の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ

この手順の主な目的は、形態だけでは区別できないRetta cylindrica(通常はゴングラスと呼ばれる)の品種を区別できる、費用対効果が高く迅速な分子ジェノタイピングプロトコルを提供することです。これは、最初に関心のあるゴングラスの様々な組織を同定し、単離することによって達成されます。次のステップは、収集した組織から核DNAと漆喰DNAを抽出することです。

次に、PLAのターンLF領域の配列差を標的とする種々特異的なプライマーと、適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して、抽出したDNAに対してポリメラーゼ連鎖反応を行います。最後のステップは、4つのPCR反応のそれぞれでゲル電気泳動を行い、増幅されたPCR産物を可視化することです。最終的に、収集されたゴングラスの種類は、ゲル侵襲計画に対する特定のPCR製品の禁止結果として生じる品種の分析を通じて決定されます侵襲的計画は、米国に年間約34億の費用がかかり、農業資源と天然資源の両方に多大な害を及ぼしています。

野生型のインパラトエレクトリカ(Electrica)は、コーガンとも呼ばれ、草は世界で最悪の侵入雑草のトップ10の1つです。コーガングラスは、原生植物を置き換えるモノスタンドで急速に広がり、順番に、その原生植生GaN草に依存する動物は、現在、世界中で4億9000万ヘクタール、米国では約500、000ヘクタールに蔓延し、tus centricaのtiの観賞用品種は、tus centricaの名前で広く販売されています。 アーブラ、レッドバレン、そしてJBGと呼ぶことにします。この品種は推定上無菌で非侵襲的であり、その赤い色の葉のために望ましいと考えられています。

特定の条件下では、日本の血の草は生存可能な種子を生成し、野生型のコーガングラスと見分けがつかないすべての緑色の形に戻ることができます。ご覧のとおり、どちらも緑の葉を持っており、葉が大きい従来の観賞用品種よりも大きくなっています。さらに、元に戻された植物と野生型の植物は、より大きな根茎を持ち、観賞用の品種は無性生殖能力を高めます。

逆転は、形態学のみを通じて識別を行います。試練のタスク。分子法は、通常の視覚手段では識別できない侵入植物と植物材料を正確に区別する手段を提供します。

分子法は、侵入植物の蔓延と導入を防ぐために重要です。この分子プロトコルの適用は、コーガングラスから日本のブラッドグラスリバートを正確に区別する手段を提供します。このプロトコルは、コーガングラスとの共起や生存可能な雑種の形成を防ぐのに役立ちます。

この技術が、増幅フラグメント長多型、またはA FLP解析やDNAシーケンシングなどの既存の技術よりも優れている点は、野生型のコーガングラスと日本のブラッドグラスの品種との違いを簡単に区別できる、非常に費用対効果が高く迅速な分子ジェノタイピング技術を提供することです。この技術を実演するのは、私たちの研究室の学部生であるJoseph Heryです。まず、ゴングラスまたはジャパニーズブラッドグラスが成長しており、互いに区別する必要がある場所から標本を特定します。

日本の血の草は、その真っ赤な葉によって野生型のゴングラスと簡単に区別できます。しかし、日本のブラッドグラスリバートは、観賞用のジャパニーズブラッドグラスよりも緑の葉が長く、葉の面積が多く、根茎が大きいため、コーガングラスとほとんど見分けがつきません。この方法は、新鮮、冷凍、および最近乾燥した葉の組織に使用できます。

後日、DNA抽出のために組織を保存する場合、最善の方法は、組織をすぐにマイナス80°Cで凍結して保存することです。乾式保管が必要な場合は、ティッシュを紙の封筒に入れ、封筒を脱水シリカゲルまたはその他の活性乾燥剤に室温で保管します。新鮮な組織を使用する場合は、分解を防ぐために、採取後3時間以内にDNAが抽出されることを確認してください。

この手順では、狂言のDNEZプラントミニキットをメーカーの指示に従って使用し、1つの小さな変更を加えます。ここは。この手順は、100ミリグラムを超える新鮮または凍結組織、または20ミリグラムを超える乾燥組織が使用されるように適応されています。最初に、100ミリグラムを超える生または冷凍の葉組織、または20ミリグラムを超える乾燥葉組織を、3ラウンドの液体窒素を使用して微粉末に粉砕し、冷やした乳鉢と乳棒で粉砕します。

新鮮または凍結組織からの凍結粉末を100ミリグラムのアリコートに秤量します。乾燥した葉のティッシュを使用する場合は、粉末を20ミリグラムのアリコートに秤量します。このステップの後、NanoDrop分光光度計テスト、DNA、品質および量などの分光光度計を使用して製造元の指示に従ってDNA抽出を進め、良好なDNA収量は50〜150ナノグラム/マイクロリットルあたり2つの60と2つの80と2 32 80の比率が見られるように2つの80と2 32 80の比率でなければならない。ここは。

