生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

このプロトコルの全体的な目的は、明視野、生体イメージング顕微鏡およびタイムラプスビデオ撮影を用いて、in vivo での好中球化学走向物質に応答した好中球動員における、好中球と血管内皮細胞の動的な相互作用を研究することです。本ビデオでは、マウスの皺肌組織において、好中球の管腔内クロール、内皮細胞への遊走、および化学走向性を可視化し決定するための、明視野生体ビデオ顕微鏡の使用手順を実演します。白血球動員は炎症の特徴的な指標です。

このリクルートメントプロセスは、血流中の白血球が炎症部位の毛細血管後静脈の内皮細胞上をローリングし始めることで開始されます。血管表面のケモカインやその他の化学誘引物質に反応して、これらのローリングしている白血球は停止し、内皮細胞に強固に接着します。接着後、多くの白血球は管腔表面をクロールし、最適な経内皮移動部位を探索しているように見えます。

続いて、白血球は内皮細胞上を移動し、この過程は内皮細胞移行と呼ばれます。その後、好中球は血管外組織において、炎症部位の化学誘引物質の供給源に向かって移動します。この過程を化学走性といいます。このビデオでは、明視野生体ビデオ顕微鏡のタイムラプス撮影とImage Jを用いて、大腿筋組織における好中球の内腔内クロール、内皮細胞移行、および化学走性における移動を可視化し、追跡および定量化する方法、ならびに好中球化学誘引物質の供給源に対する反応を調べる実験について説明します。

こんにちは。サスカチュワン大学医学部薬理学部のLis Liuです。本日は、アガロースゲルを用いた好中球走化性アッセイの作製方法と、生体内顕微鏡観察のためのマウス後肢筋肉組織の準備方法について解説します。

MEGJを用いて細胞の移動を追跡する方法、および最後に好中球の遊走パラメータを解析する方法について、当研究室の大学院生であるNaja ShとChileが詳細な実験手順を解説します。こんにちは、Naja Shです。こんにちは、Chileです。

この実験を始めるために、まず好中球化学遊走物質を調製します。2倍濃度のPBS 10 mLを50 mLコニカルチューブにピペッティングしてください。温水を入れたビーカーにチューブを浸し、加温します。次に、蒸留水10 mLをピペッティングします。

別の50 mLコニカルチューブに0.4 gのアガロースパウダーを加えます。電子レンジで混合液が沸騰するまで加熱し、PBS中2%アガロース溶液を調製します。温めた2×PBSをアガロース溶液のチューブに加えます。

混合溶液を撹拌し、温水ビーカー内で保温します。化学誘引物質溶液を、1.5 mLエッペンドルフチューブの蓋の中で3 µLのインディアインクとともに十分に混合します。その際、気泡が入らないように注意してください。

200 µL ピペットチップの先端を切り、マイクロピペットを用いて 42 °C のアグロ溶液 110 µL を蓋に入れ、直ちに十分に混合します。別のピペットチップを使用して、この化学誘引物質を含むゲルを使用時まで冷蔵庫で保管します。キシラジンとケタミンの混合液を腹腔内投与（IP injection）し、成体雄マウスを麻酔させます。

右外頸静脈および陰嚢の前面を剃毛します。麻酔後、電気シェーバーを使用して剃毛しますが、麻酔状態のマウスには細心の注意と配慮を払うことが重要です。マウスの低体温を防ぐために、ヒートランプを使用することができます。

マウスが痛み反射を示さないことを確認します。水平切開を行い、100 units/mLのヘパリン生理食塩水を満たしたPE 10チューブを用いて頸静脈を同定し、カニュレーションします。精管筋およびマウスの体温を維持するため、ボードを37 °Cの水循環装置に接続します。

マウスを仰向けにして精索筋ボードに置き、後肢を臍帯テープで固定します。陰嚢の皮膚を切開し、左側の精索筋を露出させます。周囲の筋膜から注意深く筋肉を剥離します。

37 °Cに加温した重炭酸緩衝生理食塩水で精索挙筋を十分に洗浄します。精索挙筋ボードの透明な観察用ガラス台座に固定するため、精索挙筋の遠位端を4.0縫合糸で結紮します。4.0縫合糸を用いた焼灼器で、精索挙筋を縦方向に焼灼します。

筋肉を平らに保持し、台座の縁に沿って固定します。精巣と副精巣を下の筋肉から分離し、腹腔内に移動させます。22 by 22 mmのガラスカバースリップの対向する端に、真空グリースを薄く塗布します。

次に、露出した筋肉をガラスカバースリップで覆います。マスター筋肉ボードを顕微鏡のステージ上に置きます。顕微鏡下で筋肉を観察し、適切な後毛細血管静脈（post capillary venue）を探します。

通常のせん断速度を持ち、直径が25から40 µmの静脈を選択します。ビデオカメラを調整し、モニターの右端または左端に静脈が垂直方向に視認されるようにします。30分後、DVDレコーダーなどのビデオ録画装置を用いて、選択した毛細血管後静脈のビデオ画像をベースライン対照データとして記録します。

