マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

この手順の目的は、摘出したマウス心臓をLOR灌流させ、膜電位と細胞内カルシウム・トランジェントを同時に光学的にマッピングすることです。まず、マウス心臓を摘出し、大動脈にカニューレを挿入してLOR灌流を開始します。次に、興奮収縮カップラーを装着して心臓を固定し、灌流チャンバーに心臓をピン留めします。

最終ステップは、光学染料を注入し、実験中のモーションアーティファクトを低減するための準備を行うことです。光学画像は、my cam Ultima LC Mossカメラを用いて心臓から放出される光を収集することで取得します。こんにちは、ディです。

私はワシントン大学の大学院生です。マイクロ電極などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、光学マッピングによって心臓の表面全体にわたってより高い空間分解能が得られることです。マット・サルキンです。

私はワシントン大学の大学院生です。この手法を正しく行えば、不整脈発生の機序など、心臓電気生理学における多くの疑問を解決するのに役立ちます。まず、1台のペリスタティックポンプを、溶液が 40 milliliters per minute で循環するように設定することから始めてください。

次に、2台目のペリスタルティックポンプを80 milliliters per minuteに設定します。このポンプは、Perfuse eightを保持および酸素供給リザーバーに戻す役割を担います。ポンプを起動し、1 literの70% ethanolを用いて、再循環させながら30分間システムを洗浄します。

続いて、再循環させずに2 Lの脱イオン水で洗浄します。水を排出した後、2 LのTyro溶液を循環させ、5 µmフィルターを通過させます。ウォータージャケットとサーキュレーターを用いて灌流液を37 °Cまで温め、溶液中に酸素飽和ガスをバブリングさせます。

ガスのバブリング速度を調整し、pHを7.35 ± 0.05に維持します。実験中はpHと温度の両方をモニタリングしてください。デュアル光学的マッピング装置は、1秒間に3000フレームで100 × 100ピクセルの画像をキャプチャ可能な2台の高速CMOSカメラで構成されています。

バンドパスフィルターをカルシウムイメージングカメラに取り付け、ロングパスフィルターを電圧イメージングカメラに取り付け、それらをデュアルカメラホルダーに装着します。心臓からの放出光がレンズによってミラーに集光されるように、ダイクロイックミラーとレンズを取り付けます。また、2台のカメラをホルダーに取り付け、互いに垂直になるように配置します。

次に、励起光をセットアップします。光はハロゲンランプによって生成され、フレキシブルライトガイドを通して導かれます。この光をヒートフィルター、露光時間を制限するためのシャッター、および励起バンドパスフィルターに通します。

最後に、銀電極および塩化銀電極をチャンバーに設置して準備します。アンプとフィルターのレベルを再確認し調整した後、心臓をセットできる状態になります。処置に進む前に、ケタミンのキシラジン混合液に100 unitsのヘパリンを加えたものを使い、マウスを麻酔してください。

足指をピンチし、動物に疼痛反射がないことを確認します。胸骨正中で切開した後、速やかに心臓および周囲の組織を摘出します。次に、解剖顕微鏡を用いて迅速に大動脈を特定し、右鎖骨下動脈より下方の上行大動脈をきれいに切断します。

次に、4-0の黒色編み込みシルク縫合糸を用いて、大動脈の短いセクションを特注の21ゲージカニューレに取り付けます。カニュレーション後、心臓をTyrode液で後方灌流および超灌流させます。圧力トランスデューサーで測定される大動脈圧が60から80 mmHgの間で維持されるよう、流量を調整してください。

次に、周囲の肺、胸腺、および脂肪組織を解剖して除去します。続いて、肺静脈から左心室にシリコンチューブを挿入します。チューブを近くの結合組織に縫合して固定します。

この非常に重要なステップは、特に心室収縮の抑制後に、左心室にトラップされたPerfuse eightの鬱積および酸性化を防ぐために行います。Perfuse eightによる心臓の不随意運動を防ぐため、心尖部を、sill guardでコーティングされた灌流チャンバーの底にピンで固定してください。さらに、右心耳と左心耳を伸ばしてピンで固定し、直立状態で心房の表面積を広げます。

これにより、記録表面積を最大化できます。ペーシング刺激を行うには、自作の電極を心臓表面に取り付けます。モーションアーチファクトを低減させるため、溶液表面の心臓上に小さなカバーガラスを固定します。

数本のピンの間にガラスを挟み込んで固定します。最終準備として、励起光を心臓に集光させ、光学画像が得られるようにカメラを配置し、その後、色素の注入を開始します。心臓の電気的機能が正常であることを確認するため、ECG記録を継続的にモニターしてください。

まず、BLEs statinを室温まで温めます。次に、0.5 mLのBLEs statinを保持リザーバー内のprofuse eightに混合し、残りの0.1 mLのBLEs statinを1 mLのTyros溶液で希釈します。その後20分間かけて、カンニューラ付近の薬剤注入ポートからTyrosに希釈したBLEs statinをゆっくりと注入します。

BLEsスタチンによって、モーションアーティファクトが徐々に減少します。次に、30 µLの電位感受性色素を1 mLのタイロ溶液で希釈し、この混合液を同じ薬剤ポートに5〜7分かけてゆっくりと注入します。その後、同様の混合液を再度調製します。

次に、カルシウムインジケーターをさらに30 µL加えます。この混合液を、同じポートから5〜10分かけてゆっくりと注入します。カルシウムインジケーターの注入後、BLEsの静止により運動が完全に抑制され、色素が細胞内に浸透するまで、さらに5〜10分待機してから実験を進めてください。

この心臓標本を調製しました。プロトコルに従い、S1-S1刺激による心室ペーシング中のECG信号を記録しました。活動電位およびカルシウム過渡信号は、左側の心房および右側の心室から記録しました。

矢印は、心室からの信号散乱が発生した箇所を示しています。カメラからの記録を3ピクセル×3ピクセルの単位でビン化することにより、アレイデータからカルシウム一過性変化と活動電位のアレイを表示できます。これにより、活動電位の伝導を示す図を作成することが可能です。横軸および縦軸上の連続する3点のデータは、心室表面における活動電位の伝播に伴う振幅の変化を示しています。

同様に、活動電位とカルシウム過渡現象の持続時間を示す図を作成することができます。ここでは、左側にコントロール条件、右側に処置条件を示しています。心臓にイソプロテレノールを注入したところ、カルシウム過渡現象と活動電位の両方の持続時間が明らかに短縮しています。

この手技を習得すれば、本手順に従って2〜3時間で完了させることができます。房室結節の不応期に関する疑問などの追加的な問いに答えるために、ペースメーカープロトコルのような他の手法を実施することも可能です。