生体デュアル基質生物発光イメージングにおける

本手順では、Ranルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼの可視化と定量化を行います。in vivoでの正位腫瘍を開発するには、まずRanバニラルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、またはその両方を発現する安定発現細胞株を構築します。その後、安定発現させたリポーター構築物のin vitroにおける制御を機能的に検証します。

次のステップは、細胞を乳腺脂肪パッドに移植し、Renillaルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼの両方の数値を測定および定量することです。免疫組織化学などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、腫瘍の進行および転移におけるin vivoの遺伝子調節を、縦断的かつ動的に観察できることです。まず、vanillaルシフェラーゼをコードする発現ベクターを導入した4つのT1メモリー癌細胞の培養を開始します。

最適化した抗生物質濃度の下で数日間、形質転換体を培養します。次に、ran vanilla luciferaseを発現している単一コロニーを約10個選択し、発現度をモニタリングします。ran vanilla luciferaseを高量に発現しているコロニーをさらに増幅させ、機能解析に使用します。

目的のプロモーター領域を、安定的なバニラ発現の選択に使用したものとは異なる選択マーカーを持つPGL4ルシフェラーゼレポータープラスミドにサブクローニングし、悪性細胞にトランスフェクションして、96ウェルプレートを用いた従来のin vitro細胞ベースのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより、ホタルルシフェラーゼの安定的なポリクローナル集団を選択します。DBR細胞が、一過性トランスフェクションした親細胞で観察されたのと一致する方法でホタルルシフェラーゼの発現を調節していることを確認します。これらのベクターを用いて、細胞をオービタルシェーカーで15分間振とうし、細胞を溶解させます。

また、vanillaのCMV駆動発現が、さまざまな細胞刺激や処理条件によって調節されないことを確認します。計画日の前日に、共蛍光強度の低いDBR転移性4-1記憶癌細胞を増殖させます。in vivo接種のため、トリプシンを用いて4-1細胞を解離させ、接種用の細胞を調製します。

増殖培地で十分に洗浄し、直ちにPBSで細胞を希釈します。氷上で保存してください。4〜6週齢の雌のbowel Cマウスをイソフルランで麻酔します。

ピンセットを使用して、第4鼠径メモリーパッドをそっと掴んで持ち上げます。27.5ゲージの針の鋭利な面（ベベル）を上に向け、乳頭直下のメモリー脂肪パッドに注意深く刺入し、注入します。

針が腹腔内に刺入されないよう十分に注意します。腺を解放し、マウスが麻酔状態にある間に、細胞懸濁液 50 µL を乳腺脂肪体にゆっくりと注入します。次に、側尾静脈に red eject cine 100 µL を注入します。

直ちにマウスをIVIS 200イメージングシステムに設置し、1分間のルミネッセンス画像を撮影します。マウスをケージに戻して約1時間待機させ、残留したランニラ Lucifer 信号が消失したことを確認します。その後、D Lucifer カリウム塩を腹腔内投与し、5分後にイソフルランを用いてマウスを麻酔します。

元のRANバニラ画像取得時と同様の位置にIVUS 200へ移送します。フォトンのモードに設定したIVUSリビングイメージソフトウェアを使用します。Firefly取得と合わせて両方の値を設定してください。

極めて侵襲性の高い41細胞は、1週間以内に触知可能な腫瘍を形成します。そのため、毎週マウスにred eject cineを注入し、腫瘍全体の増大および転移をモニタリングします。その後、d Luciferを注入し、腫瘍発生のさまざまな段階における経路特異的なシグナリングをモニタリングします。

腫瘍細胞の接種時における初回測定値でRANルシフェラーゼの取得値を正規化することにより、原発腫瘍の増殖を追跡します。さらに重要な点として、経時的なRLR値を算出し、腫瘍の増殖および進行に対する個々のシグナル伝達系の時間的調節を明らかにします。次に、肺のRLR値と原発腫瘍で算出された値を比較し、腫瘍の増殖および転移に対する個々のシグナル伝達系の空間的調節を明らかにします。

原発腫瘍内の細胞組成の変化を可視化し追跡するために、デュアルバイオルミネッセンスイメージングを用います。まず、バニラルシフェラーゼを発現する4T1細胞と、非転移性でアイソジェニックなホタルルシフェラーゼ発現4T07細胞を混合し、前述のように、これらの混合乳がん細胞集団をさまざまな比率で乳腺脂肪組織に注入します。その後すぐに、ホタルルシフェラーゼとバニラルシフェラーゼの両方の画像を撮影し、注入した細胞混合物に対応する初期RSを確立します。

原発腫瘍内の細胞組成を描出するため、縦断的なデュアルバイオルミネッセンスイメージングを継続的に実施します。また、腫瘍の増殖および進行に関連して、各乳がん派生細胞の時空間的な転移を評価します。各画像は内部的に一貫しており、コントロールされているため、原発腫瘍からの持続的なシグナルは、それぞれのバニラおよびホタルデータ取得における全体的な後継失敗を測定するための重要な指標となります。

ルシフェリン基質は酸化に対して非常に敏感であり、その結果として自発光が生じます。ここでは、ルシフェリンの静脈内投与に失敗した例として、既知の原発腫瘍ではなく消化管からの非特異的シグナルが発生しています。一方、41原発腫瘍および肺転移を持つマウスを用いたこの腎臓採取の成功例では、ホタルルシフェラーゼのイメージングから経路特異的なシグナル測定値を導き出すことができます。

これらのデータにより、原発腫瘍と肺転移の両方からRSを算出することが可能です。本実験の完了後、免疫組織化学染色やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を用いて、mRNAとタンパク質の結果が報告されたコンストラクトと同様に制御されていることを検証できます。