Name: 出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: 学ぶマウス出生後脳からオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養し、脊髄背根神経節ニューロンとの共培養で髄鞘形成を再現する方法。この技術は脱髄鞘疾患の研究と治療薬スクリーニングに有用です。

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このプロジェクトは、カナダの多発性硬化症協会からRKRWOへの助成金によって賄われていたカナダの多発性硬化症協会から学生の身分の受信者です。 SDRは、健康研究のカナダとカナダの研究所の多発性硬化症協会からポストドクトラルフェローシップの受賞者です。

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレポートは、OL -濃縮培養物または共培養DRGN / OLの分化のためにマウスOPCを単離するための方法を説明します。単独で培養した場合、OPCはMBPに分化する+ VEの OLSを、膜状のシートミエリンのように生産。神経突起ベッドをDRGNに追加すると、OLSはMBPとDRGNの神経突起を包む+ VEの膜を。このモデルは、OL​​を介した軸索ensheathmentを支配する複雑な基盤の調査に利益をもたらします。 大きな値の間に、そのような文化の確立が技術的に困難です。特に、要求の厳しい側面が効率的な組織の消化/解離、バランスの培地のpHの維持、およびDRGNメディアの変更が含まれています。消化の長さは、組織の量を消化し、粉砕の量は組織の解離の効果と終了結果に影響されていることを考慮することが重要です。それは、経験豊かな研究者のために解離神経系の組織から、低細胞の収率を得ることが珍しくありません。さらに、マウスOPCは、特にアルカリ性の条件下で、培地のpHの変化に敏感になる傾向があります。 8.5％CO 2で培養の維持は、OPCはより基本的にやや酸性条件に耐えるように見えるので、これを防ぐことを目的としています。給餌DRGNsに関しては、メディアの変更は神経細胞を乾燥させるようにすることを迅速に実行する必要があります、しかし、発展途上神経突起のベッドを混乱させないよう穏やかにする必要があります。突然のメディアの変化は、基板からの神経突起ベッド、およびカバースリップから、その完全な解離の可能性が高い結果が外れる。 このモデルシステムの潜在的なメリットは大きく、その技術的な要求の性質を目立たなくします。このシステムの利点の一つは、胚組織を採取するために繁殖の女性を犠牲にする必要性を回避して、細胞培養の導出のための産後のマウスの使用です。もう一つの利点は、OPCの拡大のための増殖因子のための要件の欠如（GFS）です。混合グリア培養物は、アストロサイト由来の栄養因子の存在のためにおそらくOPCは、の伝播をサポートする環境を提供しています。このようなニューロスフェアを7,8を介して導出などの他の方法は、、そのような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮成長因子（EGF）とOPCの拡大のための血小板由来増殖因子（PDGF）などのGFSの分裂促進特性に依存しています。同様に、出生後（P5 - 10）DRGNsのためのマウスを使用すると、神経成長因子（NGF）、胚DRGNs 9、10のin vitroでの生存のために必要な神経栄養因子と培地を補充する要件を回避することができます。それはDRGNs 4で培養した場合にマイナスOLSのmyelinating能力に影響を与えるとして、NGFの使用を避けることは興味深い。大規模で使用すると、これらの試薬は高価になるとGF添加培地の使用を避けることにより、また、経済的利益を持っています。 おそらく、この培養モデルの最も重要な利点は、このようにトランスジェニックマウス系統の多種多様なOPCはとDRGNs両方を導出する機会を提供し、マウスのみの組織からの派生です。これはDRGNおよび/または髄鞘形成を支配するOPC固有のプロパティの両方の研究が可能になります。これは、軸索のOLを介した髄鞘形成を調節する受容体/リガンド相互作用を解明するために特に重要になります。すべてでは、こ​​の手法は、髄鞘形成の根底にある分子の手がかりを知るため、そのアプリケーションが原因で神経科学の研究に関しては大きな価値があります。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 製品名 </td><td> 会社 </td><td> 製品番号 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>マルチセル</td><td> 319から005 - CL </td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液（HBSS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM） </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌） </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td>ポリ- L -リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2636 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td></tr><tr><td>人間merosin精製タンパク質（LN2） </td><td>ミリポア</td><td> CC085 </td></tr><tr><td>組換えラット毛様体神経栄養因子（CNTF） </td><td>ぺプロ</td><td> 450から50 </td></tr><tr><td> L -チロキシン</td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> GIBCO </td><td> 0080085 - SA </td></tr><tr><td>ウシインスリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -トリヨード- L -チロニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6634 </td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P8783 </td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7505 </td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン（FUDR） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0503 </td></tr><tr><td>パパインのソリューション</td><td>ワージントン</td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td>ロッシュ</td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L -システイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24ウェル組織培養皿</td><td> Cellstar </td><td> 662から160 </td></tr><tr><td>ベントキャップ付T25 -組織培養フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10cmの組織培養皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10cmペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 0875713 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics50μmのフィルター（オプション） </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td>ミエリン塩基性タンパク質（MBP）抗体</td><td> ABD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2抗体</td><td>ミリポア</td><td> AB5320 </td></tr><tr><td>ミエリン関連糖タンパク質（MAG）抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2&#39;、3&#39; -サイクリックヌクレオチド3&#39; -ホスホジエステラーゼ（CNP）抗体</td><td> Covance </td><td> SMI - 91R - 100 </td></tr><tr><td>アクチンパンAB - 5抗体</td><td>フィッツジェラルド</td><td> 10R - A106AX </td></tr><tr><td>ニューロフィラメント- 200（NF）抗体</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N4142 </td></tr><tr><td>チューブリンβ- 3チェーン（Tuj1）抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A11008 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 555ヤギ抗マウスIgG（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A21422 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 647ヤギ抗ラット抗体（IgG）（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A21247 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG（H + L）- HRP標識二次抗体</td><td> BioRad社</td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG（H + L）- HRP標識二次抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 2065 </td></tr><tr><td> 4&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9542 </td></tr></tbody></table>メディアのレシピ 100X OL -補足* <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 追加する量 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100mLの</td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02グラム</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td> 0.6mgの</td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td> 161 mgの</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td> 0.05mgの</td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -トリヨード- L -チロニン</td><td> 4mgを</td></tr></tbody></table> -80 * ° Cで保存250μL分注しT&quot;&gt; OLメディア <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 追加する量 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 mLの</td></tr><tr><td> 100X OL -サプリメント</td><td> 250μL </td></tr><tr><td>ウシインスリン（1 mg / mLの在庫から） </td><td> 125μL </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> 250μL </td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン（33 mg / mlストックから） </td><td> 37.5μL </td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> 500μL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125μL </td></tr><tr><td> CNTF（50 ng /μLの在庫から） </td><td> 25μL </td></tr></tbody></table> 混合グリア培養培地（DMEMで構成される） <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペン/咽頭（株式から0.33％） </td><td> 33ユニット/ mlペニシリン、33μg/ mlストレプトマイシン</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>一パーセント</td></tr></tbody></table> DRGN培地（DMEMで構成される） <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペン/咽頭（株式から1％） </td><td> 100単位/ mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン</td></tr></tbody></table>消化溶液のレシピ： OPCパパイン溶液（MEMで構成される） <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>パパインのソリューション</td><td> 1.54 mg / mLの</td></tr><tr><td> L -システイン</td><td> 360μg/ mLの</td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60μg/ mLの</td></tr></tbody></table> DRGパパイン溶液（HBSSで構成される） <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>パパイン</td><td> 1.54 mg / mLの</td></tr><tr><td> L -システイン</td><td> 360μg/ mLの</td></tr></tbody></table> DRGコラゲナーゼ溶液（HBSSで構成される） <table border="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td> 4 mg / mLの</td></tr></tbody></table>

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

OL開発の根底にある分子機構を同定することはOL生物学の知識を深めるには重要であるだけでなく、このような多発性硬化症（MS）などの脱髄疾患の病因を理解するための意味を持っています。携帯電話の開発は、一般的に一次細胞培養モデルで研究されている。初代培養細胞は、 生体内に存在する余分な変数の自由、制御された環境を提供することにより、所定の細胞型の評価を容易にする。ラット由来OLの文化がOL生物学への洞察の膨大な量を提供しているが、マウスからOLの文化を確立することで、同様の努力が大きな障害に満たされている。文化マウス一次OLSする方法を開発することは可能なトランスジェニックマウス系統を利用するために不可欠です。 げっ歯類の組織からOPCを抽出するための複数のメソッドは、ニューロスフェアの導出、差動接着精製と1-3免疫精製に至るまで、記載されている。多くのメソッドが成功を提供していますが、ほとんどは大規模な文化の時間および/または高価な機器/試薬を必要とする。これを回避するために、当初はマッカーシー＆デVellis 2で説明した方法の適応とマウス組織からOPCを精製することが好ましい。このメソッドは、新生児げっ歯類皮質由来する混合グリア培養液から物理的に分離するOPCを伴います。結果は、OLに富んだ文化に分化することができる精製したOPCの人口です。このアプローチは、その比較的短い文化時間や成長因子またはimmunopanning抗体の不必要な要件のために魅力的です。 精製された文化の中でOL発展のメカニズムを探ることは有益ですが、それは、髄鞘形成を評価するための最も生理学的に関連する環境を提供していません。ニューロンとの共培養のOLSは、軸索のOLを介した髄鞘形成を制御する分子的基盤への洞察を貸すだろう。多くのOL /ニューロンの共培養の研究については、後根神経節ニューロンは（DRGNs）選択肢のニューロンのタイプであることが証明されている。彼らは、抽出、混入細胞の最小限の量、そして緻密な神経突起のベッドの形成の容易さのため、OLSとの共培養に最適です。ラット/マウスmyelinating xenoculturesを用いた研究が4-6を公開されているが、出生後のマウス組織から共培養をmyelinatingなど/ OL DRGNの導出のための方法が記載されていない。ここでは、効果的に予想される結果の例と共に、そのような文化を生産する方法に関する詳細な方法を提示する。これらのメソッドは、OL開発/ myelinating機能に関連する質問に対処するために有用であり、神経科学の分野で有用なツールです。

この記事では、成熟オリゴデンドロサイト（OLS）を生成するために差別化初代培養におけるマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の豊かな集団を、導出する方法を説明します。さらに、この報告書はマウス後根神経節ニューロン（DRGNs）の神経突起ベッドの上にマウスのOPCを播種によってマウスmyelinating共培養を生成する手法を説明します。

