Name: からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコルハマダラカ属。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学ぶChelex法によるマラリア媒介蚊AnophelesのDNA抽出法。中腸と唾液腺から高品質DNAを37分で抽出し、PCRによる寄生虫遺伝子型判定と蚊種同定に応用できます。安全で簡便な代替手法として現場研究に有用です。

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著者らは、首長、首長と蚊フィールドサンプルコレクション中に彼らの協力unwaveing​​用抹茶の社会の世話になっています。博士ダグ·ノリスとリベカケントは塩析プロトコルに非常に貴重な専門知識を提供した。この作品は、ジョンズホプキンスマラリア研究所パイロットグラントシステムによって賄われていた。蚊や寄生虫のDNA実験室の基準は親切にMR4、アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションから寄贈された。

1。モスキート試料の準備解剖<ol><li>顕微鏡を解剖にパラフィルムとマウントの小さなカットの上に置いて蚊。 </li><li>組織を柔らかくするために、脱イオン水の滴でカバー。 </li><li>こうして腹部セクションから頭部と胸部をオフニッキング、胸部と腹部の間の接合部に正確に蚊の死骸を切開。 </li><li>蚊ID番号の詳細や適切ボディ部を（;頭部と胸部セクションの&quot;HT&quot;中腸セクション用などの&quot;m&quot;）を示すようにマークと標識したクリーンなオートクレーブ滅菌1.5 mlマイクロチューブに各解剖蚊のセクションを転送します。 </li><li>パラフィルムを破棄して、慎重に次の蚊を処理する前に70％アルコールで湿らせたキムワイプで顕微鏡ステージを拭いてください。 </li></ol> 2。モスキート検体からのDNA抽出<ol><li>サンプルチューブに脱イオン水をピペットを20μlと国連に沈め蚊部を研削するためにピペットチップを使用iformサスペンション。 </li><li>穏やかな瞬間的なボルテックスでサンプルホモジネートとのミックスにオートクレーブ滅菌1×PBS / 1％サポニン液100μlを加える。 </li><li> 20分間室温でインキュベートする。 </li><li> 2分間20,000 xgで遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 100μlの1X PBSでペレットを再懸濁します。 </li><li> 2分間20,000 xgで再び遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li>穏やかにボルテックス（5秒）、75μlの滅菌脱イオン水でペレットを再懸濁し、そして脱イオン水で20％（w / v）のChelex-100樹脂の懸濁液の25μlによって。 </li><li>ブンゼンバーナーの炎にあて滅菌23G注射針を使用して、サンプルチューブの蓋にピアスの穴。 </li><li> 10分間フローティングラックに水槽（または加熱ブロック内）の試料懸濁液を沸騰させます。 </li><li> PCRアプリケーションのテンプレートとして使用するための標識したストレージバイアルに1分と転送続くDNA溶液のため、20,000 xgで遠心分離します。 </li></ol> 3。熱帯熱マラリア原虫とハマダラカジェノ属。分子的同定<ol><li> ハマダラカ種10を特定し、遺伝子型Pに、DNAの質11をチェックするために、25μlのPCR反応においてChelex DNA抽出物2.5μlを加え熱帯熱マラリア原虫 12中腸及び唾液腺の感染症。 </li><li>特にPのアンプリコンの収量を最大にするには熱帯熱マラリア原虫の検出は、PCRアッセイで（BSA）は1.5Xウシ血清アルブミンが含まれています。下記の反応組成物をお勧めします（2.5μlのテンプレート、0.25μMプライマー、1.5μMの塩化マグネシウム、200μMのdNTP、1×PCRバッファー、1.5XのBSAおよび1.0U Taq DNAポリメラーゼ、25μlの巻）。 </li><li>抽出物中のDNAの品質をチェックするために、節足動物ミトコンドリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ（NADH）サブユニット4（ND4）遺伝子（プライマーND4FW [5&#39;-GTD YAT TTA TGA TTR CCT​​ AA-3 &#39;]とND4RV [5&#39;の領域を増幅CGD-CTT CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;];製品400bp）11,13を期待しています 。 </li><li> ハマダラカガンビアを区別する電子SL。同胞種（An.ハマダラカssと。arabiensisのみ）は、遺伝子間スペーサー（IGS）領域、（のSNPに隣接する領域を増幅するプライマー国連[5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;]、ジョージア州[5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;]、AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;];製品390bpを期待ハマダラカSS、315bp arabiensis）10,11。 </li><li>タイピングPの熱帯熱マラリア原虫葉酸の薬剤耐性遺伝子多型は、寄生虫ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子のアミノ酸コドン108、51、59、16、164に隣接する領域を増幅したnested PCRを行います。 一次ラウンドプライマー ：M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;]とM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] 二次ラウンドプライマー：M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] F /で[5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] または F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]を使用）。 また、アミノ酸のコドン436、437、540、581を含む領域を増幅Pの中にND 613 熱帯熱マラリア原虫 dihydropteroateシンセターゼ（DHPS）遺伝子： 一次ラウンドプライマー R2は[5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] R /と[5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; 二次ラウンドプライマー J：[5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;]と または K：K /で[5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;]、 または L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12。 </li><li>製造元の指示に従って30μlの反応における対立遺伝子特異的な制限酵素消化に従うことを条件として、4μlのアンプリコンは、葉酸拮抗剤耐性関連遺伝子多型12を検出します。 </li><li>テーマ5は、電気泳動にエチジウムブロマイド染色した2％アガロースゲルのレーンあたりPCRアンプリコンの液（または制限消化の15μl）（100 - 120V）およびUV透視下でバンドを可視化。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示され単純化されたChelex法は品質ハマダラカ属およびPの抽出を可能にする多様なPCRアプリケーションに従順蚊検体から熱帯熱マラリア原虫の DNA。この手法は、薬剤耐性Pの分子のマラリア媒介蚊の同定および監視のために使用することができる国家マラリア対策プログラムの蚊の原虫対立。簡略化されたChelex技術の利点は、シンプルさ、より少ない試薬および塩析法10（2時間47分、一晩ステップ、 表1）などの標準プロトコルより故にコスト、安全性、短い処理時間（37分）が含まれています。現在の標準プロトコルと比較して、前述の利点と最小限の試薬 ​​の要件（3試薬）（10試薬は、 表1）11,15 は 、一定の試薬 ​​風土病国の研究所に特に優しい簡素Chelexプロトコルを作るサプライチェーンは、多くの場合、維持することは困難です。メソッドの制限は、標準プロトコルのように、それはまた蚊外皮16で発生することが知られているPCR阻害物質の支配下にあったということです。しかし、これは容易にアッセイにおけるBSAを含めることによって緩和される。 BSAはまた首尾よく他のPCRアプリケーション17,18におけるインヒビターに対する増幅エンハンサーとして採用されている。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Chelex-100、50から100ドライメッシュ</td><td> BioRad社</td><td> ＃143-2832 </td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

