セルロース分解酵素の量が増加すると地上のポプラから8時間のインキュベーションによって解放還元糖の増加を示す。図4は、酸とポプラの試料のアルカリ前処理の効果を示す。 NaOHの前処理は、加水分解中の糖の放出を容易に希釈H2SO4前その方が効率的です。加水分解後に測定糖の量は、前処理が1M以上の水酸化ナトリウムの濃度を使用して実行されたときに減少します。 <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1研削とバイオマスの96ウェルフォーマットのためのロボットステーション<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> ハイスループットの糖化の分析については、 図2。液体ハンドリングステーション<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ポプラのサンプルから糖当量を減らすのリリースで異なる酵素負荷量の影響<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 酸の前処理に比べ、同じ温度と時間でのNaOH前処理の後にリリース90でH 2 SO 4の異なる割合でpretreament℃で30分間後にリリースされた図4。ポプラの試料の糖化に関するさまざまな前処理の効果。A.糖。B.糖 。

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

標準的な糖化プロトコルのバリエーションを同一プラットフォーム内で使用することで、セルロース分解酵素の活性測定（例：プレート内で使用する酵素濃度の変更や、基質として紙を使用する場合など）、特定の材料に対する複数の酵素混合物の効率比較、糖化の時間経過などの解析が可能です。
異なる植物材料における糖化能を比較するための標準的な糖化プロトコルでは、8時間の加水分解を行います（図3および図4）。分析した植物材料のほとんどで4回の反復実験が必要です。これらの条件下で、本プラットフォームは1日あたり80サンプルの処理が可能です。この分析は、大麦、トウモロコシ、およびブラキポディウムの大量の個体群をスクリーニングし、糖化能の変動性とそれを決定に関与する遺伝子を特定するために用いられています4。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>ロボットを研削＆計量</td><td> Labmanオートメーション</td><td></td></tr><tr><td>キャップ2 mlマイクロチューブ</td><td>ザルスタット株式会社</td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5ミリメートルステンレススチール製ビーズ</td><td>キアゲン株式会社</td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ミリリットルAbgene井戸ストレージプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> TUL - 050 - 050C </td></tr><tr><td> 96正方形ウェルプレート用ワットマンキャップマット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td>液体韓陵のロボット</td><td>テカングループ株式会社</td><td>自由エボ200 </td></tr><tr><td> Sulphuric酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> BPE359 - 500 </td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S8750 - 500G </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96ウェルPCRフルスカートプレート</td><td>ザルスタット株式会社</td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3 - メチル-2 - ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 129739 - 25G </td></tr><tr><td> DL -ジチオスレイトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9163 - 1G </td></tr><tr><td>コー​​ニングマイクロプレート96ウェル平底</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> TKT - 521 - 050H </td></tr><tr><td>アンモニウム鉄（III）硫酸塩和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F1668 - 250G </td></tr><tr><td>スルファミン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 242772 - 500G </td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

植物リグノセルロース系バイオマスを構成する多糖類は、その後、バイオリファイナリーの確立に使用することができる糖の範囲を生成するために分解することができます。これらの原料が化石燃料の現在の依存関係を置き換えるために、持続可能でカーボンニュートラルでもある新たな産業プラットフォームを、構成するであろう。リグノセルロース系材料で観察された解体への反抗は、植物細胞壁のいくつかの固有の特性によって生成されます。結晶セルロースは、xylansとarabinoxylansとしてマトリックスの多糖類に埋め込 ​​まれており、全体の構造は、1を消化することも困難であるフェノール系ポリマーリグニン、によって包み込まれているさ。我々は糖化2のばらつきを評価するための主な細胞壁の糖化のためのボトルネックとも画面の変異と繁殖個体群を発見するために必要な植物材料の消化率を向上させるために。これらのタスクは、高スループットのアプローチを必要とし、ここでは、96ウェルプレートフォーマットで糖化分析を実行できる分析プラットフォームを提示する。このプラットフォームは、多様な植物種からの大集団のリグノセルロースの消化率のスクリーニングを可能にするために開発されています。我々は、大規模な数値が自動化されたシステムで迅速に評価できるようにする、穏やかな前処理、部分的酵素加水分解と糖測定のための反応容量を縮小している。 この自動化されたプラットフォームでは、再現可能な方法で標準化された粒子サイズに植物材料を減らすために制御された条件下でボールミル粉砕を行う、バイオマスのミリグラム量で動作します。サンプルが地面になったら、自動化されたフォーマットのロボットは、96ディープウェルプレート（図1）の対応するウェルに物質の指定と記録された金額を分配する。通常は、我々は4が分析のために複製持つように4ウェルに同一の材料を分注する。プレートを、所望のレイアウトで植物の物質で満たされると、それらは手動で液体ハンドリングステーション（図2）に移動されます。このステーションではサンプルは希酸またはアルカリのどちらかで軽度の前処理に供されると90℃までの温度でインキュベートし前処理溶液は、その後削除され、サンプルは、加水分解に適したpHに戻すためのバッファで洗浄されています。次いで、試料を50時間の可変長のための酵素混合℃でインキュベートする。アリコートを加水分解物から取得され、還元糖は、自動的にMBTH比色法によって決定されます。

植物バイオマスの大量のサンプルの糖化性を決定するためのシンプルな、迅速な方法が記載されている。この分析のための自動化されたプラットフォームは、96ウェルプレートおよび放出糖の前処理、加水分解と定量化のその後のパフォーマンスの分析のための植物バイオマスの準備を行います。

