Name: 細菌付着の研究ではせん断応力を導入する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学ぶ 細菌付着へのせん断応力効果をフローチャンバーと蛍光顕微鏡を用いて調べる手法。Neisseria meningitidisなどの病原体の感染機構解明に応用可能です。

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著者らは、プロシージャの起動、初期設定のためにエミリーMaireyとエマニュエルDonnadieuに感謝します。

1。ヒト宿主の細胞と細菌培養<ol><li>継代1および5％（v / v）のCO 2の加湿インキュベーター中37℃で9の間の文化HUVECを。継代細胞は使い捨てのフローチャンバー（μ-スライドVI）の75 cm 2の培養フラスコや実験的な文化にメンテナンス文化を提供するために、トリプシン/ EDTAで80％コンフルエントに近づくとき。 </li><li>継代するフラスコから培地を撤回、10mlのPBSで細胞を洗浄、トリプシン/ EDTA 1.5mlでそれを撤回し、交換してください。細胞は37℃で5分間インキュベーター、細胞培養にデタッチすることができます</li><li> 15 mlのコレクションチューブに細胞培養培地の10mlで細胞を集めます。ペレットを室温で5分間の遠心分離（200 gで）、を持つ細胞。遠藤- SFMの4 mlに細胞をサスペンドは、製造業者の指示に従って、10％（v / v）のFBSで補充しMalassez室でそれらを数える。 </li><li>チャネルへミリリットル懸濁液（3 × 4個 ）当たり1 × 10 6 HUVEC細胞30μlを紹介し、細胞が5％の雰囲気で加湿インキュベーター中、37 °（V / V）CO 2で3時間付着することができます。井戸を埋めるために遠藤- SFMの120μlの追加のボリュームを追加します。細胞はサブコンフルエント単層（図2）を形成すべきである。 </li><li> Nを成長するケロッグのサプリメントと37クロラムフェニコールの5μg/ mlを含むGCB寒天プレート上髄膜炎を発現するGFP（IPTG誘導性プロモーターの制御下で、この場合のひずみ8013表現GFPで）、· V / 5％（含む湿った大気中のC V）16時間CO 2。 </li></ol> 2。宿主細胞への個々の細菌の初期付着<ol><li>予め温めておいた遠藤- SFMは、37℃で120分間を10％（v / v）FBSとインキュベートを含む° Cを5％（V /を含む湿った雰囲気の中で、0.05のOD600にGCB寒天プレート上で成長させた細菌の濃度を調整します。 v）を穏やかに振盪（130 rpm）の下でCO 2、。全体の潜伏期間のための培養液中に1mMのIPTGを添加することによりGFPの発現を誘導。 </li><li> 37℃で試料温度を維持するために加熱されたプラットフォームを搭載した倒立顕微鏡℃の舞台上で使い捨てのμ-スライドを配置</li><li>無菌ガラスビーカーに2％（v / v）のFBS添加予め温めておいた遠藤- SFMを注ぎ、この培地で無菌50mlの注射器を埋める。注射器に"エントリ"チューブを接続し、培地を導入することで埋める。 </li><li>チャンバー内に空気を導入避けるために、慎重に、μ-スライドする"エントリ"チューブを接続します。その後、慎重に貼付、もう一方の端に"出口"チューブとはチャンバー"出口"から約1 cmの距離に培地を使用してチャネルを埋める。 </li><li>細菌のOD600を測定し、遠藤- SFMは2％（v / v）のFBSを含むで0.15に調整する。個々の細菌を見るためには、任意の凝集体が細菌サンプルの積極的なボルテックスによって破壊されている必要があります。 </li><li>遠藤- SFMの代わりに100μlのは、タンクに2％（v / v）のFBS培地を補給し、残りの細菌の集合体のサンプリングを避けるためにボルテックスソリューションの上部から採取した菌液100μLを加える。 </li><li>慎重にチャンバー内に細菌を注入するためにコックを回して、μ-スライドに200μlのボリュームをご紹介。 </li><li> 15分間0.044ダイン/ cm 2の密着性と互換性のせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバーに2％（v / v）のFBS、37℃に維持温水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。 </li></ol> ビデオ1または図3の例を参照してください。このステップの後、いずれかのセクション3、4または6に移動します。 3。宿主細胞への個々の細菌の初期付着の定量化<ol><li>液体がまだ循環している間15分間の初期接着した後、ランダムに10個のフィールドの画像を取得する。 </li><li>フィールドあたりのadherant細菌の平均数をアクセスするためには、ImageJのソフトウェア8を 、使用して取得された画像を分析する。これは、次のように行われます：まず第一に、各イメージは、細胞からバックグラウンドを最小限に抑えながら、個々の付着蛍光細菌を強調するために"イメージ"メニューにある"しきい値"ウィンドウを使用して閾値処理される。その後、一つ一つの細菌は、プラグインを使用して、"セルカウンター"（で、カウントされます<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ）。各画像のデータはExcelスプレッドシートで報告され、フィールドごとの付着性細菌の平均数を定量化するために平均化されています。 </li></ol> 4。宿主細胞への付着性、個々の細菌の流れに抵抗の測定<ol><li>プログラムは、シリンジポンプは、5分間3から100ダイン/ cm 2の範囲のせん断応力を生成するために、セットアップ。 </li><li> 5分の終わりには、ステップ3.1で説明したようにランダムに選ばれた10個のフィールドを取得するとして、その流れでPRを停止買収にIOR。 </li><li>ステップ3.2で説明したように取得された画像を分析し、フィールドごとに、残りの細菌の平均数を定量化する。 </li></ol> 5。微小コロニーに分離された付着細菌の成長を測定する<ol><li>数時間のために選ばれたせん断応力とシリンジポンプを用いてチャンバー内に10％（v / v）のFBS、37℃に維持温​​水プラットフォームでCを含む遠藤- SFMをご紹介。一つのフレームでのリアルタイムビデオ顕微鏡のための記録画像は5分ごと。 </li><li>ビデオ顕微鏡に続いて、シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。細菌の増殖の例は、ビデオ2で見ることができます。 </li></ol> 6。付着細菌microcoloniesの流れに抵抗の測定<ol><li>細胞表面上に大規模なmicrocoloniesの形成後（step5.2）フローのアプリケーションの前に2〜3の両方の細胞の画像（位相コントラストによる）と細菌を（GFP蛍光により）取得。実験の残りの部分では、買収のプロトコルは、蛍光のみを監視します。 </li><li> 5秒ごとに一つのフレームで5分（300〜100ダイン/ cm 2）と記録的なイメージのために高いせん断応力を加える。 </li><li>シリンジポンプをオフにすることで、せん断応力を停止、2-3追加の画像を取得し、ソフトウェアでの画像取得シーケンスを停止します。 </li><li>次に、最初の"出口"チューブを外し、慎重に、チャネルを空にしないようにしてから、"エントリ"チューブを取り外す前に、井戸を埋めるために予め温めておいた新鮮な培地を加​​える。 </li><li>定量的に細菌の抵抗でせん断応力の影響を判断するには、メッキのアッセイは次のように実行することができます：残りの培地を収集し、チャネルから、残りの培地を除去する（両方の洗浄があるPBS120μlの、で二回μ-スライドを洗うまた、収集された）。 </li><li> 37℃で5分間トリプシン/ EDTAを50μlを添加して感染細胞を剥離し、前のステップで収集した懸濁液を用いてこの分離されたサンプルを混ぜる。 </li><li> 37プレートのインキュベーション後、翌日の単位（CFU）を形成するコロニーの数を決定するために、PBSとプレート三重のGCB寒天プレート、、上に10μlの割合で希釈系列を行います°のインキュベーターでC 5％（v / v）のCO 2。 </li></ol> 動画3と4はpilV変異体と野生型の菌株を比較する。 7。 microcoloniesからバクテリア分離<ol><li> 2.8手順2.1を繰り返して、フローチャンバーで細胞に感染し、感染は30分間続行することができます。 </li><li> 2分の期間は10ダイン/ cm 2に流量を増加させることにより未結合の細菌を除去し、感染が2時間継続することができます。 </li><li> 0.15ダイン/ cm 2までの流れを減らす。 </li><li>毎時間、フローチャンバーから出てくる培地のドロップを集める。 </li><li> GCB寒天プレート上のサンプルとプレート、それらの段階希釈を行います。 </li><li> 37プレートのインキュベーション後、翌日のコロニー形成単位の数（CFU）、℃インキュベーター内で5％（v / v）のCO 2とを決定する。 </li></ol> 8。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：手続きの流れの存在下で観察して測定できる携帯単分子層のさまざまなステップ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：実験（せん断応力の欠如）の先頭にフローチャンバ内の内皮細胞単層。約50内皮細胞はサブコンフルエント単層で構成されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：細胞表面上の細菌の初期付着のグラフィック表現。 3つのフィールドの値は（0044ダイン/ cm 2）期待されるフィールド間の変動のアイデアを与えることが示されている。 ビデオ1。時間の関数（0044ダイン/ cm 2）のような細胞単層上の細菌の初期付着の可視化。 GFPを発現する細菌が流れる媒体の方向に従っている。フィルムが60倍に加速され、ビデオの実際の持続時間は10分です。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> ビデオは2。初期付着菌後7時間の期間のための細胞の表面（1000倍加速）で増殖させた。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> ビデオ3。増殖後、細胞表面上の整備士microcoloniesのアル抵抗は5分を10ダイン/ cm 2にせん断応力のレベルを増加させることによって試験が野生型のmicrocoloniesは60倍加速耐性がありますした。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> pilV変異体によって形成されたビデオ4。Microcoloniesは、フローの増加（10ダイン/ cm 2）によって破壊されています。この変異体は、microcolonies下の原形質膜のリモデリングを誘導するために失敗し、そのためより多くのずり応力の増加（ビデオは60倍に高速化されている）5に非常に敏感です。 <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