からのdna抽出のためのシンプルなchelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

流行国は、ますます彼らの制御プログラム1,2,3,4,5の不可欠な部分として、マラリア原虫と媒介蚊に対する効果的なタイピング、識別および監視のための分子ツールを採用しています。けちな試薬や機器の要件を持つこれらのマラリア制御と排除の取り組みを強化するためのオペレーションズリサーチの正確なアプローチ、シンプルで手頃な価格の方法の確立のために持続可能な6,7,8不可欠です。ここでは、フィールド収集蚊の標本からマラリア原虫とベクターDNAを抽出するためのシンプルなChelexベースの手法を提案する。 私たちは、形態学的に72 ハマダラカSLを同定した。除虫菊スプレーによってキャプチャ156蚊から抹茶でマラリア研究所の2000キロ2近傍内の世帯の部屋を寝にキャッチします。全72 ハマダラカGAMの腹部から頭部と胸部を分離するために解剖した後biae SL。蚊は、2つのセクションが個別に1.5 mlのマイクロチューブに入れ、脱イオン水20μlに浸漬した。滅菌ピペットチップを用いて、各蚊セクションは別々に脱イオン水で均一な懸濁液に均質化した。他の10μlを別オートクレーブした1.5​​ mlチューブに移しつつ、各蚊セクションから続くホモジネートを、10μlを保持した。別のアリコートを簡略Chelexまたは抽出プロトコル9,10塩析標準のいずれかの方法でDNA抽出を行った。それはDNA抽出9時の蛋白質沈殿工程のために有害な有機溶媒（例えば、フェノール、クロロホルムなど）の代わりに高い塩濃度を採用しているため、塩析プロトコルは、いわゆる、広く使われています。 抽出物は、節足動物ミトコンドリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチドdehydrogeを標的としたプライマーを用いたPCR増幅のための鋳型として用いたnase（NADH）サブユニット4遺伝子（ND4）は、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染の 12のタイピングのためのDNAの質11、 ハマダラカの同胞種10の識別のためのPCRとnested PCR法を確認することができます。 DNAの品質（ND4）を使用して比較すると、PCRが確立された塩析プロトコルに対する相対Chelexアプローチのための93％の感度と82％の特異性を示した。感度と特異度の対応する値は Pのために、それぞれの兄弟種同定、PCRと92％と80％を使用して、それぞれ100％と78％であった熱帯熱マラリア原虫検出PCR。 Chelexまたはすべての3つのPCRアプリケーション間でプロトコルを塩析レギュラーとリコン信号を与える検体の割合に有意差は認められなかった。 Chelexアプローチは、3つの簡単な試薬、完了までに37分を要し、一方、一晩工程を含む、10種類の試薬および2時間と47分 &#39;処理時間を伴プロトコルを塩析。我々の結果は、番目を表示Chelex方法で、既存の塩析、抽出に匹敵し、一定の試薬のサプライチェーンは頻繁に維持することが困難である資源の限られた設定で、シンプルかつ持続可能なアプローチとして代用できます。

