Name: のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶマウス盲腸から緑膿菌Pseudomonas aeruginosaの高品質RNA単離法。酸フェノールクロロホルム抽出と複数回のリシス工程により、qPCRやRNAシーケンスに適したRNAを得られる。

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この作品は、健康補助AI62983（AYK）、AI22535（GPB）の国立研究所によって資金を供給された。

1。 P.のマウスモデル緑膿菌 GI植民地化と普及<ol><li> C3H/HeNマウス（雌、6〜8週齢の古い、ハーラン）が共生細菌叢を破壊する経口抗生物質で処理し、以前に4を説明するようにしてPAとのモノは、植民地化されています。 </li></ol> 2。ネズミ盲腸管腔内容物を収穫<ol><li>液体窒素槽に洗浄ステンレス鋼モルタルを浸す。 </li><li>二酸化炭素の窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li>発泡スチロールのボードおよび95％エタノールでシャワー上のセキュリティで保護されたマウスの死骸。胸骨から会陰部への皮膚を通して正中縦切開を加えます。腹腔を露出する皮膚と腹膜を反映している。 </li><li>全体盲腸を切除する。ステンレス鋼モルタル以上鉗子で盲腸を保持する。解剖はさみで盲腸の両端をスニップ。 </li><li>盲腸の近位端に盲腸flushate緩衝液（10mM TrisHCl、1mMのEDTA、200 mMのNaCl）5 1mlで満たしたP1000ピペットの先端を挿入します。ステンレス製の乳鉢に盲腸flushateバッファおよび盲腸内腔の内容をフラッシュします。盲腸flushate緩衝液1mlは、盲腸内容物のすべてをフラッシュするための十分です。盲腸flushateの内容は、モルタルと接触した時点で直ちに凍結されます。 </li><li>滅菌乳棒で盲腸flushateの内容を挽く。 </li><li>場所の地面には、ドライアイス/エタノール浴に浸漬50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに盲腸管腔内容物を凍結。 </li><li>繰り返して、各追加のマウスは2.7を介して2.2を繰り返します。 </li><li> -80℃で保存する</li></ol> 3。細菌のRNAの単離<ol><li> 65にパラフィルムで固定されたキャップで50mlオークリッジ遠心管に含まれる酸の暖かい1ボリューム（二盲腸内腔の内容を、約3 mlの最終容量に基づいて）フェノール/クロロホルム（5:1、v / v）を℃の水浴。 </li><li>溶解バッファーの沸騰0.5体積（2％SDS、16 mMのEDTA、200 mMのNaCl）6は、5分間に50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに含まれています。 </li><li>盲腸内腔の内容に沸騰溶解バッファーを追加します。ホモジナイズ。周期的にボルテックスしながら5分間沸騰させます。 </li><li> 65 ° Cの酸オークリッジ遠心管にフェノール/クロロホルムを100 ° C盲腸内容物/溶解サンプルを追加。パラフィルムでシールキャップ。 </li><li> 65℃でインキュベートC定期的なボルテックス（2分毎）で10分間。 </li><li> 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 </li><li>慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を（白のインターフェースのいずれかを避けて）転送する。水相の体積は、盲腸内容物、溶解バッファー、および酸性フェノール/クロロホルムの総体積の約50％になります。フェノール酸/等量のクロロホルムを追加。 </li><li>シールは、パラフィルムでキャップとハイスピー​​ドでボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 </li><li>水相および有機相の間に目に見える白のインタフェースがなくなるまで3.9から3.7までのステップを繰り返します。 </li><li>慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を移す。クロロホルム/イソアミルアルコール（24:1、v / v）の等量を追加。 </li><li>シールは、キャップとボルテックスでよく混和する。 </li><li> 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 15 mlのポリプロピレンコニカルチューブに水相を（ボリュームは総反応容量の約50％となる）を外し、イソプロパノールの等量を追加。 </li><li>少なくとも2時間または一晩のために-20℃でインキュベートする。 </li><li> 45分間、4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。ペレット状のゲルは、チューブの底に形成されます。上清を取り除く。 </li><li>氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。渦。 5分間、4℃で10,000 gででサンプルを遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、室温で10分間ペレット乾燥をさせるためにチューブを反転させる。 </li><li> RNaseフリー水200μlのRNAペレットを再懸濁します。 </li></ol> 4。 DNase処理（ターボDNA -フリー、アプライドバイオシステムズ） <ol><li> 10XターボのDNaseバッファーおよび2μlのターボのDNase20μlを加え、穏やかに混ぜる。 </li><li> 20分間37℃でインキュベートする。 </li><li>再懸濁したのDNase不活化試薬20μlを加え、よく混ぜる。 </li><li>時々混ぜ、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1.5分間、室温で10,000 gで遠心し、新しいマイクロ遠心チューブに上清を移す。 </li><li>フェノール/クロロホルム冷（4℃）酸の1つのボリュームを追加し、1分間ボルテックスでよく攪拌します。 </li><li> 2分間、室温で12500グラムで遠心。 </li><li>新しいチューブに水相を移し、クロロホルム/イソアミルアルコール（49:1 v / v）で、渦の1ボリュームを追加します。 </li><li> 2分間、室温で12500グラムで遠心。 </li><li>新しいチューブに水相（総反応容量の約50％）を譲渡。 </li><li> 3Mの酢酸ナトリウムの0.1倍量、pHが5.5を追加します。氷冷100％エタノールを2.5倍量。渦。 </li><li> -20℃で少なくとも2時間または30分間-80℃でインキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間12,000 gで遠心する° </li><li>上清を取り除く。 </li><li> 4℃で10,000 gで5分間、遠心分離することにより、氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。 </li><li> 10分間上清と空気乾​​燥を取り外します。 </li><li> RNaseフリー水100μlにペレットを再懸濁します。懸濁するために65℃の水浴中に配置し、ペレットを溶解するために必要な場合があります。 </li><li> DNase処理の有効性をテストするには、リボソームタンパク質（または他の参照の遺伝子）の増幅のための標準的なRT - PCR反応は、RTはコントロールを使用しないで、処理および非処理サンプルに対して実行される可能性があります。 </li></ol> 5。 RNAのクリーンアップステップ（キアゲン、RNeasyキット） <ol><li>キアゲン社RNeasyミニハンドブック（ 第 4版、2006年4月）のページ56から57を参照してください。示されているように従ってください。 </li></ol> 6。代表的な結果このプロトコルを使用して、復元された細菌のトータルRNAの量は、2つのcecumsから約2〜3μgのです。回収したRNAは、その後の定量PCR、転写プロファイリング、およびRNAのSeqの実験のための十分な量と品質です。 RNAの純度は、日常的にサンプルの260nm/280nm比7を測定することにより評価、まだこの方法では、RNAの完全性に関する情報を提供されていません。アジレントバイオアナライザは、サイジング、定量化とDNA、RNA、タンパク質や細胞の品質管理のためのマイクロ流体ベースのプラットフォームであり、RNAの完全性番号（RIN）8として知られているRNAの完全性のメトリックを利用しています。このプロトコルで抽出されたRNAは、280分の260 1.7から2.0に至るまでの比率とRINの値≥7.0を生成します。このプロトコルによって回復細菌のRNAのアジレントバイオアナライザ分析の一例を図1に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。アジレントバイオアナライザ電気泳動図と緑膿菌のトータルRNAサンプルのゲル状のイメージが分離し、マウス盲腸内容物から回収。 RIN 8.0。

