Epstein - Barrウイルスの成長形質転換リンパ芽球様細胞株の樹立

本手順の目的は、ヒトB細胞からEpstein-Barrウイルス変換リンパ芽細胞株（LCL）を作製することです。これは、まずヒト血液から末梢血単核細胞を分離することによって行われます。

次に、FK 506および免疫抑制剤の存在下で、細胞にEpstein-Barr virusを感染させます。Epstein-Barr virusの感染から3〜4日後、CD23 highおよびCD58 positiveとして標識され、増殖すると予測される細胞のサブポピュレーションが出現します。CD23 highおよびCD58 positiveの細胞は、良好な結果の予測因子としてフローサイトメトリーにより計数することが可能です。増殖している細胞は、正常に形質転換された細胞培養物において形成されるリンパ芽細胞株のクラスターにより、微視的および巨視的にさらに特定することができます。

最終ステップは、凍結保存のためにリンパ芽細胞株を拡大培養することです。当研究室では、宿主とエプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）の相互作用を理解するために、リンパ芽細胞株（LCL）を樹立しています。リンパ芽細胞株は、特にウイルス学者、免疫学者、がん生物学者にとって、科学界において広く関心を集めている対象です。

Macintosh研究室のポストドクターとして、リンパ芽球細胞株の作製手順を実演します。ドナーから10 mLの血液を採取し、ヘパリン処理した血液を50 mLのコニカルチューブに入れ、1対2に希釈します。室温のPBSを20 mL加えて希釈し、次に、希釈した血液の下層にFICOLL-HIAリンパ球分離培地を15 mL加えます。その後、室温で、ブレーキなしで225 ×gにて30分間遠心分離し、密度勾配を形成させます。

次に、バフィーコートを除去し、新しい50 milliliterのコニカルチューブに移します。PBSを加えて全量を50 millilitersにし、600 ×gで10分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を捨て、ペレットを50 millilitersのPBSで再懸濁し、同様の条件でさらに2回細胞を洗浄します。

次に、細胞を1 mLの完全RPMI培地で再懸濁します。5 µLの細胞をとり、トリパンブルーを用いて10倍に希釈し、ヘモサイトメーターで生細胞数をカウントします。その後、完全RPMI培地を用いて液量を調整し、細胞濃度を2×10⁶ cells/mLにします。そして、細胞を25 cm²の組織培養フラスコに移します。

Epstein-Barrウイルス（EBV）の感染準備として、組織培養フラスコにFK 506を最終濃度20 µMとなるように加えます。次に、フラスコを37°C、5%二酸化炭素インキュベーター内に1時間置きます。インキュベーションが終了する直前に、B 95-8細胞から回収したEpstein-Barrウイルスの分注液を迅速に融解させます。その後、フラスコをインキュベーターから取り出し、1:10の希釈倍率でEpstein-Barrウイルスを細胞に添加します。次に、フラスコを揺らしてEpstein-Barrウイルスを溶液中に混合させ、キャップを締めた状態で（非通気性フラスコを使用している場合は、キャップをわずかに緩めて）フラスコを垂直に立ててインキュベーターに戻します。凍結保存のための培養拡大を行うまで、2〜3週間保持します。

eps（エプスタイン・バーウイルス感染）から1週間後、この初期の顕微鏡的クラスターを示す代表的な図に見られるように、光学顕微鏡で細胞のクラスターが確認できます。時間が経過するにつれて顕微鏡的クラスターは大きくなり、この図に見られるように、フラスコ内で肉眼的に塊が確認できるようになります。12日目には、細胞に給餌するために、培養フラスコ内の支持培地の量を2倍に増やし、より大きなLCLのクラスターが観察されます。通常、週に1回程度、培地が黄色に変化したときが、細胞を拡大させるために給餌し、培養液量を2〜3倍に増やす一般的なタイミングとなります。

完全RPMIを用いて、今後数週間にわたり75 cm²フラスコ内で培養液を70～100 mLまで拡大し、凍結保存用の細胞を調製します。この散布図に示されるように、CD 23陽性およびCD 58高発現細胞が存在することが、良好な結果の予測指標となります。EBV（エプスタイン・バーウイルス）への曝露から3～4日後の生細胞のうち、約2～3%がこのプロファイルを示します。EBV曝露後に観察されるCD 23陽性/CD 23陰性、CD 58陽性/CD 58陰性のその他のサブポピュレーションは、最小限の増殖しか示しません。また、未感染細胞または非不死化株のEBVに感染した細胞では、CD 23の高発現は見られません。

CD 58陽性細胞。これらの細胞は光学顕微鏡でも観察可能です。前述のとおり、Epstein-Barr virus感染から1週間以内に、フラスコ内で細胞の小さな塊が光学顕微鏡で確認されます。

時間が経過し、細胞がLCLへと分化するにつれて、顕微鏡レベルのクラスターはより大きくなり、フラスコ内で凝集塊が肉眼で確認できるようになります。以上です。このビデオを視聴することで、ヒト血液から末梢血単核細胞を分離し、ヒトB細胞からEpstein-Barrウイルス変換リンパ芽細胞株を樹立させる方法について十分に理解できたはずです。なお、リンパ芽細胞株の樹立については、他の研究室でも報告されています。

本プロトコルの利点は、B細胞にEpstein-Barr virusを感染させてからわずか3〜4日で、成功した結果を予測する方法を研究者に提供できる点にあります。