これは毛細血管後静脈のベースラインコントロールビデオ画像です。腹壁挙筋の表面に化学走化性物質含有ゲルを配置する前に、灌流を停止し、筋肉上のガラスカバーのスリップを取り除きます。エッペンドルフチューブの蓋から1立方ミリメートルサイズの化学走化性物質含有ゲルを打ち出します。先端をカットした200 µLピペットチップを用いて、打ち出した化学走化性物質含有ゲルを、観察対象の毛細血管後静脈から350 µm離れた、腹壁挙筋表面のあらかじめ選択した領域に配置します。

カバーガラスを載せてゲルを固定し、筋肉組織に化学誘引物質を含むゲルを、10 µL/min以下の非常に低速で超灌流させます。これにより、ゲルからゆっくりと放出され、化学誘引物質の濃度勾配が形成されるようにします。化学誘引物質含有ゲルの添加後、90分間ビデオ録画を行います。録画中は、静脈内および筋肉組織内で接着、遊走、透過、および走化性を示す白血球に顕微鏡の焦点を合わせ、維持してください。

実験後、ビデオファイルをコンピュータにインポートします。コンピュータで解析を行うために、ビデオを抽出してAVI形式に変換します。例えば、フリーウェアのBitRipperを使用して、DVDビデオをAVIファイルに変換します。

Windows Movie Makerなどのビデオ編集ソフトウェアを使用して、元のリアルタイムビデオからタイムラプス動画を作成し、DV AVI形式で変換・保存します。同じ顕微鏡設定で校正用マイクロメーターの画像を記録し、画像をコンピューターに取り込みます。

ImageJで画像を開きます。X軸とY軸の両方で画面サイズを測定し、1マイクロメートルあたりのピクセル数を算出します。動画をインポートするには、再びImageJを開き、[File]からQuickTime moviesプラグインを使用してインポートを選択し、解析する動画を選択してQT movie openerのインターフェースで[OK]をクリックします。[Plugins]をクリックし、細胞を追跡するために[Manual tracking]を選択します。追跡を開始する前に、画面下部のフィールドにしかるべき情報を入力してください。追跡を開始する前に、以下の時間パラメータを決定する必要があります。

秒単位の間隔は、全タイムラプス時間を30で除した値です。xyキャリブレーションは、マイクロメーターの画像キャリブレーションから得られた1ピクセルあたりのマイクロメートル測定値です。Zキャリブレーションはゼロに設定し、センタリング用の検索正方形サイズは1とします。録画されたビデオの中から、参照点として安定し、かつ明瞭な点を選択する必要があります。この参照点は、実験全体を通じて変化せず安定している、明瞭で小さな構造上の点であればどのような点でも構いません。

「add track」をクリックし、最初のフレームから最後のフレームまで基準点をトラッキングします。次に、クロールおよび遊走する好中球を一つずつクリックしてトラッキングしてください。「add track」をクリックして、各フレームにおいて細胞が出現してから消失するまでをトラッキングします。

次に、[click and track]をクリックして完了させ、結果をMicrosoft Excelに保存します。Microsoft Excelで結果ファイルを開き、データの解析を開始します。

分析に際しては、参照点の動きを考慮することが重要です。好中球および管腔内でのクロールを追跡する際は、好中球と管腔内のクロール距離およびクロール速度を決定します。好中球の内皮細胞透過性遊走を分析する際は、好中球の透過遊走時間および遊離時間を測定します。

筋肉組織内における好中球の走化性を決定する際は、筋肉内での好中球の移動および走化性の距離と速度を測定し、さらに筋肉組織内での好中球走化性における走化性指数を決定します。画面に表示されているこれらのパラメータの定義については、書面によるプロトコルに詳細が記載されています。本実験では、明視野生体内顕微鏡を用いて、好中球の内腔内クロール、内皮細胞への遊走、および走化性における移動を可視化し、決定するための手順を実演します。

生体内での好中球化学走性因子への反応を調べるため、MIP-2、CXCL2、または合成ペプチドW-K-Y-M-V-Mを用いてアガロゲルを調製し、マウスのCMA筋肉組織において好中球のリクルートを誘導しました。本図からわかるように、0.5 µMのMIP-2と0.1 mMのW-K-Y-M-V-Mは、同程度の速度で好中球の管腔内クロールを誘発しました。好中球の経内皮移行および静脈からの脱出に要した時間は、同等でした。

これら2つの化学遊走物質は、ほぼ同等の速度および同様の好中球化学遊走指数で、筋肉組織における好中球の遊走および化学遊走を誘導しました。生体内顕微鏡は、好中球リクルートの過程を直接観察し、各リクルートステップにおける細胞および分子の機能を定量的に決定するための有用なツールです。タイムラプスビデオ撮影とImage Jを用いることで、選択的阻害剤、トランスジェニックマウス、および選択的化学遊走物質を用いて、明視野生体内顕微鏡下で白血球の管腔内クロール、内皮細胞への遊走、および組織内への化学遊走を測定することが可能です。

このアッセイシステムを利用することで、白血球動員における特定のタンパク質の機能を明らかにすることができます。