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

RNAの抽出方法は、ここで説明すると、マウスの消化管から採取した高品質の緑膿菌の全RNAの十分な量の回復が可能になります。このメソッドは、P.に限定されるものではありません緑膿菌とは、潜在的に他の細菌に適用することができます。腸から十分な微生物の生物の回復は、生物から生物に大きく変化します。私たちのマウスモデル、P.で緑膿菌は、通常、5 × 10 7〜5 × 10 8 CFU / gの糞便4の間のレベルでマウスの消化管に定着。回収した盲腸内容物は約0.5グラム、Pの推定数であるため、 two cecumsから回収された緑膿菌は、5 × 10 7〜5 × 10 8 CFUの間です。他の微生物が使用されている場合、それはGI植民地化のレベルを確認してから、CFUのターゲット数を回復するために必要なcecumsの数を計算するのが賢明だろう。この特定のマウスモデルを使用する場合は、ペンシルバニア州に感染していない抗生物質で処理したマウスは、自分の盲腸内容物から単離されたRNAのない定量的な量がないことに注意することも重要です。 緑膿菌胃腸の植民地化とP.の病因をエミュレートするために普及の試みの私達のマウスモデル癌と幹細胞移植患者における菌血症緑膿菌 。この患者集団では、共生細菌叢は、多くの場合、病原性微生物（例えば、 緑膿菌によるモノ協会）の繁茂をもたらす抗生物質や化学療法（GI共生細菌叢の抗生物質の枯渇など）への二次枯渇している免疫抑制後、その後の普及。このマウスモデルの利点と制限は、すでに以前に4対処されています。この現在の研究の目的は、消化管からの微生物の全RNAを単離するための方法論を提供することです。このプロトコルは、容易に消化管における微生物の病原性の他の側面（すなわち、共生細菌叢の作用、炎症性腸疾患、などの細菌の影響）を調べる他のマウスモデルに適合させることができます。 この方法の1つの利点は、凍結/融解を含む複数の溶解ステップの導入、機械的破壊（乳鉢/乳棒で粉砕、均質化）、沸騰、および化学的溶解（例：SDS）です。溶解ステップの多数にもかかわらず、一部の微生物（特にグラム陽性細菌及び真菌/酵母）追加の機械的破砕が必要な場合があります。溶解/酸性フェノール-クロロホルムインキュベーション（ステップ3.5）、ビーズの追加（細菌や酵母のための/または0.5〜0.7ミリメートルを0.1 mm）およびそれに続くビーズビーティングステップホットした後、これらの生物9を溶解するために十分なはずです10。 マウス盲腸、繰り返し冷たいacid-phenol/chloroformの抽出（ステップ3.7から3.9）から回収された材料の複雑な性質を考えると絶対にさらに下流の反応の許容RNAの品質と整合性を達成するために必要とされています。水溶液と有機相との間の白いのインターフェイスが除去されるまでの間に3月5日冷acid-phenol/chloroform抽出が必要になることがあります。最後に、DNase処理（ステップ4）とRNeasyクリーンアッププロトコル（手順5）の両方の組み合わせは、DNAのコンタミと非発現小（5SとtRNA）を除去するために不可欠です。前述したように、このプロトコルを利用して回収したRNAは、その後の転写プロファイリング3、定量PCR（未発表）、およびRNAのSeq（未発表）の実験のための十分な量と品質です。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>臼と杵</td><td>フィッシャー</td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>オムニ</td><td> TM - 125 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心管（50ml）を</td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td>酸フェノール/クロロホルム</td><td>アンビオン</td><td> AM9720 </td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C2432 </td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> W205702 </td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 190764 </td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート（DEPC） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase処理</td><td>アンビオン</td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasyキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M酢酸ナトリウム</td><td>アンビオン</td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100％エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

のrnaの単離緑膿菌マウス消化管に定着

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

白血病などの患者、重症のやけどの傷、または臓器移植1と免疫力、を持つホストでの重要な罹患率と死亡率における緑膿菌 （PA）感染症の結果。 PAの血流感染症を開発するためのハイリスクの患者では、胃腸（GI）管は、植民地化2の主な貯留が、mechanismsはどのによって無症候性の植民地支配を微生物から浸潤し、しばしば致命的にPAの遷移は、病原体は不明である。以前、我々は、宿主の免疫状態の変化の間に細菌の遺伝子発現の変化を識別するために、マウスの3植民地のcecumsに常駐している細菌細胞からのPAのmRNAを回収することによりin vivoで転写プロファイリング実験で行った。 任意の転写プロファイリング実験と同様に、律速段階は、高品質のmRNAの十分な量の分離です。酵素、破片、食物残渣、および消化管における粒子状物質の豊富さを考えると、RNAの分離の課題は困難です。ここで、我々はマウスの消化管から回収した細菌のRNAの信頼性と再現性の分離のための手法を提案する。このメソッドは、PA GIの植民地化と好中球減少症誘発性の普及4の十分に確立されたマウスモデルを採用しています。 PAで一回GI植民地化が確認され、マウスを安楽死と盲腸内容物を回収し、フラッシュが凍結されています。 RNAは、その後、機械的破砕、沸騰、フェノール/クロロホルム抽出、DNase処理、およびアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせを使用して抽出されます。量と純度は、分光光度計（㈱エルの技術）とバイオアナライザ（アジレントテクノロジー）（図1）によって確認されています。 GIの微生物のRNA単離のこの方法は簡単だけでなく、他の細菌および真菌に適応させることができます。