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

こんにちは。オタワ大学およびオタワ病院研究機構の博士課程学生、ライアン・オマーラです。本プロトコルでは、マウスからオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮集団を調製する方法について説明します。これらの細胞は、単独で、あるいはマウス後根神経節ニューロンと組み合わせて分化させ、脱髄を伴わない髄鞘形成共培養系を構築することができます。まず、手順の概要から説明しましょう。新生マウスの皮質を解離させ、T 25フラスコに播種します。9日間の培養後、フラスコの底面にアストロサイトの単層が形成され、その上でオリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖します。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞を回収・精製し、濃縮培養によって成熟したオリゴデンドロサイトへと分化させることができます。髄鞘形成共培養を行う場合は、P5からP10のマウスの後根神経節ニューロンを、混合グリア培養とともに培養します。9日間かけて、これらのニューロンが密なニューライトベッドを形成し、その上にオリゴデンドロサイト前駆細胞を播種することが可能になります。これにより、オリゴデンドロサイトによるニューライトの巻き付きが可能となり、脱髄しない冷温培養が実現します。まず、P0からP2のマウスの全脳を氷冷したMEMに入れ、解剖顕微鏡へと移します。メスを用いて、各皮質の髄膜層を縦方向に切り込みます。次に、下層の皮質から髄膜を剥離します。続いて、脳の腹側を上にして、嗅球を除去します。腹側頭部と皮質が接する部分に深い縦切開を入れます。脳の背側を上にした状態で皮質を剥離し、その後、各皮質を約4等分に細かく切断します。皮質を、脳1個あたり350 µLの氷冷MEMを含む15 mLコニカルチューブに移します。同じ遺伝子型の脳を同じチューブにまとめます。例えば、脳4個の場合、1400 microlitersのMEMが必要になります。解剖が完了したら、まとめた脳を37 degreeのウォーターバスに3分間置きます。次に、滅菌済みの組織培養フード内で、P 1000ピペットチップを用いて脳組織を通過させ、より小さな断片に分断します。円錐チューブに、脳1個あたり75 µLの予熱したOPC Pap painを加えてください。その後、37 °Cの恒温水槽で20分間インキュベートします。その際、組織の凝集を防ぐため、2分ごとにチューブを転倒混和してください。インキュベーションが完了したら、混合グリア培養液 2 mL を消化液に加え、10 分間静置します。10 分後、組織懸濁液を 5 mL プラスチックチューブに分注します。チューブの数は、調製に使用する脳の数と一致させてください。火炎研磨したガラスパストゥールピペットを使用し、各チューブの内容物を、最初はゆっくりと、組織片が分離し始めたら徐々に強度を上げてトリチュレーションします。懸濁液中に目に見える組織塊がなくなったら、トリチュレーションを停止します。各チューブの内容物を、4 mLの混合グリア培養液が入った50 mLコニカルチューブに回収します。チューブを数回静かに転倒混和させた後、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに分注します。チューブの数は、調製に使用する脳の数と一致させてください。チューブを300 ×gで5分間遠心分離し、沈殿物を1 mLの混合グリア培養液で再懸濁します。各コニカルチューブの再懸濁細胞を、5 mLの混合グリア培養液であらかじめ平衡化したpoly-L-lysineコートT25フラスコに加えます。フラスコの数は、解剖した脳の数と同じにする必要があります。フラスコを37°C、8.5% CO2のインキュベーターで培養します。3～4時間後には、細胞が基材に接着します。しかし、培地中には多くのデブリが残存しており、これが細胞生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。これを避けるため、可能であれば3〜4時間後に新鮮な混合グリア培養培地に交換してください。この培地交換により、細胞残渣の多くが除去されます。翌日、フラスコの底に多くの細胞が確認できるはずです。3日目には、フラスコの底にアストロサイトの単層が形成されているはずです。この時点で、培地を4 mL除去し、新鮮な培地を4 mL添加することで、培地の3分の2を交換します。この工程は3日ごとに繰り返してください。6日目には、アストロサイトの単層が明確に観察され、その上でオリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖しているはずです。この時点で、インスリンを最終濃度 5 µg/mL になるように培地に添加してください。9日目になると、オリゴデンドロサイト前駆細胞をアストロサイト単層から分離できる状態になります。この操作を行うには、フラスコをオービタルシェーカーおよび5%CO2インキュベーターに設置します。フラスコを1時間置いて、インキュベーター内で温度・環境を順応させます。その後、細胞を50 RPMで45分間振盪します。このステップでは、緩く付着している多くの汚染細胞を除去します。すべての培地を除去し、4 mLの新鮮な培養培地を添加して、完全に培地交換を行います。フラスコを5%CO2インキュベーターに戻し、3時間かけて平衡化させます。3時間経過した時点で、培地の色を確認します。培地が赤色であれば、pHバランスが適切であることを示しています。色がオレンジ色や紫色に寄っている場合は、それに応じてインキュベーターのCO2濃度を調整してください。一晩の振盪中のオリゴデンドロサイト前駆細胞の生存には、pHのバランスを維持することが重要です。pHのバランスが整ったら、フラスコを220 RPMで約16時間振盪します。翌朝、シェーカーからフラスコを取り出し、フラスコ内の培地を10 centimeterの組織培養皿に移します。これらのディッシュは、差有的接着によってオリゴデンドロサイト前駆細胞をさらに精製するための手段として使用します。各ディッシュに2本のフラスコ分の培地を加え、5%CO2条件下で30分間インキュベートします。15分経過した時点で、オリゴデンドロサイト前駆細胞がプラスチックに接着するのを防ぐため、各ディッシュを軽く揺らしてください。