せん断応力のと、一般的に生物学における力学的側面の重要性がますます認識されています。例えば、リンパ球の接着と血管壁に圧延の過程におけるタンパク質のセレクチンファミリーの高度に適応した接着剤の特性は、プロセス内のせん断応力を導入することによって認識されている。上記の手順は、グラム陰性菌のナイセリア髄膜炎菌に適用されたが、病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。せん断応力の重要性は、他の病原体や他の感染部位にも示されている。せん断応力によって条件付け細菌付着は、尿路病原性大腸菌 （UPEC）9日に発見さFimHアドヘシンの研究によって記述されています。セレクチンと同様に、FimHとその宿主細胞の受容体間の相互作用は、せん断誘起の機械的な力9によって強化されることが示されたと毒素原性大腸菌のCfaEアドヘシンは、せん断依存を経由して腸上皮細胞への接着を媒介することも報告されている機構10。我々は、ストレプトコッカスagalactiae毛が流れの条件11の下上皮細胞にこの病原体の付着のために不可欠であることをこの章で説明する層流チャンバーアッセイのプロトコルを使用して、報告した。このような研究は私たちのフローチャンバーアッセイは、せん断応力の条件下で宿主細胞 - 病原体相互作用を調査するための有用なツールであることを確認してください。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> μ-スライドVI 0.4フローキット</td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td>シリンジPlastipak 50ミリリットルルアーロック</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 300865 </td></tr><tr><td>タイゴンチューブR3603 3.2 × 4.8ミリメートル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3方活栓、オスルアーにルアー2メス</td><td> Bio - Rad社</td><td> 7328103 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td>倒立顕微鏡、ニコン</td><td>ニコン</td><td> EclipseのT I </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松市</td><td> ORCA 285 CCDやORCA 3 - CCD </td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td>フリーウェア （ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ） </td></tr></tbody></table>