のRNA単離のための信頼できる方法<em&gt;緑膿菌</em&gt;マウスcecumsから回収記述されています。回収したRNAは、その後の定量PCR、転写プロファイリング、およびRNAのSeqの実験のための十分な量と品質です。この手法は、他の腸内微生物のRNAの単離のために適応させることができます。

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa; PA）による感染症は、…の患者などの免疫不全状態にある宿主において、重大な罹患率および死亡率をもたらします。

この手順の全体的な目的は、マウスの腸管上皮細胞（ECM）から回収した Pseudomonas aerogen の全 RNA を単離することです。まず、管腔内容物を回収し、次に細菌 RNA を単離することでこれを達成します。次に、D'S処理とRNAのクリーンアップを行います。最後に、RNAの定量を行い、バイオアナライザーおよび分光光度計による分析で単離物の純度を確認します。これにより、QPCR、解析、転写プロファイリング、またはRNAシーケンス実験などの後続の実験的評価に十分な品質と量の細菌RNAを得ることができます。トリオール抽出などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、極めて厳格な酸による複数の溶解ステップと、クロロホルム抽出ステップを組み込むことで、高品質なRNAを確保できる点にあります。溶解および抽出ステップは、記述されたプロトコルでは成功に不可欠な細部が省略されがちであり、習得が困難であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるEduardo Lopez Medinaと、ラボマネージャーのMegan Neubauerが行います。採取を開始する前に、IMSAは液体窒素バスの中でステンレス製乳鉢を洗浄します。次に、Pseudomonas aerogenを定着させた6〜8週齢のC3 HHENマウスを安楽死させ、動物をスチロールボード上に仰臥位で配置し、腹部に95% ethanolを散布します。続いて、胸骨から会陰まで、皮膚に正中縦切開を加えます。その後、皮膚と腹膜をかき分け、腹腔を露出させます。次に、鉗子を用いて盲腸全体を摘出します。盲接続部をステンレス製乳鉢の上に保持し、解剖用鋏で盲腸の両端を切断します。P 1000ピペットチップに1 mLのsequel flush eightバッファーを満たし、チップを盲腸の近位端に挿入します。盲腸のフラッシュ8バッファーおよび盲腸腔内の内容物をステンレス製乳鉢に回収します。次に、滅菌済み乳棒を用いて、盲腸フラッシュ8の内容物をすり潰します。次に、エタノールをドライアイスの容器に注ぎ、50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブをドライアイス・エタノールバスに入れます。すり潰した凍結済みの回腸管腔内容物をコニカルチューブに移し、チューブを-80 °Cで保存します。次のステップの一連の操作が、この手順の中で最も困難な部分です。MI盲腸から回収された試料の複雑な性質を考慮すると、許容可能な均一性と完全性を達成するためには、低温でのフィロフォーム抽出を繰り返し行うことが不可欠です。水相と有機相の間の広い界面が消失するまで、3回から5回の抽出が必要になる場合があります。酸性フェノール・クロロホルムを1容量分、50 mLのOak Ridge遠心チューブに移します。キャップをパラフィルムで固定し、チューブを65 °Cのウォーターバスで温めてください。50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに溶解バッファーを半分まで入れ、5分間沸騰させます。-80 °Cで保存していたsequel luminal contentsを取り出し、手で軽くこすって短時間温めた後、沸騰させた溶解バッファーをチューブに加えます。混合物を振とうし、溶解バッファーとSQL luminal content溶液を均質化します。溶解バッファーとSQLルミナル含有物を5分間沸騰させます。定期的にボルテックスしながら、フェノール・クロロホルム溶液が入ったOak Ridge遠心管の封印を解き、SQL含有物の溶解サンプルをチューブに移します。その後、キャップをパ refill で再封印し、2分ごとにチューブを確認しながら、65 °Cのウォーターバスに10分間戻します。サンプルを4°Cで15分間、2,500 ×gで遠心洗浄します。次に、白い界面が混入しないよう注意しながら、水層を新しい50 mLのOak Ridge遠心チューブに慎重に移します。その後、新しいチューブに同量の酸性フェノール・クロロホルムを加えます。キャップをパラフィルムで密封し、チューブを高速でボルテックスして内容物を十分に混合します。サンプルの遠心分離を継続し、水相を遠心分離チューブに移します。上層の水相の体積が小さすぎる場合は、より口径の小さいチューブに移し替えることができます。水相と有機相の間に白い界面が見えなくなるまで、この操作を繰り返します。