蚊のDNA抽出質（ 図1）、 ハマダラカarabiensis分子の同定（ 図2）とPのためのPCRアッセイからの結果の例簡略化されたChelex法ははるかに少ない手順（ 表1）にもかかわらず、プロトコル10を塩析標準と同様の結果が得られることを熱帯熱検出（ 図3）を表示します。それぞれの抽出液に匹敵するDNAの品質で、それは驚くべきことではないことに対するサンプル陽性率。ハマダラカ同胞種だけでなく、寄生虫感染率はマクネマーのカイ二乗検定（ 図3）に基づいて、統計的に差は認められなかった。 感度（％）は次のように計算されたTP /（TP + FN）TPは真の陽性を示し、FN​​は偽陰性を示している* 100。特異性（％）は、TN /のように決定したTNは真の陰性を示し、FPは偽陽性を示し（TN + FP）* 100、。 DNAの品質（ND4）PCRは、設立されるようにプロトコルを塩析金本位制に比べChelexアプローチのための93％の感度と82％の特異性を示した。感度と特異度の対応する値は Pのために、それぞれの兄弟種同定、PCRと92％と80％を使用して、それぞれ100％と78％であった熱帯熱マラリア原虫検出PCR。 反応混合物にBSAの添加は、簡略化さChelexと正規両方のプロトコルを塩析するため、PCR阻害物質による14の救済へのPCR陽性（ 図3）の一般的な増加をもたらした。しかし、この増加はChelex抽出した（p = 0.039）上のDNAの質（ND4 PCR）を除いて統計的に有意ではなかった。 P上の対立遺伝子特異的制限酵素消化熱帯熱マラリア DHFRは（または他の標的遺伝子）アンプリコンは、薬剤抵抗性対立遺伝子（;唾液腺のデータは示されていない図4）の中腸及び唾液腺マラリア感染症の遺伝子タイピングを可能にします。 <table border='"1"&gt;'><tr><td colspan="2"> シンプルChelex手順 </td><td colspan="2"> 標準では、手順を塩析 </td></tr><tr><td> 手順 </td><td> 試薬 </td><td> 手順 </td><td> 試薬 </td></tr><tr><td><ol><li> 1.5 mlのマイクロチューブに検体を追加し、1×PBS / 1％サポニン溶液（2分）100μlにホモジナイズする。 </li><li> 20分間室温で残す。 </li><li> 2分間20,000 xgでスピンし、上清を捨てる。 </li><li> 1X100μlのPBSを加え、一瞬（3秒）ボルテックスで静かに混和する。 </li><li> 2分間20,000 xgでスピンし、上清を捨てる。 </li><li>脱イオン水および75μlの滅菌脱イオン水で20％（w / v）のChelex25μlを追加します。 </li><li> 10分間ホット、無菌の23G注射針、沸騰管内容物を使用して、サンプルチューブの蓋にピアスの穴。 </li><li> 2で微量遠心チューブをスピン1分間0000 xgで。 </li><li>使用するまで-20℃（25μlのPCR反応液に2.5μL）で標識し、無菌バイアルと店舗DNA溶液に上清を移してください。 </li></ol></td><td> PBS サポニン Chelex-100ビーズ</td><td><ol><li> 1.5 mlのマイクロチューブに検体を追加し、1％のDEPC（2分）で100μlベンダーバッファー*でホモジナイズする。 </li><li> 1時間65℃でインキュベートする。 </li><li> 15μlの冷8Mの酢酸カリウムを追加します。穏やかに混合し、45分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 10分と新しい1.5 mlチューブに上清を転送するために20,000 xgでマイクロチューブにサンプルをスピン。 </li><li> 100％エタノールを250μlを加え、チューブを反転してよく混ぜる。 </li><li>室温で5分間静置して下さい。 </li><li> 15分間20,000 xgでサンプルをスピン。 </li><li>吸引し、上清を捨て、ペレットがチューブ（30メートルで完全に乾かし残し）インチ</li><li> 4℃で一晩0.1×SSC +アーゼ（10μg/ ml）を20μlにペレットを再懸濁し℃、 </li><li>使用するまで-20℃で80μlのDEPC水とストアを追加します。 </li></ol></td><td>ジエチル（DEPC） *ベンダーバッファ： 0.1MのNaCl 0.2 Mショ糖 0.1Mトリス-HCl 0.05 M EDTA、pH9.1の DEPC水で0.5％のSDS 8 M酢酸カリウムエタノール 0.1X食塩クエン酸ナトリウム（SSC）は、バッファリボヌクレアーゼ（10μg/ ml）を</td></tr><tr><td colspan="2">合計時間：37分</td><td colspan="2">合計時間：2時間47分、プラス一晩</td></tr></table> 表1。シンプルChelexプロトコル用試薬および時間要件のステップ比較によりステップとスタンドARDは蚊の標本からDNAを抽出するための方法を塩析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> ハマダラカarabiensisフィールドサンプルの"M"の抽出物を塩析簡略化Chelex "C"と標準からのDNAの質の1。ND4ミトコンドリアPCRの比較図 。ノースカロライナ、ネガティブコントロール、M1とC1、C2、M2と、M3とC3、およびM4とC4は、塩析と同じからChelex抽出対になっています。 arabiensisの蚊の標本。 L、100 bpのDNAラダー。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 。。ハマダラカarabiensis C1とM1、C2とM2は、C3とM3、C4およびM4は同じ蚊の標本のために"M"と簡略化しChelex "C"のDNA抽出物を塩析からそれぞれのアンプリコンを示すために、図2分子の同定、PCR、AR、 ハマダラカarabiensisポジティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3 Chelexとハマダラカarabiensis（AR）10、節足動物NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子4（ND4）DNAの品質テスト11、葉酸薬剤耐性Pの分子同定のためのPCRアッセイと、蚊フィールドサンプルのDNA抽出、塩析で陽性の検出。熱帯熱マラリア DHFR遺伝子タイピング12（F-M4）。反応混合物中のBSAの有無にかかわらず実行するアッセイのために示された結果。マクネマーのカイ二乗検定は、DNAからポジティブPCRのパーセントの違いが簡素Chelexとプロトコルを統計学的に有意であった塩析標準から抽出されたかどうかを判断するために使用されていました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> Pに簡略化されたChelexプロトコルの応用薬剤抵抗性対立遺伝子のために蚊の原虫感染症（中腸のデータが示されている）。 Pのコドン108に隣接するリコンにBstN私は消化熱帯熱マラリア DHFR遺伝子12は蚊サンプル（;半ば腸データは示さM1〜M5）でcycloguanil耐性S108T変異体を示しています。 U、未消化の522 bpのアンプリコン; FCR3、実験室標準P. S108Tを運んで熱帯熱マラリア原虫陽性対照クローン、K1、P.熱帯熱マラリア原虫実験室標準cycloguanilセンシティブS108Nを保有するクローンネガティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。