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌感染の間に相互作用のシーケンスでは、病原体およびそのホストとの間で起こる。宿主の細胞表面への細菌付着がしばしば病因の初期と判断するステップである。実験的に接着が主に静的な条件で検討されていますが、密着性は実際に液体を流れるの存在下で行われます。細菌とその宿主との間の最初の出会いは、多くの粘液は、上皮細胞の表面に沿って流れる粘膜レベル、口、肺、腸、目、などで発生します。後感染症における、病原体は時折そのような敗血症、敗血症や髄膜炎など生命を脅かす病気を引き起こす血液の循環をアクセスする。これらの感染症の決定的な特徴は、血液の循環の存在下で内皮細胞と相互作用するこれらの病原体の能力である。それは病原体に対する機械的な力を生成するので、例えば、液体、粘液や血液を流れるの存在は、密着性を決定する。液体つを流れるの影響を特徴づけるためには、通常ダイン/ cm 2で表される固定壁の近くに移動する流体によって単位面積当たりの行使接線力であるせん断応力の概念、を指します。せん断応力の強度が異なる容器の種類、サイズ、オルガン、場所等（0-100ダイン/ cm 2）に応じて大きく異なります。毛細血管の循環は非常に低いせん断応力の値に到達しても一時的に数分を1に数秒の間の範囲の期間中に停止することができます。細動脈におけるスペクトルのせん断応力のもう一方の端に100ダイン/ cm 2に達することができます。異なる生物学的プロセスでせん断応力の影響が明らかに内皮3白血球の相互作用の中に、インスタンス用として実証されています。細菌付着の過程で考慮に入れて機械的なパラメータを取るように私たちは使い捨てのフローチャンバー4の使用に基づいて、実験手順の利点を取った。宿主細胞は、フローチャンバーで栽培され、蛍光細菌は、シリンジポンプによって制御フローに導入されています。我々は当初、細菌性病原体髄膜炎菌 、敗血症や髄膜炎の責任グラム陰性菌に私たちの調査を集中。セル1に付着し、細胞表面5に増殖すると、新しいサイト6（図1）植民地化するデタッチする：手順は、私たちは細菌の能力へのせん断応力の影響を研究するために許可されてここで説明する。補完的な技術情報は、参考文献7に記載されています。ここで紹介するせん断応力の値は、文献に見られる値を表すために私たちのこれまでの経験1とに基づいて選択されました。プロトコルは、研究の目的に応じて、特定の調整を行っている病原体の広い範囲に適用可能であるべきである。

感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。

細菌感染時には、病原体とその宿主の間で一連の相互作用が起こります。宿主細胞表面への細菌の付着は、しばしば...

