RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus
2011年10月16日
RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して Pristionchus pacificus、進化の発達、および行動生物学の研究のため。
この手順の総合的な目的は、外来DNAを正常に導入し、Priyanka Pacificus線虫における遺伝子機能をノックダウンさせることです。形質転換を行うために、まずは互換性のある粘着末端を持つ適切なゲノムDNAを調製することから始めてください。
RNA干渉のために、二本鎖RNA転写キットを用いて目的遺伝子を合成します。次に、PRIs DIANCA pacificusの生殖腺にDNAまたは二本鎖RNAをマイクロインジェクションします。その後、トランスジェネシスでは選択したマーカー表現型について、RNA干渉ではノックダウン表現型について、F1個体群をスクリーニングし、選別します。
蛍光顕微鏡を用いてGFPレポーターによる特異的な遺伝子発現を示す結果を得るため、F2世代の形質転換線虫の結果を継続的に観察します。こんにちは。カリフォルニア州立大学ノースリッジ校のRay Hongです。このデモンストレーションでは、特定の線虫における遺伝子操作の手順について解説します。新興のモデル生物においてRNAiおよび形質転換を行うことで、遺伝子の機能と発現を解析し、発生生物学や行動学における重要な疑問を解決することができます。
この方法に不慣れな方は、線虫をインジェクションパッドに配置する方法や、gonadsが視認できる正しい焦点面に線虫を注入する方法を視聴することをお勧めします。goadsが背側で互いに交差し、線虫がJ4後期から成体へと成長するにつれて最終的に移動するため、gans goadはSCA特異的です。さらに、インジェクションミックスを作成するために、適合する制限酵素で消化したゲノムDNAを、導入遺伝子および共注入マーカーに添加してください。
本ラボのJessica Single point labでは、形質転換に特化したPRIへのマイクロインジェクションについて実演します。インジェクションには、ドミナント・コインジェクションマーカーを含む3D NA コンストラクトが必要です。標的リポーター導入遺伝子およびゲノムD-N-A-D-N-Aコンストラクトを、互換性のある制限酵素で消化します。その後、エタノール沈殿プロトコルを用いてDNAコンストラクトを回収します。
注入混合液を、表に記載された濃度で調製します。窒素タンクの圧力計の設定を確認してください。次に、1〜2 µLの注入混合液をニードルにロードします。
ニードルをマイクロインジェクションマニピュレーターに装着します。スライド上に置いた細く引き延ばしたキャピラリーチューブの端にニードルの先端を軽く接触させて先端を切り、待機位置にセットします。次に、4匹の若成体ワームが載ったプレートを覆うようにパラフィンオイルを注ぎます。
1匹の線虫を選び、注入パッドに移動させます。顕微鏡下で、線虫の生殖腺が針の方向を向き、外陰部が針から離れるように配置します。次に、顕微鏡の視野に合わせて針を下げます。
上部の生殖腺と針に焦点を合わせます。虫をそっと突き、注入混合液をポンプで注入してください。注入が成功すると、卵が遠位端に向かって分離するのが確認できます。
針の位置を調整して下の生殖腺に注入し、同様に注入を繰り返します。この生殖腺は腸の下にあるため、卵の広がりを確認することができず、注入の成否を判断することがより困難になります。しかし、注入後、虫体は突出した生殖腺がなく、完全な状態であるはずです。
ニードルを待機位置に戻します。ピックを用いてOP 50細菌を少量採取し、M9バッファーを1滴加えて線虫を回収します。線虫にOP 50を触れさせ、付着させます。
次に、OP 50を50 µLずつスポットしたプレートに虫を移します。注入した虫を20 °Cで約4日間飼育し、F1世代を産卵・成長させます。その後、選択した表現型について虫のスクリーニングを行います。
観察された表現型を示すF1個体を単離して新しい播種プレートに選び出し、25 °Cで保存します。最後に、形質転換系統については、F2個体を個別のプレートに移します。その後、次世代以降は20 °Cで保存します。
RNAiおよび外来遺伝子導入による個体レベルでの遺伝子機能操作は、進化発生生物学におけるPpac pacificusモデルの重要な側面です。左側の野生型虫と比較して、安定したF4 PPR L3トランスジェニック系統では、頭部ニューロンにGFP発現を示すドミナントローラーが生じます。逆に、このRNAi実験では、PRL1ローラー機能獲得型変異体TU 92で通常観察されるローリング移動が完全にノックダウンされたPRL1変異体が生成されます。習得すれば、各インジェクションは5分で完了します。独立したF1トランスジェニックローラー系統からのすべてのF2個体を個別にピックアップし、独立したF2プロミを確立させる必要があることを覚えておくことが重要です。
これは、F2系統間でGFPの発現に大きなばらつきがあること、およびローラー表現型の伝達がGFPの発現レベルと相関しないことが判明したためです。
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概要
本プロトコルでは、ネクロメニック線虫であるPristionchus pacificusに、安定的に伝達されるDNAおよび一過性の二本鎖RNAを導入する手法を解説します。これらの手法は、遺伝子機能を操作し、さまざまな生物学的プロセスを研究するために不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 発生生物学
背景
- トランスジェネシス（外来遺伝子導入）により、モデル生物における遺伝子機能の操作が可能になります。
- RNA干渉（RNAi）は、特定のmRNA転写産物をノックダウンするために用いられます。
- Pristionchus pacificusは、進化および行動研究のモデルとして利用されています。