蚊の標本から品質マラリア原虫とベクターDNAを抽出するために迅速かつ現実的な方法が記載されている。 Chelex樹脂のキレート特性を生かし、簡単な方法は、マラリア蚊の中腸及び唾液腺の段階で寄生虫と同様の分子同定の遺伝子型が可能<em&gt;ハマダラカ</emPCRによる&gt;同胞種。

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

マラリア原虫および媒介蚊の効率的なタイピング、同定、および監視に向けて、流行国において分子生物学的ツールの導入が進んでいます。

本手順の全体的な目的は、異常個体の標本の中腸および唾液腺部位から、マラリア原虫および蚊のDNAを抽出することである。まず、蚊の腹部と胸部の接合部を正確に切断し、中腸と唾液腺部位を分離させることでこれを達成する。次に、各部位を脱イオン水中で個別に研磨し、破砕する。次に、組織懸濁液をアルカリ処理および洗浄し、細胞ペレットを回収します。最後に、細胞ペレットを再懸濁して加熱し、DNAを抽出します。最終的に、PCRおよびアレル特異的制限酵素消化を通じて、異常の特定、媒介種、およびマラリア感染の遺伝子型の判定にテンプレートとして使用するのに適した、高品質な蚊およびマラリア原虫のDNAを得ることができます。したがって、有機抽出や分取法などの既存の手法に対するこの非常にシンプルな手法の主な利点は、安全で容易に入手可能な試薬を極少量しか使用せず、処理時間も大幅に短縮できる点にあります。蚊の解剖を始めるには、蚊を小さなパラフィルムの上に置き、解剖顕微鏡で固定します。その上に脱イオン水を1滴滴下して覆います。組織を軟化させた後、蚊の死骸の胸部と腹部の接合部を正確に切断します。これにより、腹部セクションから頭部と胸部を切り離します。解剖した各蚊のセクションを、蚊の個体識別番号と体の部位をあらかじめ記入した、清潔なオートクレーブ済み1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。パラフィルムを廃棄し、70% alcoholを浸したKim wipeを用いて顕微鏡ステージを慎重に拭き取ってから、次の蚊の処理に移ります。蚊のDNAを抽出するために、まず20 microlitersの脱イオン水をサンプルチューブにピペッティングします。次に、ピペットチップを用いて、浸漬させた蚊の切片をすり潰し、均一な懸濁液にします。サンプルホモジネートに、オートクレーブ滅菌済みのXPBS 1% saponin溶液を100 µL加え、緩やかにボルテックスして混合します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。次に、20,000 Gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを100 µLの1x PBSで再懸濁します。その後、再び遠心分離を行います。滅菌脱イオン水 75 µL と 20% (w/v) Cellex 100 樹脂脱イオン水懸濁液 25 µL を加え、ブンゼンバーナーで火炎滅菌した滅菌済み 23 ゲージ皮下注射針を用いて、ペレットを再懸濁させるために緩やかにボルテックスします。サンプルチューブの蓋に穴を開けます。試料懸濁液をヒーティングブロックで10分間沸騰させます。20,000 Gで1分間遠心分離し、DNA溶液をラベル付きの保存バイアルに移します。この溶液をPCR反応のテンプレートとして使用し、抽出したDNAの品質確認、および400 bpの断片が生じると予想される節足動物ミトコンドリアのnicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four遺伝子の領域を増幅させます。次に、Ananais Gambia種を識別するために、インタージェニックスペーサー領域のSNPを挟む領域を増幅させ、Ananais Gambia Sens Strictoでは390 bp、ananais apiでは315 bpのサイズが生じることを確認します。次に、p. falciparumの抗葉酸剤耐性多型を遺伝子型判定します。アミノ酸コドン16、51、59、108、および164を挟む領域を増幅するためにネステッドPCRを行います。寄生虫のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子において、増幅産物の対立遺伝子特異的消化を行い、抗葉酸剤耐性を検出します。関連多型。2%AROSゲル電気泳動で反応を確認します。蚊のDNA抽出物の品質分析、RABIS分子同定、および p falciparum ジェノタイピングのPCRアッセイ結果の例では、簡略化されたKelex法が、標準的な塩析プロトコルよりも工程数が少なく、時間は4分の1以下であるにもかかわらず、それぞれの抽出物において同等のDNA品質で同様の結果が得られることが示されています。McNearのカイ二乗検定に基づき、アノフェレス属やガンビア近縁種に関するサンプルの陽性率、および寄生虫感染率に統計的な差がなかったことは驚くべきことではありません。反応混合液にBSAを添加すると、簡便法および標準的な塩析法の両方のkelexプロトコルにおいてPCR阻害剤が除去されるため、PCR陽性率が全般的に向上します。しかし、kelex抽出物のDNA品質を除き、この増加に統計的な有意差は認められませんでした。p falciparumアンプリコンを対立遺伝子特異的な制限酵素で消化する手法を習得すれば、中腸および唾液腺におけるマラリア感染の薬剤耐性対立遺伝子のジェノタイピングが可能になります。適切に実施すれば、この手法は約37分で完了させることができます。

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