標準的な1%AROSゲルを用いて電気泳動を行います。DNA濃度が高い場合は、RNA汚染による縞模様がほとんどないか、またはほとんどない10 KBを超える比較的大きなバンドの存在を確認し、後続のステップのためにサンプルをマイクロリットルあたり70ナノグラムに希釈します。赤と緑の矢印で示されているこのプロトコルで使用されるPCRプライマーは、コーガングラスの漆喰ターンLFスペーサー領域と日本のブラッドグラスの遺伝子型との間の配列の違いに基づいています。

これらの違いは、一塩基多型と縦の黒い矢印で示される挿入と欠失の形でもたらされ、さまざまな特異的なプライマーの開発を可能にします。プライマーをユニークな配列の部位に配置することにより、プライマー配列は、各単離DNAサンプルのプロトコルの書かれた部分に含まれ、書かれたプロトコルに従って設定された各プライマーを使用して、ICE上の0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブに2つの50マイクロリットルPCR反応を設定します。DNA濃度が低い場合は、ヌクレアーゼを含まない二重蒸留水の量を調整しながら、各反応により多くのDNAを添加して、総反応量が50マイクロリットルのままになるようにすることができます。

DNAサンプルに含まれる不純物がPCR反応を阻害する可能性があるため、5マイクロリットル以上のDNAまたは反応あたりの総量の10%を使用しないでください。ポジティブコントロールプライマーを使用して、ポジティブコントロールと同じコントロールプライマーセットを使用してネガティブコントロールを設定しますが、この時点で抽出されたDNAの代わりに二重蒸留水を使用すると、テストされるサンプルごとに合計4つのPCR反応があります。次に、DNAプライマーの品質とDNAプライマータックポリメラーゼまたは使用するサーモサイクラーの種類に応じて、プライムニーリング温度、延長時間、およびサイクル数の最適化が必要となる可能性のある、書かれたプロトコルのPCRサイクリングパラメータを使用して、加熱蓋を装備したサーモサイクラーでPCR増幅を実行します。

PCR反応が完了したら、標準的な電気泳動を使用してPCR産物を1%ゲル上に分離します。Dフロントがゲルの全長の4分の3に達するまで、サンプルを約120ボルトで分析します。UV光下でゲルを可視化し、得られたバンドを検査して、適切なDNA断片が増幅されたかどうかを確認します。

この代表的なゲルは、コーガングラス、ジャパニーズブラッドグラス、およびジャパニーズブラッドグラスリバートDNAサンプルにコーガングラスおよびJBG特異的プライマーを組み合わせたPCR産物の電気泳動結果、およびターンLFポジティブコントロールとノーテンプレートネガティブコントロールの結果を示しています。ターンLFポジティブコントロールプライマーセットは、コーガングラス、ジャパニーズブラッドグラス、ジャパニーズブラッドグラスリバート、その他のグラスでも同様に機能し、890塩基対のバンドが得られます。すべてのPCR試薬にDNA汚染物質がない場合、ネガティブコントロール反応はPCR産物にはなりません。

DNAサンプルが野生型のコーガングラスに由来する場合、コーガングラス特異的プライマーセットを使用したPCR反応では、約595塩基対の単一バンドが得られますが、JBG特異的プライマーではバンドは発生しません。同様に、DNAサンプルがJBGに由来するか、J-B-G-A-P-C-R反応を逆転させたものである場合、JBG特異的プライマーセットを使用すると、約594塩基対のシングルバンドが得られます。一方、コーガングラス固有のプライマーはバンドになりません。

JBGと復帰したJBGは同じ核酸配列を持っているため、同じバンディングパターンを持つことになります。ただし、JBGとJBGリバートの形態学的な違いはかなり明白であるため、PCR結果は同じですが、JBGの品種は植物レベルで簡単に区別できます。PCR産物のDNAシーケンシングにより、さまざまなコーガングラスのエコタイプのDNA配列に起こりうる変化を特定できます。

この技術の開発により、野生型Kとイネ科のイネ科植物、およびその観賞用品種であるイネ科のイネ科のイネ科植物を精密に区別できる、初めての簡易的な分子法が実現しました。このプロトコルのユーザーは、このプロトコルの使用から得られた結果を報告するために当社に連絡することをお勧めします。このような共有された情報は、日本のブラッドグラスの分布に関する情報を提供するのに役立ちます。

これは、USDAの規制当局が、非常に侵襲性の高いコーガングラス品種の蔓延と潜在的な交配を回避するために必要な行動について、情報に基づいた決定を下すのにも役立ちます。