生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

このプロトコルの全体的な目標は、明視野、生体内顕微鏡およびタイムラプス ビデオ写真を使用して、好中球の動員中の動的な好中球内皮細胞の相互作用を研究することです in vivo 好中球化学療法誘引剤に応答して。このビデオでは、顕微鏡明視野生体内ビデオを使用して、マウスのchma筋組織における好中球管腔内這流、T内皮移動、および走化性を視覚化および決定する方法の手順を示します。白血球の動員は炎症の特徴です。

このリクルートプロセスは、血流中の白血球が炎症部位の毛細血管後V字の内皮上を転がり始めると開始されます。尿表面のケモカインまたは他の化学療法誘引物質に応答して、これらの転がる白血球は内皮で停止し、しっかりと付着します。接着後、多くの白血球が管腔表面を這い回り、最適な転生部位を探しているように見えます。

這う白血球が内皮を横切って移動する過程は、T内皮移動と呼ばれます。その後、好中球は血管外組織内を炎症部位の化学療法誘引物質の供給源に向かって移動しますが、これは走化性MOIと呼ばれるプロセスです。このビデオでは、明視野生体内ビデオ、顕微鏡タイムラプス写真、画像Jを使用して、好中球の管腔内這う様子、Oma筋組織におけるT内皮の移動と走化性の移動、および好中球化学療法誘引剤の源に対する応答を視覚化、追跡、および決定する方法の実験を示しています。

こんにちは、サスカチュワン大学医学部薬理学部のリス・リューです。今日は、アグロゲルで好中球化学トラントを作る方法をご紹介します。生体内顕微鏡検査のためのマウスリマスターマッスルの調製方法。

MEGJを使用して細胞の動きを追跡する方法。そして最後に、好中球の動員パラメータの解析方法について、当研究室の大学院生2人、ngel Najaさん、shさん、Chileさんが詳細な実験手順をお教えします。こんにちは、私はナジャ・Sh.こんにちは、チリです。

この実験を開始するには、アグロゲルの最初のピペット、PBSの2倍の10ミリリットル、および50ミリリットルの円錐管で好中球化学療法誘引剤を準備します。チューブをお湯の入ったビーカーに入れて温めます。蒸留水10ミリリットルをピペット

0.4グラムのアロスパウダーとさらに50ミリリットルのコニカルチューブを追加します。混合物を電子レンジで沸騰するまで加熱して、PBSで2%のアグロを作ります。温かい2倍のPBSをアグロ溶液チューブに加えます。

混合溶液を渦巻き、お湯ビーカーで保温します。1.5ミリリットルのエンドチューブの蓋に、化学療法誘引剤溶液と3マイクロリットルのインドインクをよく混ぜます。混合中に気泡が発生しないようにしてください。

200マイクロリットルのピペットチップとマイクロピペットの先端を切り、42°Cの110マイクロリットルのアグロ溶液を蓋に差し込み、すぐによく混ぜます。別のピペットチップを使用して、このケモアトラクタントを冷蔵庫にゲルを含ませて保存します 麻酔 キシラジンとケタミンの混合物のIP注射による成体の雄マウス。

塩酸塩は、右外頸静脈と陰嚢の前面の領域を剃ります。麻酔後の電気カミソリでは、麻酔をかけたマウスに特別な注意とケアを与えることが重要です。マウスの低体温症を防ぐために、ヒートランプを使用することができます。

マウスは痛みから解放されるべきです 反射神経。水平切開を行い、ミリリットルあたり100単位のヘパリン生理食塩水で満たされたPE10チューブを使用して頸静脈を見つけてカテーテルを挿入します。ボードを摂氏37度の水循環器に接続して、火葬場の筋肉と最も体を暖かく保

マウスの後肢をへそのテープで固定し、最も横たわっているのが火葬筋ボードの上を上にして固定します。陰嚢の皮膚を切開して、左の火葬筋を露出させます。関連する筋膜から筋肉を慎重に解剖します。

クレマスターの筋肉を37°Cの温めた重炭酸塩緩衝生理食塩水で超融合させました。クレマスターマッスルの遠位端に4.0縫合糸を結び、クレマスターマッスルボードの透明な表示ガラス台座に保持します。クレマスターの筋肉を縦方向に焼灼し、4OH縫合糸で焼灼します。

筋肉を平らに持ち、台座の端に沿って固定します。睾丸と精巣上体を下にある筋肉から分離し、腹腔内に移動します。22 x 22 mmのガラスカバースリップの反対側の端に真空グリースの薄い層を追加します。

次に、露出した筋肉をガラスカバースリップで覆います。マスターマッスルボードを顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡で筋肉を検査し、適切な毛細血管後の場所を見つけます。

通常のせん断速度と直径が25〜40マイクロメートルのベンニューを選択します。ビデオカメラを調整して、会場がTVモニターの右側または左端の垂直位置に視覚化されるようにします。30分後、選択したポストキャピラリー会場のビデオ画像を、DVDレコーダーなどのビデオレコーダーデバイスを使用してベースライン制御データとして記録します。