このビデオでは、細菌の接着におけるせん断応力の影響を調べるための手順を実演します。Neisseria meningitidisのような細菌性病原体による重度の感染症が発生すると、病原体は血流に到達し、流動する血液による機械的ストレスの下で宿主細胞に付着し、定着します。増殖後、一部の細菌は剥離して新たな部位に定着し、このサイクルが繰り返されます。宿主細胞への細菌の接着に影響を与える要因を研究するため、内皮細胞を使い捨てフローチャンバーに導入し、細胞がコンフルエンスに達するまで培養します。蛍光標識した細菌を添加し、せん断応力を実験的に制御します。シリンジポンプを用いて、細菌の宿主細胞への接着と増殖を顕微鏡で追跡します。得られたビデオを解析し、せん断応力が血管内皮細胞のコロニー形成プロセスに及ぼす影響を判定します。この手順は、髄膜炎の病原性を研究するのに非常に有用ですが、病原過程を通じてせん断応力にさらされる他の細菌にも適用可能です。この手法は、特にシステム内に気泡が混入しやすく、それが問題となるため、実施には少々コツが必要です。そこで本日は、私の研究室の博士課程学生であるMegaが、この手順を実演します。このビデオで説明する実験は、IDI micro slide six 0.4を用いて培養された細胞を使用して行います。これは、長さ17 mm、幅3.8 mm、深さ0.4 mmのチャネルを6本備えた使い捨て滅菌プラスチックスライドです。各チャネルの両端には、細胞を導入するためのルアーアダプター付きアクセスポートが2つあります。各チャネルに、1×10⁶ cells/mLの細胞懸濁液を30 µLピペッティングします。スライド上の細胞を、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で3時間接着させます。インキュベーション後、さらに120 µLのendo SFMを添加します。ウェルを満たすには、約20時間後に細胞がサブコンフルエントな単層を形成する必要があります。その間に、GFP発現Neisseria meningitidisをAPLs上にストリークします。この細菌はヒト病原体です。したがって、この微生物を扱う際は、訓練を受けた人員がガウンと手袋を着用し、バイオセーフティレベル2の施設で操作を行う必要があります。また、使用するセログループに対する人員へのワクチン接種が推奨されます。ここでは、iPTG誘導性プロモーターの制御下でGFPを発現する株 8 0 1 3 を画線培養します。Kelloggサプリメントおよび5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むGC BPL上の細菌を、37 °C、5% CO2インキュベーター内で16時間培養します。哺乳類細胞の培養が確立されたら、チャネル内の宿主細胞に細菌を添加します。フローアッセイの準備として、白金耳を用いてペトリ皿から細菌を回収し、予熱したサプリメント添加内皮細胞培養液 containing 50 mLコニカルチューブに移します。Medium Endo SFMを使用します。サンプルを同培地で希釈して最終的に5 mLとし、光学密度をOD 600で0.05に調整します。GFP発現を誘導するため、最終濃度が1 mMとなるようにIPTGを添加し、培養物を120分間インキュベートします。加湿された37 °C、5% CO2のインキュベーター内で、緩やかに振盪させながら保持します。あらかじめ準備した内皮細胞を培養したマイクロスライドを、サンプル温度を37 °Cに維持するための加熱ステージを備えた倒立顕微鏡のステージ上に設置します。2% FBSを添加し、あらかじめ温めておいたendo SFMを滅菌済みのガラスビーカーに注ぎ、プランジャーを引いて50 mLシリンジに満たします。流入チューブを三方活栓に接続します。次に、流入チューブをシリンジに取り付け、プランジャーを押し込んでチューブ内を培地で満たします。流入チューブのもう一方の端を、付属の直角コネクタを用いてマイクロスライドに慎重に接続します。チャンバー内に空気が混入しないように注意してください。シリンジをポンプにセットし、次に、リザーバーとして、カットした1 mLシリンジをストップコックの空きスロットに配置します。その後、出口チューブをチャネルのもう一方の端に取り付け、シリンジプランジャーを押し、チャンバー出口から約1 cmの距離まで慎重に培地でチャネルを満たします。細菌のOD 600を測定し、前述のとおり2%FBSを含むendo SFMを用いて0.15に調整します。その後、サンプルを激しくボルテックスし、細菌の凝集体を分散させます。次に、使い捨てプラスチック製パステールピペットを用いて、2%FBSを添加したendo SFMを100 µLリザーバーに移します。続いて、ボルテックスした溶液の上層から細菌溶液を100 µL吸い取り、リザーバーに加えます。ストップコックを慎重に回し、制御されたせん断応力レベルの下で接着が進むように、細菌をマイクロスライドのチャンバー内に注入します。シリンジポンプを用いて、2% FBSを含むendo SFMを3.5 milliliters per hourの速度で15分間チャンバーに導入します。このビデオは60倍速で再生されています。実際の所要時間は10分です。このステップの後、さまざまな条件下での細菌の宿主細胞への付着および脱離を評価できます。詳細は本ビデオの以降のセクションで説明します。個々の細菌の宿主細胞への初期付着を定量化するには、液体が循環したまま15分間のフローを行った後に画像取得を開始し、ランダムに10つの視野の画像を撮影して、1視野あたりの平均付着細菌数を決定します。まず、ImageJソフトウェアを起動し、解析する画像を開きます。「Image」メニューをクリックし、「Adjust」から「Brightness/Contrast」を選択します。カーソルを移動させて輝度レベルを調整し、背景に対する個々の付着蛍光細菌の可視化を最適化します。次に、プラグインの「Analyze Cells」メニューから「Counter」を選択します。セルカウンターツールを開き、画像を初期化した後、オブジェクトのタイプを選択し、個々の細菌をそれぞれクリックしてください。ウィンドウに細菌の総数が表示されます。最後に、各画像のデータをExcelにエクスポートし、平均値を算出することで、1視野あたりの付着細菌の平均数を定量化し、個々の付着細菌の流れに対する耐性を測定します。最初の15分間のフロープログラムの後、シリンジポンプを用いて、3から100 dynes/cm²の範囲のせん断応力を5分間発生させるように設定します。