植物のリグノセルロース系バイオマスを構成する多糖類は、分解してさまざまな糖を生成することができ、これらはその後、...の確立に利用することが可能です。

こんにちは、私はKara Tedです。私はLeoです。よろしくお願いします。そして、私はSimon McQueen Masonです。植物バイオマスの消化性は、現在非常に高い関心を集めているテーマです。これは、バイオマスを構成する植物細胞壁の多糖類に多くの糖が結合しており、これらの糖を利用可能な形態で抽出できれば、発酵させて燃料や化学物質など、あらゆる種類の製品を製造できるためです。残念ながら、これらの物質は極めて消化しにくいため、どのような要因がその消化性を制御しているのかをより深く理解することが急務となっています。再生可能グループの生産に植物材料を利用するためには、これらの植物における糖化能を測定できる必要があります。そのため、ここヨーク大学では、植物材料の大部分をスクリーニングし、その糖化能を判定しています。糖化とは、複雑な炭水化物を単糖成分に分解し、さまざまな工業プロセスを通じて有用な化学物質を生産するプロセスのことです。糖化能を測定するため、バイオマスに前処理と酵素加水分解を施して放出される糖を決定するという工業プロセスをマイクロスケールで再現します。これにより、遺伝子型における興味深い品種を特定します。このハイスループットシステムは、IG 6ウェルプレート形式で動作します。ジェノタイプ間のわずかな違いを明らかにするために穏やかな条件での加水分解が行われ、この手法は異なる基質材料への対応や、さまざまな酵素の評価が可能な十分な柔軟性を備えています。本手法では、植物材料を粉末状に成形し、希酸または希アルカリを用いて90°Cで20分間前処理します。次に、市販のセルラーゼ混合物を用いて、50°Cで8時間の酵素消化を行います。最後に、還元糖の放出量を決定するためにMBTH法を用います。植物材料を乾燥した茎として採取し、4 mmのセグメントに切断します。これらを、直径5 mmの金属ボール3個とともに2 mLバイアルに入れます。バイアルには個別にバーコードのラベルが貼付されており、これをスキャンすることでサンプルのトレーサビリティを確保します。サンプルは、ロボット内の粉砕およびフォーマット用ロボットにロードされます。サンプルは自動的に粉砕・混合され、バイオマスを96ウェルプレートに分注することが可能になります。バイアルに穴を開け、次にバイアルをロボットアームで再配置して、粉末を分注するための振動ホッパーの中にセットします。ホッパーの振動は天秤によって制御され、1ウェルあたりに分注される目標質量を達成します。バイオマスはプレートの10列に分注し、残りの2列を標準試料用として空けておきます。1サンプルにつき4回繰り返し測定を行うことで、1プレートあたり20サンプルをロードします。このプレートの加水分解物をPCRプレートに3等分して分注し、3枚の光学プレートを作成します。これにより、バイオマスのウェルあたり3回の還元糖の定量が行われます。フォーマット後、蒸発を防ぐためにプレートをシリコンマットで密封します。準備が整い次第、リキッドハンドリングロボットへ移送します。このリキッドハンドリングロボットにより、前処理、酵素加水分解、および遊離糖の定量が自動的に行われます。2メートルのテーブルには、必要な各試薬の容器とプラスチックウェアの保管スペースが備わっています。前処理および加水分解用のインキュベーターと、糖定量用のサーマルサイクラーが設置されています。前処理はディープウェルプレートを用いて行います。希釈した酸またはアルカリ溶液をバイオマス粉末に添加します。プレートをヒーティングブロックに移し、90 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、500 µLの酢酸バッファーで5回洗浄し、前処理液を除去します。前処理後、洗浄を行い、酵素カクテルを添加します。これは標準的な混合液であり、セルラーゼとNovozyme 188を4:1の比率で含み、ウェルあたりの濃度は7 FPUとなります。プレートを50 °Cで8時間、振盪しながらインキュベートします。得られた加水分解液75 µLをPCRプレートに移します。PCRプレートの11列目と12列目に、グルコース標準液を添加します。次に、すべてのウェルに1 Mの水酸化ナトリウムを25 µLずつ加えます。最後に、PCRプレートにMBTH試薬を50 µLずつピペットで分注します。加水分解物を3枚目のPCRプレートに移し終えた後、ディープウェルプレートを保存します。一方、PCRプレートをサーマルサイクラーに移し、60 °Cで15分間インキュベートします。プロセスの最終ステップは、呈色させるために反応混合液を光学プレートへ移すことです。インキュベーション後、PCRプレートをサーマルサイクラーから取り出します。100 µLの酸化剤を転送した反応混合液に加えます。発色を促進させるため、リキッドハンドリングプロセスを24時間以内に4回行います。このうち、前処理のリンスと酵素の添加に約2時間、酵素による加水分解に8時間、そして糖の定量にさらに2時間を要します。最初のプレートを8時間インキュベートしている間に、次のプレートの処理を開始します。このようにロボットのリソースを割り当てることで、1日あたり80サンプルの3スループットを実現し、放出される還元糖の量を測定します。光学プレートの測定波長は620 nmに設定されています。得られた結果を解析し、放出された糖の量を、反応1時間あたりのミリグラムあたりのナノモルとして定量します。ご視聴ありがとうございました。本動画がバイオ燃料の研究の刺激になれば幸いです。

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