マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング
September 13th, 2011
そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。
この手順の全体的な目標は、無傷で単離されたLOR灌流マウス心臓の膜貫通電位と細胞内カルシウム一過性を同時に光学的にマッピングすることです。これは、最初に無傷のマウスの心臓を切除し、次に大動脈をカニューレしてLOR灌流を開始することによって達成されます。次のステップは、カプラーに励起収縮を負荷し、心臓を灌流チャンバーに固定して心臓を固定することです。
最後のステップは、光学色素をロードし、実験中のモーションアーチファクトを減らすための準備をすることです。光学画像は、心臓から発せられた光を私のcam Ultima LC Mossカメラで集めることで得られます。ねえ、私の名前はdiです。
私はワシントン大学の大学院生です。この手法がマイクロ電極などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、光学マッピングにより心臓の表面全体にわたってより高い空間分解能が可能になることです。こんにちは、マット・サルキンです。
私はワシントン大学の大学院生です。この方法を正しく行えば、不整脈発生の基礎など、心臓電気生理学における多くの質問に答えるのに役立ちます。まず、1つの蠕動ポンプを1分間に40ミリリットルで溶液を循環させるように構成します。
次に、2 番目の蠕動ポンプを毎分 80 ミリリットルに設定します。このポンプは、Perfuse 8を保持および酸素化リザーバーに戻します。ポンプの電源を入れ、1リットル、70%エタノールで30分間再循環しながらシステムを洗浄します。
この洗浄後、再循環せずに2リットルの脱イオン水を使用します。水が排出されたら、2リットルのTyro溶液を循環させ、5ミクロンのフィルターに通します。ウォータージャケットとサーキュレーターバブル酸素化ガスを溶液に使用して、灌流を摂氏8〜37度温めます。
ガスのバブリング速度を調整して、pHを7.35プラスマイナス0.05に維持します。実験中は、pHと温度の両方をモニターします。デュアル光学マッピング装置は、毎秒3000フレームで100×100ピクセルの画像をキャプチャできる2台の高速Cモスカメラで構成されています。
カルシウムイメージングカメラにバンドパスフィルターを取り付け、デュアルカメラホルダーの電圧イメージングカメラにロングパスフィルターを取り付けます。DIICミラーとレンズを取り付けて、心臓から出る発光光がレンズによってミラーに集束するようにします。また、2台のカメラをホルダーに取り付け、互いに垂直になるように配置します。
次に、励起ライトを設定します。光はハロゲンランプによって生成され、柔軟なライトガイドを介して導かれます。光をヒートフィルター、露出を制限するためのシャッター、および励起バンドパスフィルターに通します。
最後に、銀電極と塩化銀電極をチャンバーに取り付けて準備します。再確認してレベルを調整した後 amplifiersとfilters、セットアップは心臓の準備ができています。ケタミンとキシラジンのカクテルと100単位のヘパリンを使用して、マウスに麻酔をかけます。
つま先をつまむことで、動物が痛みの反射を起こさないことを確認します。胸骨中央部を切開した後、心臓と周囲の組織を迅速に切除します。次に、解剖顕微鏡を迅速に使用して、大動脈を特定し、右鎖骨下動脈の下の上行大動脈をきれいに切り込みます。
今度は4つのああ黒の編みこみの絹の縫合糸を使用してカスタムメイドの21ゲージカニューレに大動脈の短いセクションを取り付けます カニューレ挿入のレトロな大幅にperfuと超心を融合させます。Tyro Solutionでは、大動脈圧を60〜80ミリメートルに保つように流量を調整します。圧力トランスデューサーによって測定された水銀。
次に、周囲の肺胸腺と脂肪組織を解剖して取り除きます。次に、肺静脈を介して左心室にシリコンチューブを挿入します。チューブを近くの結合組織に縫合します。
この非常に重要なステップは、特に心室収縮の抑制後に、左心室に閉じ込められたPerfuse 8の鬱血と酸性化を防ぎます。Perfuse 8による心臓の動きを防ぐには、心臓をシルガードコーティングされた灌流チャンバーの頂点にピンで固定します。さらに、左右の心房付属器を伸ばして固定し、直立した状態で心房の表面積を増やします。