5分が経過したら、フローを停止し、前述と同様にランダムに10視野を採取・解析して、1視野あたりの生存細菌数の平均値を決定します。最初の15分間のフローの後、シリンジポンプを選択したせん断応力に調整します。その後、5分に1フレームの割合で画像を記録しながら、数時間フローを継続させます。顕微鏡に電動XYステージが搭載されている場合は、理想的にいくつかの箇所を追跡させることができます。ビデオ顕微鏡観察後、シリンジポンプを停止してせん断応力を停止させます。すぐに2〜3枚の追加画像を撮影し、その後、ソフトウェア上で画像取得シーケンスを停止します。細菌増殖の例をこちらで確認できます。最後に、画像を解析するために、ImageJの「Image」→「Adjust」→「Threshold」メニューを使用して画像を二値化します。次に、「Analyze」メニューの「Set Measurements」で、面積（area）の測定を選択してください。次に、粒子解析（analyze particle）ツールを使用して、コロニーのサイズを自動的に決定します。この時点で流れが維持されているかどうかにかかわらず、5〜7時間後に細胞表面に大きなマイクロコロニーが形成されます。まず、マイクロコロニーの流れに対する耐性を測定するために、位相差による細胞の画像とGFP蛍光による細菌の画像を、それぞれ2〜3枚取得します。5分間高せん断応力を加え、5秒に1フレームの割合で蛍光画像を取得します。シリンジポンプの電源を切ってせん断応力を停止させます。さらに2〜3枚の画像を取得した後、ソフトウェア上の画像取得シーケンスを停止し、播種アッセイ用の培地を回収します。まず、チャネル内が空にならないように注意しながら、出口チューブを取り除きます。あらかじめ温めておいた新鮮な培地を加え、ウェルを満たします。次に、入口チューブを取り除き、残っている培地をマイクロピペットで回収して、マイクロ遠心チューブに移します。チャネル内に残った培地を完全に取り除くため、120 µLのPBSをチャネルに2回加えて、マイクロスライドを洗浄します。スライドを2回傾けて培地を除去します。感染細胞を回収するため、マイクロスライドに 50 µL のトリプシンEDTAを加え、37 °Cで5分間インキュベートしてチャネルから細胞を剥離させ、この剥離したサンプルを前段階で回収した懸濁液と混合します。PBSで段階希釈を行った後、10 µL ずつをGCB寒天プレートに分注し、37 °C、5% CO2条件下で一晩、3連でインキュベートします。翌日、コロニー形成単位（CFU）を測定し、マイクロコロニーからの細菌の脱離を評価します。前述と同様に、低流速 3.5 milliliters per hour でフローチャンバー内の細胞に感染させ、30分後、流速を 5 milliliters per minute に上げて2分間維持し、未結合の細菌を除去します。その後、再び低流速 3.5 milliliters per hour に戻し、感染を2時間継続させます。その後、4時間にわたり、1時間ごとにフローチャンバーから流出する培地を1滴、マイクロ遠心チューブに回収します。すべてのサンプルの回収が完了したら、前述と同様にコロニー形成単位数を決定します。これは、細胞表面への細菌の初期接着をグラフで表したものです。グラフの各線は、特定の視野内で結合した細菌の累積数を時間の関数として表しています。細胞表面での増殖後に予想されるフィールド間のばらつきを示すため、3つのフィールドの値を示しています。マイクロコロニーの機械的耐性は、剪断応力レベルを10 dines per square centimeterまで上げてテストしましたが、野生型のマイクロコロニーは耐性を持つのに対し、pill v変異体によって形成されたマイクロコロニーは、流れの増加によって破壊されます。この変異体は、マイクロコロニー直下の細胞膜の再構築を誘導できないため、発生後の剪断応力の増加に対してより高い感受性を示します。この手法は、感染症分野における他の研究者が、さまざまな病原体と異なる細胞型との相互作用にせん断応力が及ぼす影響を探索する道を開きました。ヒト病原体を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、レベル2またはレベル3の対策などの予防措置を必ず講じてください。

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典:Ditkowski, B. ほか。細菌が移植組織に付着する様子を研究するための平行プレート灌流システムのin vitroモデル。 J. Vis. Exp.

組織生検における細菌の癒着を研究するためのin vitro平行プレートフローモデル

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

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細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

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付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

ここでは、楽器を含め、緑の蛍光蛋白質を表現する緑膿菌バイオ フィルムに対するせん断応力効果の分析のための蛍光顕微鏡と相まって高いスループット マイクロ バイオリアクターの使用について述べるバイオ...

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。...

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

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接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

学ぶ 細菌付着へのせん断応力効果をフローチャンバーと蛍光顕微鏡を用いて調べる手法。Neisseria meningitidisなどの病原体の感染機構解明に応用可能です。

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

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