白い界面が消失したら、水相を注意深く新しい遠心チューブに移します。次に、同量のクロロホルム・イソアミルアルコールをチューブに加え、キャップを密閉し、ボルテックスミキサーで十分に混合させます。次に、サンプルを再度遠心分離した後、水相を15 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えます。その後、溶液を-20 °Cで少なくとも2時間または一晩インキュベートします。インキュベーション後、チューブを45分間遠心分離します。チューブの底部にゲル状のペレットを確認した後、上清を除去します。次に、1 mLの氷冷70%エタノールを加え、チューブをボルテックスしてペレットを洗浄し、4°Cで10,000 ×gにて5分間遠心分離します。最後に、上清を除去し、チューブを逆さまにして、室温で10分間ペレットを自然乾燥させます。次に、RNAペレットを200 µLのRNaseフリー水で再懸濁します。まず、マイクロ遠心チューブに10 x turbo DNAバッファーを20 µLとturbo DNAseを2 µL加え、溶液を静かに混ぜ合わせます。その後、チューブを37 °Cで20分間インキュベートし、再懸濁したDNA不活性化試薬を20 µL加えて十分に混ぜ合わせます。次に、チューブを室温でさらに5分間インキュベートし、時々混合します。続いて、マイクロ遠心機を用いて10,000 ×gで1.5分間遠心分離してペレットを回収し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。ペレットに等 volumes の氷冷酸フェノール・クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで1分間十分に混合します。溶液を12,500 ×gで2分間遠心分離した後、水相を新しいチューブに移し、等量のクロロフォーム・イソアミルアルコールを加えます。次いで、ボルテックスで溶液を混合し、同一の条件で再度遠心分離を行います。水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。次に、3 M 酢酸ナトリウムを0.1容量分、および氷冷した100%エタノールを2.5容量分加えます。チューブをボルテックスして混合します。サンプルを-80 °Cで30分間インキュベートします。その後、4 °Cで12,000 ×gにて30分間遠心分離し、上清を除去します。最後に、1 mLの氷冷した70%エタノールでペレットを洗浄します。上清を除去し、ペレットを10分間風乾させます。次に、ペレットを100 µLのRNaseフリー水に再懸濁します。Agilent Bioanalyzerは、DNA、RNA、タンパク質、および細胞のサイズ測定、定量、および品質管理のためのマイクロフルイディクスベースのプラットフォームであり、RNA整合性数値（RIN）として知られるRNA整合性指標を利用しています。本プロトコルで抽出したサンプルは、260/280比が1.7から2.0の範囲であり、RIN値が7.0以上となります。細菌RNAのAgilentバイオアナライザーによるエレクトロフェログラムの例を左に、マウスSQL内容物から回収したpseudomonas arosaのゲル様画像を右に示します。この手順に続き、詳細な遺伝子発現プロファイリングなどのさらなる課題を解決するために、定量的PCRやRNAシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。

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Research

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下流の単一細胞分析のため尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の分離

ここでは、市販品に対する米国食品医薬品局(FDA)承認の大腸菌と比較して、緑膿菌の遺伝子組み換え株の減衰を評価する感染のマウスモデルの簡単かつ再現性の高いプロトコルについて説明する。...

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

尿路病原性 大腸菌 (UPEC)経尿道接種のマウスモデルにより、潜伏細胞内膀胱リザーバを確立し、その後の再発性UPEC UTIを誘導するための G.膣への膀胱 曝露が実証される。また、細菌の列挙、尿細胞診、および走査型電子顕微鏡のためのin...

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぶマウス盲腸から緑膿菌Pseudomonas aeruginosaの高品質RNA単離法。酸フェノールクロロホルム抽出と複数回のリシス工程により、qPCRやRNAシーケンスに適したRNAを得られる。

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

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