のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

この手順の全体的な目的は、マウスの腸管上皮細胞（ECM）から回収した Pseudomonas aerogen の全 RNA を単離することです。まず、管腔内容物を回収し、次に細菌 RNA を単離することでこれを達成します。

次に、D'S処理とRNAのクリーンアップを行います。最後に、RNAの定量を行い、バイオアナライザーおよび分光光度計による分析で単離物の純度を確認します。これにより、QPCR、解析、転写プロファイリング、またはRNAシーケンス実験などの後続の実験的評価に十分な品質と量の細菌RNAを得ることができます。

トリオール抽出などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、極めて厳格な酸による複数の溶解ステップと、クロロホルム抽出ステップを組み込むことで、高品質なRNAを確保できる点にあります。溶解および抽出ステップは、記述されたプロトコルでは成功に不可欠な細部が省略されがちであり、習得が困難であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるEduardo Lopez Medinaと、ラボマネージャーのMegan Neubauerが行います。採取を開始する前に、IMSAは液体窒素バスの中でステンレス製乳鉢を洗浄します。

次に、Pseudomonas aerogenを定着させた6〜8週齢のC3 HHENマウスを安楽死させ、動物をスチロールボード上に仰臥位で配置し、腹部に95% ethanolを散布します。続いて、胸骨から会陰まで、皮膚に正中縦切開を加えます。その後、皮膚と腹膜をかき分け、腹腔を露出させます。

次に、鉗子を用いて盲腸全体を摘出します。盲接続部をステンレス製乳鉢の上に保持し、解剖用鋏で盲腸の両端を切断します。P 1000ピペットチップに1 mLのsequel flush eightバッファーを満たし、チップを盲腸の近位端に挿入します。

盲腸のフラッシュ8バッファーおよび盲腸腔内の内容物をステンレス製乳鉢に回収します。次に、滅菌済み乳棒を用いて、盲腸フラッシュ8の内容物をすり潰します。

次に、エタノールをドライアイスの容器に注ぎ、50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブをドライアイス・エタノールバスに入れます。すり潰した凍結済みの回腸管腔内容物をコニカルチューブに移し、チューブを-80 °Cで保存します。次のステップの一連の操作が、この手順の中で最も困難な部分です。

MI盲腸から回収された試料の複雑な性質を考慮すると、許容可能な均一性と完全性を達成するためには、低温でのフィロフォーム抽出を繰り返し行うことが不可欠です。水相と有機相の間の広い界面が消失するまで、3回から5回の抽出が必要になる場合があります。酸性フェノール・クロロホルムを1容量分、50 mLのOak Ridge遠心チューブに移します。キャップをパラフィルムで固定し、チューブを65 °Cのウォーターバスで温めてください。

50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに溶解バッファーを半分まで入れ、5分間沸騰させます。-80 °Cで保存していたsequel luminal contentsを取り出し、手で軽くこすって短時間温めた後、沸騰させた溶解バッファーをチューブに加えます。混合物を振とうし、溶解バッファーとSQL luminal content溶液を均質化します。

溶解バッファーとSQLルミナル含有物を5分間沸騰させます。定期的にボルテックスしながら、フェノール・クロロホルム溶液が入ったOak Ridge遠心管の封印を解き、SQL含有物の溶解サンプルをチューブに移します。その後、キャップをパ refill で再封印し、2分ごとにチューブを確認しながら、65 °Cのウォーターバスに10分間戻します。

サンプルを4°Cで15分間、2,500 ×gで遠心洗浄します。次に、白い界面が混入しないよう注意しながら、水層を新しい50 mLのOak Ridge遠心チューブに慎重に移します。その後、新しいチューブに同量の酸性フェノール・クロロホルムを加えます。

キャップをパラフィルムで密封し、チューブを高速でボルテックスして内容物を十分に混合します。サンプルの遠心分離を継続し、水相を遠心分離チューブに移します。上層の水相の体積が小さすぎる場合は、より口径の小さいチューブに移し替えることができます。

水相と有機相の間に白い界面が見えなくなるまで、この操作を繰り返します。白い界面が消失したら、水相を注意深く新しい遠心チューブに移します。次に、同量のクロロホルム・イソアミルアルコールをチューブに加え、キャップを密閉し、ボルテックスミキサーで十分に混合させます。

次に、サンプルを再度遠心分離した後、水相を15 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えます。その後、溶液を-20 °Cで少なくとも2時間または一晩インキュベートします。インキュベーション後、チューブを45分間遠心分離します。

チューブの底部にゲル状のペレットを確認した後、上清を除去します。次に、1 mLの氷冷70%エタノールを加え、チューブをボルテックスしてペレットを洗浄し、4°Cで10,000 ×gにて5分間遠心分離します。最後に、上清を除去し、チューブを逆さまにして、室温で10分間ペレットを自然乾燥させます。

次に、RNAペレットを200 µLのRNaseフリー水で再懸濁します。まず、マイクロ遠心チューブに10 x turbo DNAバッファーを20 µLとturbo DNAseを2 µL加え、溶液を静かに混ぜ合わせます。その後、チューブを37 °Cで20分間インキュベートし、再懸濁したDNA不活性化試薬を20 µL加えて十分に混ぜ合わせます。

次に、チューブを室温でさらに5分間インキュベートし、時々混合します。続いて、マイクロ遠心機を用いて10,000 ×gで1.5分間遠心分離してペレットを回収し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。ペレットに等 volumes の氷冷酸フェノール・クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで1分間十分に混合します。

溶液を12,500 ×gで2分間遠心分離した後、水相を新しいチューブに移し、等量のクロロフォーム・イソアミルアルコールを加えます。次いで、ボルテックスで溶液を混合し、同一の条件で再度遠心分離を行います。水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

次に、3 M 酢酸ナトリウムを0.1容量分、および氷冷した100%エタノールを2.5容量分加えます。チューブをボルテックスして混合します。サンプルを-80 °Cで30分間インキュベートします。

その後、4 °Cで12,000 ×gにて30分間遠心分離し、上清を除去します。最後に、1 mLの氷冷した70%エタノールでペレットを洗浄します。上清を除去し、ペレットを10分間風乾させます。

次に、ペレットを100 µLのRNaseフリー水に再懸濁します。Agilent Bioanalyzerは、DNA、RNA、タンパク質、および細胞のサイズ測定、定量、および品質管理のためのマイクロフルイディクスベースのプラットフォームであり、RNA整合性数値（RIN）として知られるRNA整合性指標を利用しています。本プロトコルで抽出したサンプルは、260/280比が1.7から2.0の範囲であり、RIN値が7.0以上となります。

細菌RNAのAgilentバイオアナライザーによるエレクトロフェログラムの例を左に、マウスSQL内容物から回収したpseudomonas arosaのゲル様画像を右に示します。この手順に続き、詳細な遺伝子発現プロファイリングなどのさらなる課題を解決するために、定量的PCRやRNAシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。