からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコルハマダラカ属。

この手順の全体的な目標は、異常、標本の中腸および唾液腺部分からマラリア、寄生虫、および蚊のDNAを抽出することです。これは、最初に腹部と胸部の間の接合部で蚊を正確に切断し、中腸を唾液腺部分から分離することによって達成されます。次に、各セクションを脱イオン水で別々に粉砕します。

次に、組織懸濁液を横たわって洗浄し、細胞ペレットを回収します。最後に、細胞ペレットを再構成して煮沸し、DNAを抽出します。最終的には、PCRおよび対立遺伝子特異的制限酵素消化を通じて、異常、ベクター種、および遺伝子型マラリア感染を特定するためのテンプレートとして使用するのに適した、高品質の蚊およびマラリア寄生虫であるDNAを示す結果を得ることができます。

したがって、有機抽出や選別方法などの既存の技術に対するこの非常に単純な技術の主な利点は、安全で容易に入手できる試薬をほとんど使用せず、処理時間も大幅に短縮できることです。蚊の解剖を開始するには、蚊をパラフォームの小片に置き、解剖顕微鏡に取り付けます。それを一滴の脱イオン水で覆います。

組織のサイズを柔らかくするために、蚊の死骸は胸部と腹部の間の関節に正確に入ります。したがって、腹部から頭と胸部を切り落とします。解剖された各蚊の切片を清潔なオートクレーブに移し、蚊のID番号と体部が事前にラベル付けされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管は、パラフィルムを廃棄し、70%アルコール湿らせたキムワイプを使用して、顕微鏡のステージを慎重に拭いてから次の蚊に処理し、蚊のDNAを最初にピペットで抽出し、20マイクロリットルの脱イオン水をサンプルチューブに注入します。

そして、ピペットの先端を使用して、水没した蚊の部分を均一な懸濁液に粉砕します。100マイクロリットルのオートクレーブ、XPBS 1%サポニン溶液1個をサンプルホモジネートに加え、穏やかにボルテックスして混合します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。

次に、20, 000 Gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを100マイクロリットル1XPBSに再懸濁します。その後、スピンを繰り返します。

75マイクロリットルの滅菌脱イオン水と25マイクロリットルの20%重量/体積を追加します。Cellex 100樹脂懸濁液を脱イオン水に含み、ブンゼンバーナーで炎上させた滅菌23ゲージの皮下注射針を使用してペレットを再懸濁するために穏やかに渦巻します。サンプルチューブの蓋に穴を開けます。

サンプル懸濁液を加熱ブロックで10分間煮沸します。20, 000 Gで1分間遠心分離し、抽出されたDNAの品質を確認するためにPCR反応のテンプレートとして使用するためにDNA溶液を事前に標識した保存バイアルに移し、節足動物miミトコンドリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼサブユニット4遺伝子の領域を増幅し、400塩基対のフラグメントを生成すると予想される。次に、Ananais Gambia 種を区別するために、Ananais Gambia Sens Stricto で 390 塩基対、ananais api で 315 塩基対のサイズを生成すると予想される遺伝子間スペーサー領域の SNP に隣接する領域を増幅します。

その後、Ansisはp熱帯熱マラリア抗葉酸薬剤耐性多型を遺伝子型化します。ネステッドPCRを実施して、アミノ酸コドン16、51、59、108、および164に隣接する領域を増幅します。寄生虫では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子がアンプリコンの対立遺伝子特異的な消化を行い、抗葉酸薬耐性を検出します。

関連するポリモーフィズム。2%AROSゲル試験で反応を確認してください。蚊のDNA抽出物の品質、analis、RABIS、分子同定、およびp熱帯熱マラリアのジェノタイピングのためのPCRアッセイからの結果の例は、簡略化されたケレックス法が、それぞれの抽出物で同等のDNA品質を持つより少ないステップと時間の4分の1未満にもかかわらず、標準的な塩化プロトコルと同様の結果をもたらすことを示しています、それは驚くべきことではありません、異常に関してサンプル陽性率、 ガンビアの兄弟種と寄生虫の感染率は、McNearのカイ2乗検定に基づいて統計的に違いはありませんでした。

反応混合物にBSAを添加すると、簡略化されたケレックスと通常の塩析プロトコルの両方についてPCR阻害剤が除去されるため、PCR陽性が一般的に増加します。しかし、この増加は、kelex抽出物のDNA品質を除いて、統計的に有意ではありませんでした。p熱帯熱マラリアアンプリコンの対立遺伝子特異的制限酵素消化は、薬剤耐性対立遺伝子のための中腸および唾液腺マラリア感染症のジェノタイピングを可能にします。

この手法は、適切に実行すれば、約37分で実行できるはずです。