ポストキャピラリー会場のベースライン制御動画です。クレマスターの筋肉の表面にゲルを含む化学療法剤を配置する前に、超融合を停止し、筋肉パンチのガラスカバースリップを1立方ミリメートルサイズのゲルを含むeinorチューブの蓋から取り外します。200マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取り、パンチングされたケモ誘引剤を含むゲルを、観察された毛細血管後の会場から350マイクロメートルの事前に選択された領域の火葬筋の表面に置きます。

ゲルを所定の位置に保持するためにカバースリップを追加し、筋肉組織を非常に遅い速度で、毎分10マイクロリットル以下で超融合して、ゆっくりとゲルから放出されて形成される化学療法誘引剤の勾配を確立できるようにします。ゲルを含む化学療法誘引剤を添加した後、90分間ビデオ画像を記録します。記録中は、顕微鏡を調整し、会場内および筋肉組織内の付着、這う、トランスミ移動、および化学療法による白血球に焦点を合わせます。

実験後、ビデオファイルをコンピューターにインポートします。コンピューターで分析するには、ビデオを抽出してVI形式に変換します。たとえば、無料のコンピューターソフトウェアビットリッパーを使用して、DVDビデオをAVIファイルに変換します。

ビデオ編集ソフトウェア、たとえばWindowsムービーメーカーを使用して、元のリアルタイムビデオからタイムラプスムービーを作成し、タイムラプスムービーをDV AV VI形式に変換して保存します。キャリブレーションマイクロメータの画像を同じ顕微鏡設定で記録します。画像をコンピューターにインポートします。

画像J.x軸とY軸の両方で画面のサイズを測定し、マイクロメートルあたりのピクセル数を計算します。ムービーを開いた画像をインポートするには、QuickTimeムービープラグインを使用してファイルインポートをクリックし、解析するムービーを選択してQTムービーオープナーのインターフェースでOKをクリックし、プラグインをクリックします。セルを追跡するための手動追跡:追跡を開始する前に、画面下部のフィールドに関連情報を入力します。追跡時間の前に次のパラメータを決定する必要があります。

秒単位のインターバルは、フルタイムラプスを30xyで割ったキャリブレーションは、マイクロメータ1ピクセルあたりの測定値であり、マイクロメータの画像のキャリブレーションからZキャリブレーションは、センタリングが1に等しいための検索平方サイズがゼロに設定されている。録画したビデオでは、基準点として安定した明確なポイントを選択する必要があります。この基準点は、実験全体を通じて変化せず安定している、明確で小さな構造点であれば何でもかまいません。

「トラックを追加」をクリックして、最初のフレームから最後のフレームまでの参照ポイントを追跡します。次に、クリックして追跡し、追跡し、這い回り、移動する好中球を1つずつ追跡します。「トラックの追加」をクリックして、組織内でのセルの出現から各フレームでの消失までセルを追跡します。

次に、クリックして追跡し、結果を終了してMicrosoftExcelに保存します。Microsoft Excel で結果ファイルを開きます。データの分析を開始します。

基準点の動きを解析に取り込むことが重要です。好中球と管腔の這う音を追跡するときは、好中球と管腔の這う距離と這う速度を決定します。好中球のトランス内皮移動を解析する際には、好中球のトランス移動時間と剥離時間を測定します。

好中球の走化性増加のマスター筋組織を決定する際には、筋肉内の好中球の移動と走化性の距離と速度を測定し、また、筋肉組織における好中球走化時の走化性指数も決定します。画面に表示されるこれらのパラメータの定義は、当社の書面によるプロトコルに詳細に記載されています。この実験では、明視野生体内顕微鏡を使用して、好中球管腔内這うT内皮移動と走化性における移動を視覚化および決定する方法の手順を示します。

in vivoでの好中球化学誘引物質に応答して、MIP two CX CL two、または合成ペプチドW-K-Y-M-V-Mを調製してアグロゲルを調製し、マウスCMA筋肉組織に好中球の動員を誘導しました。この図からわかるように、0.5マイクロモルのMIP 2と0.1のW-K-Y-M-V-Mでは、ミリモルは同様の速度で好中球の管腔内這いを誘発した。好中球の経内皮移動とvenからの剥離は、時間の長さで同等でした。

これら2つの化学療法誘引物質は、ほぼ同じ速度で、同様の好中球走化性指数で、筋肉組織に好中球の移動と走化性も誘発しました。イントラバイタルマイクロスコープは、好中球の動員プロセスを直接観察し、各動員ステップにおける細胞や分子の機能を定量的に決定するための貴重なツールです。タイムラプスビデオ撮影と画像Jを使用することにより、白血球および組織の走化性における管腔内這うT内皮移動および走化性移動を、明視野下、生体内、選択的阻害剤による顕微鏡下、トランスジェニック、マウス、および選択的化学療法誘引剤で測定できます。

このアッセイシステムは、白血球の動員における特定のタンパク質の機能を明らかにするのに役立ちます。