これにより、記録表面積が最大化されます。ペーシング刺激を行うには、カスタムメイドの電極を心臓の表面に取り付けます。モーションアーチファクトを減らすには、溶液表面の心臓に小さなカバーガラスを固定します。
これを行うには、ガラスをいくつかのピンの間に挟みます。最終準備として、励起光を心臓に集束させ、カメラを配置して光学画像を取得し、ダイをロードしながら色素をロードします。心電図の記録を継続的に監視して、心臓の正常な電気的機能を確保します。
まず、BLEsスタチンを室温まで温めます。次に、1/2ミリリットルのBLEスタチンを保持リザーバーの大量の8に混合し、残りの10分の1ミリリットルのBLEスタチンを1ミリリットルのタイロス溶液に希釈します。.次の20分間で、カニューレ近くの薬物ポートを通じてBLEスタチンをタイロスにゆっくりと注射します。
BLEsスタチンは、モーションアーチファクトを徐々に減少させます。次に、30マイクロリットルの電圧感受性染料を1ミリリットルのチロ溶液に希釈し、この混合物を同じ薬物ポートに5〜7分かけてゆっくりと注入します。次に、同じ混合物を再度作ります。
今回は、カルシウムインジケーターを30マイクロリットル追加しました。この混合物を同じポートから5〜10分かけてゆっくりと塗布します。カルシウムインジケーターを注入した後、BLEsスタチンが動きを完全に抑制し、色素が細胞に入るまでさらに5〜10分待ってから実験を進めます。
この心臓の準備がなされました。プロトコルによれば、心室ペーシング中に S one 刺激 S one 刺激から ECG 信号が記録されました。活動電位とカルシウム過渡信号は、左側の心房と右側の心室から記録されました。
矢印は、カメラからの記録を3ピクセル×3ピクセル単位でビン化することにより、心室からの信号散乱が発生した場所を示しており、アレイデータのデータからカルシウム過渡現象と活動電位の配列を表示できる。活動電位伝導を示す図を構築できます。横軸と縦軸上の3つの連続した点からのデータは、心室表面を横切る活動電位の伝播に伴う振幅変化を示しています。
同様に、活動電位とカルシウムの過渡持続時間を示す図を構築できます。これは、右側の左側に制御条件を示しています。イソプロテレノールの注射が心臓に投与されたため、カルシウム過渡現象と活動電位の両方の持続時間が明らかに短縮されました。
一度習得すると、この手順に続いて、このテクニックは2〜3時間で完了することができます。ペーシングプロトコルのような他の方法は、AV結節の不応期に関する質問などの追加の質問に答えるために実行できます。
概要
この研究は、ランゲンドルフ法で灌流されたマウスの心臓の膜電位と細胞内カルシウム暫定状態の光学的マッピングの詳細な手順を提示します。この方法は従来の技術と比較して空間分解能を向上させ、心臓の電気生理学に関する洞察を提供します。
主要な研究要素
科学分野
- 心臓の電気生理学
- 光学的マッピング技術
- マウスの心臓モデル
背景
- 光学的マッピングにより、VmとCaTを同時に測定できます。
- マイクロ電極のような従来の方法は空間分解能に限界があります。
- この技術は不整脈発生の研究に役立ちます。
- ランゲンドルフ灌流は実験のための心臓の生存性を維持します。
研究目的
- マウスの心臓の光学的マッピングのための信頼性の高い方法を開発すること。
- 心臓の電気的活動の理解を深めること。
- 不整脈のメカニズム研究を促進すること。
使用された方法
- マウスの心臓を切除し、灌流のためのカニューレ挿入。
- 高速カメラを使用して光学画像を撮影。
- 光学染料を用いて膜電位とカルシウム暫定状態を視覚化。
- 実験中のpHと温度をモニタリング。
主な結果
- 分離された心臓でのVmとCaTの光学的マッピングの成功。
- 染料の適用による動揺アーティファクトの減少を実証。
- 心臓の房室から活動電位とカルシウム暫定信号を効果的に記録。
- 今後の電気生理学的研究のための方法の検証。
結論
- 光学的マッピング技術は高い空間分解能を提供します。
- この方法は心臓の電気生理学研究を進歩させることができます。
- 将来の研究ではこの技術を用いて不整脈発生を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
