リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

こんにちは、私はカラテッド、私はレオです。行け。そして、私はサイモン・マックイーン・メイソンです。

植物バイオマスの消化率は、現在非常に興味深いトピックです。これは、このバイオマスを構成する植物の細胞壁の多糖類にたくさんの糖が結合しているからで、その糖分を使用可能な形で取り出すことができれば、それを発酵させて燃料や化学品など、さまざまな製品を作ることができるからです。残念ながら、これらの材料は消化が非常に難しく、その消化率を制御するものをよりよく理解することは緊急の問題です。

ですから、再生群の生産に植物材料を利用できるようにするためには、これらの植物の化ポテンシャルを測定できる必要があります。そこで、ヨーク大学では、植物材料の大規模な集団をスクリーニングして、そのフィケーションの可能性を決定しています。フィケーションとは、複雑な炭水化物を単糖類の成分に分解し、さまざまな工業プロセスを通じて貴重な化学物質を製造するプロセスです。

フィケーションポテンシャルを測定するために、マイクロスケールレベルで工業プロセスを再現し、バイオマスを前処理と酵素加水分解にかけ、放出される糖を決定します。これにより、遺伝子型の興味深い品種が特定されます。ハイスループットシステムは、IG 6ウェルプレートフォーマットで動作します。

温和な加水分解条件は、遺伝子型間の微妙な違いを明らかにするために使用され、また、異なる基質材料をサポートし、異なる酵素を評価するのに十分な柔軟性も備えています。私たちが使用する方法では、植物材料を粉末としてフォーマットし、それを希釈した酸またはアルカリで90度で20分間前処理します。次に、市販のセルラーゼ混合物を用いて、50度で8時間、酵素消化を行う。

最後に、MBTH法を使用して、還元糖の放出を決定します。植物材料は乾燥した茎として収穫され、4ミリメートルのセグメントにカットされます。これらは、3つの5ミリメートル金属ボールと一緒に2ミリリットルのバイアルに入れられます。

バイアルには個別にバーコードが貼られており、バーコードがスキャンされてサンプルのトレーサビリティが確保されます。サンプルは、ロボット内の研削ロボットとフォーマットロボットにロードされます。サンプルは自動的に粉砕され、混合され、バイオマスを96ウェルプレートに分注することができます。

バイアルに穴を開けると、バイアルはロボットアーム内で再配置され、振動して粉末を分配する漏斗内に収まります。漏斗の振動は、供給されるウェルあたりの質量の目標量を達成するためにバランスによって調整されます。バイオマスはプレートの10列に分注され、標準用に2つの列が残ります。

サンプルごとに4回の繰り返しを行うことで、プレートごとに20個のサンプルをロードします。このプレートの加水分解物は PCR プレートに三重化され、3 つの光学プレートが得られます。このように、バイオマスのウェルあたりの糖を減らすための3つの決定があります。

フォーマットが完了すると、プレートは蒸発を防ぐためにシリコンマットで密封されます。準備ができたら、リキッドハンドリングロボットに移されます。リキッドハンドリングでは、ロボットによる前処理、酵素加水分解、放出された糖類の測定が自動的に行われます。

2メートルのテーブルには、必要なさまざまな試薬用の容器と、プラスチック製品の保管スペースがあります。前処理と加水分解のためのインキュベーター、および糖測定のためのサーモサイクラーがあります。前処理はディープウェルプレートで行われます。

バイオマス粉末に希酸またはアルカリ溶液を添加する。プレートを加熱ブロックに移し、90度で20分間インキュベートします。このインキュベーションが終了したら、500マイクロリットルのアセテートバッファーで5回すすぐことにより、前処理を除去します。

前処理をすすぐと、酵素カクテルが追加されます。標準的な混合物です。セルロース、ノボザイム1、8、8を4対1の比率で含み、ウェルあたり7FPUの濃度として含まれています。

プレートを振とうしながら50度で8時間インキュベートし、得られた加水分解物の75マイクロリットルをPCRプレートに移します。PCRプレートのカラム11および12に、グルコース標準を添加します。

次に、1モルの水酸化ナトリウム25マイクロリットルをすべてのウェルに加えます。最後に、50マイクロリットルのMBTH試薬をPCRプレートにピペットで移します。ディープウェルプレートは、加水分解物の第3のPCRプレートへの移し替えが完了した後に保存されます。

一方、PCRプレートはサーモサイクラーに移され、60度で15分間インキュベートされます。プロセスの最終ステップは、色の現像のために反応混合物を光学プレートに移すことです。インキュベーション後、PCRプレートをサーマルサイクラーから取り出します。

100マイクロリットルの酸化試薬を転写された反応混合物に添加する。発色を容易にするために、リキッドハンドリングプロセスは24時間に4回実行され、前処理リンス、酵素の添加には約2時間かかります。酵素の加水分解には8時間かかり、糖の測定にはさらに2時間かかります。

最初のプレートが8時間インキュベートしている間に、次のプレートがプロセスを開始します。このロボットリソースの割り当てにより、1日あたり80個のサンプルを3回投入し、放出される還元糖の量を決定することができます。光学プレートの定格は620ナノメートルです。

得られた結果を分析して、放出糖を反応時間あたり1ミリグラムあたりのナノモルとして定量化します。だから、見てくれてありがとう、そして私はこれがバイオ燃料のあなたの研究を刺激することを願っています。