- 遺伝子機能を理解することは、発生プロセスの洞察を得るために不可欠です。
研究目的
- 外来DNAをPristionchus pacificusに効率的に導入すること。
- RNA干渉法を用いて遺伝子機能をノックダウンすること。
- 進化、発生、および行動生物学の研究を促進すること。
使用した手法
- 形質転換のための、適合する粘着末端を持つゲノムDNAの調製。
- RNA干渉のための二本鎖RNAの合成。
- Pristionchus pacificusの生殖腺へのDNAまたは二本鎖RNAのマイクロインジェクション。
- 選択したマーカー表現型に基づくF1集団のスクリーニング。
主な結果
- 線虫への外来DNAの導入成功。
- RNAiを用いた遺伝子機能の効果的なノックダウン。
- F1世代における表現型変化の同定。
- 遺伝学的研究におけるPristionchus pacificusの有用性の実証。
結論
- 概説した手法は、線虫における遺伝子操作に有効です。
- これらの方法は、さまざまな生物学分野の研究を前進させることができます。
- Pristionchus pacificusは、遺伝子機能を研究するための貴重なモデル生物です。
よくある質問
業界における重要性
Pristionchus pacificusのような新たなモデル生物において信頼性の高い遺伝子操作法を確立することで、従来のシステムを超えた標的バリデーション能力を拡張できます。本手法により、直接的な遺伝子ノックダウンおよび安定的なトランスジェニック導入を通じて、進化的に保存された経路のメカニズム的なリスク低減が可能となります。また、線虫を用いたアッセイにおける表現型スクリーニングやバイオマーカー探索のための遺伝的に操作可能なシステムを提供することで、前臨床モデルの開発を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：prl-1(tu92)のようなドミナント変異体をRNAiを用いてノックダウンさせることで、治療的な仮説の検証を可能にし、運動表現型における遺伝子機能を評価できる。
- 運用的価値：組織特異的プロモーターの下でGFPリポーターを発現する安定したトランスジェニック系統を構築するための、再現性のあるマイクロインジェクションプロトコルを提供する。
- 予測的価値：F1世代における神経および筋肉の表現型に対する遺伝子ノックダウンの影響を直接観察することで、シグナル伝達経路の解明を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：ローラー運動などの可視マーカーを用いたノックダウン表現型のハイスループットスクリーニングに適した、同期したF1集団を生成します。
- 定量的出力：F2世代におけるトランスジェーン発現（例：GFP）の蛍光定量が可能になり、用量反応および浸透度の解析が行えます。
- プラットフォームの再利用：P. pacificusにおける複数のトランスジェーンおよびRNAiコンストラクトに適用可能な、標準化されたマイクロインジェクションのワークフローを確立します。
翻訳・前臨床研究
- 疾患との関連性：ヒト疾患モデルに関連する神経発生および代謝経路の進化的な保存性の研究を支援します。
- トランスレーショナルな継続性：F1での遺伝子ノックダウンからF2での安定系統の確立への移行を可能にし、長期的な表現型の評価を実現します。
- メカニズム的リスクの低減：レスキュー解析および分離解析を通じて表現型と遺伝子型の関連性を確認することで、ターゲット検証における偽陽性を減少させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、リード化合物の同定前に遺伝子機能の評価を可能にすることで、初期探索ワークフローへと統合されており、得られた結果はターゲットの選定やメカニズムの追跡調査に活用されます。
- 探索生物学：可逆的な遺伝子ノックダウンおよび安定的な過剰発現を通じて仮説検証をサポートし、遺伝子と表現型の関係を明確にします。
- スクリーニング：化合物感受性および遺伝的相互作用研究のために、検出可能なレポーターを備えたアッセイ可能なトランスジェニック株を作製します。
- 解析：定量的な蛍光および表現型スコアリング出力を提供し、遺伝的条件の比較および浸透度の評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：保存された発生経路を持つシステムにおいて、遺伝子操作と表現型の結果を結びつけます。
- 企業での再利用：複数の遺伝子や系統にわたる反復的なターゲット検証を可能にする、転用可能なマイクロインジェクションプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：遺伝学的に操作可能な線虫モデルにおいて直接的な遺伝子摂動を可能にすることで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させる。
- 運用的価値：定義された注入パラメータおよびスクリーニングタイムラインを備えた、形質転換およびRNAiのための標準化され再現性のあるプロトコルを提供する。
- 戦略的価値：表現型救済および分離能による解析を通じて、ターゲットパスウェイにおけるメカニズム的な曖昧さを低減し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：進化的に離れたモデルにおける機能保存性とドラッグアビリティに基づいた、リスク調整済みのターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 生殖腺特異的な導入のために、線虫の解剖およびマイクロインジェクション技術の専門知識が必要です。
- マイクロインジェクション装置、窒素圧調節、およびキャピラリー針の作製に依存します。
- 制限酵素消化やエタノール沈殿を含む、DNA/RNA調製のための標準化されたプロトコルが必要です。
- 系統維持、表現型スクリーニング、および世代追跡のためのチーム間連携を伴います。
- 双側生殖腺の腹側への移動により制限されるため、安定した生殖細胞系伝播には両側へのインジェクションが必要です。