30分間のインキュベーション後、位相差顕微鏡でディッシュを観察します。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、小さな細胞塊として確認できます。これらの細胞の一部は、ディッシュに付着している場合があります。ディッシュに接着しているオリゴデンドロサイト前駆細胞を、穏やかに撹拌して剥離させます。注意してください。撹拌しすぎると、混入している他の細胞型まで剥離してしまう可能性があります。細胞懸濁液を15 Milliliter円錐チューブに移し、300 Times gravityで5分間遠心分離します。P 1000ピペットチップを用いて、ペレットを穏やかに再懸濁します。続いてP 200ピペットチップを用い、血球計数計で細胞数を計測します。その後、精製したオリゴデンドロサイトをラミネートコートしたカバーガラス上に播種し、1日目から濃縮オリゴデンドロサイト培養へと分化させます。播種後、濃縮されたオリゴデンドロサイト前駆細胞は、わずか数本の突起を伸ばした比較的単純な形態を示します。3日目までに、分化中のオリゴデンドロサイトは、未熟なオリゴデンドロサイトを想起させる多数の突起を伸ばします。6日目までに、オリゴデンドロサイトはこの期間中のいずれかの時点で、髄鞘様の膜状シートを伸長させます。コースカバーガラスは、免疫細胞化学染色のために固定および処理が可能です。精製したオリゴデンドロサイト前駆細胞をラミニンコートしたカバーガラスに播種する代わりに、背根神経節ニューライトベッド上に播種することで、髄鞘形成共培養系を作製できます。次のセクションでは、これらの培養系を作製する方法について説明します。まず、P5からP10のマウスから脊髄全体を分離し、解剖用ハサミを用いて解剖顕微鏡下に移動させます。脊髄の腹側内側領域を縦方向に切開します。その後、先みのピンセットを用いて背根神経節（DRG）を慎重に摘出します。神経節をペトリ皿に入れたHank's平衡塩溶液に移します。DRGの根が極端に長い場合はトリミングします。P 1000ワイドボアピペットチップを使用してください。神経節を1.5 mL遠心チューブに移します。すべてのマウスの処理が終わるまで、チューブを氷上に保持してください。DRGの分離が完了したら、チューブを約300 ×gで遠心分離します。チューブを滅菌済みの組織培養フードに移し、上清を除去します。あらかじめ温めておいたDRG用パパイン液500 µLをチューブに加え、37 °Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。パパインによる消化が完了したら遠心分離し、パパイン溶液を除去します。予め温めておいた500 µLのコラゲナーゼA溶液を加え、37 °Cで10分間インキュベートします。遠心分離の手順を繰り返し、コラゲナーゼA溶液を1 mLのDRGN培地に置換します。最後の遠心分離ステップの後、1 mLのDRGN培地を加え、火炎滅菌したガラスパステールピペットで吸引します。最初はゆっくりと神経節を摩砕し、組織の解離が進むにつれて強度を上げていきます。組織の塊が見えなくなったら、細胞懸濁液を7 mLのDRGN培地を含むペトリ皿に移します。この皿を37 °C、8.5% CO2のインキュベーター内で1時間15分間培養します。このインキュベーション後、ペトリ皿を観察します。位相差顕微鏡下で、DRGニューロンは細胞体が大きい細胞として確認されます。多くの混入細胞はペトリ皿に強固に接着しているはずです。培地を15 mLコニカルチューブに移し、ディッシュを4 mLのDRGN培地で洗浄して、残りのニューロンを回収します。コニカルチューブを300 ×gで5分間遠心分離します。得られたペレットを500 µLのDRGN培地で再懸濁します。HEOサイトメーターを用いて細胞数を計測します。DRGニューロンのみをカウントするように注意し、1 mLのDRGN培地を用いて、直径12 mmのラミネートコートカバーガラス1枚あたり30,000〜50,000個のニューロンを播種します。その後、細胞を8.5% CO2組織培養インキュベーターに入れます。翌朝、DRGN培地を10 µMのFUD Rを添加したol培地で完全に交換します。その後、2日ごとにFUD rを添加したOL培地を用いて、培地の4分の3を交換します。1日目に位相差顕微鏡で観察すると、ニューロンがいくつかの突起を伸ばし始めていることがわかります。3日目には、ニューロンの突起が伸展しています。6日目には、多くの突起が互いに混ざり合った神経突起床が形成されています。9日目になると、この神経突起床の密度が高まり、混合脳培養を成長させることでオリゴデンドロサイトを受け入れる準備が整います。ニューロン培養と並行して、ニューロン培養の9日目にオリゴデンドロサイト前駆細胞を精製することが可能です。その後、それらを神経突起床の上に配置します。24ウェルプレートの各ウェルに50,000個の細胞を添加します。共培養の6日目には、オリゴデンドロサイトに類似した細胞がDRGニューロンと相互作用している様子が観察されます。これらの培養細胞は、これで固定し、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）に供することができます。濃縮されたオリゴデンドロサイト培養細胞をオリゴデンドロサイトマーカーに対する抗体で標識すると、NG2、MAG、およびMVPに免疫学的に陽性な細胞が認められ、ステージ特異的な形態を示します。これらの培養細胞は、当初はNG2陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞の集団として始まり、6日間の分化を経て、MAG陽性の成熟オリゴデンドロサイトを生成します。オリゴデンドロサイト濃縮培養物から得られたライセートを用いてSDS-PAGEを行ったところ、6日間のタイムコースにおいてオリゴデンドロサイトがCNPPおよびMVPを発現していることが確認できます。オリゴデンドロサイト添加前のDRGニューロンを観察すると、9日目には高密度のTaj1およびニューロフィラメント陽性のニューライトベッドが認められます。オリゴデンドロサイトとDRGニューロンの共培養6日目には、高倍率において、多くのMBP陽性オリゴデンドロサイトがニューロンのニューライトと相互作用している様子が観察されます。オリゴデンドロサイトが、髄鞘形成を想起させるMBP陽性膜でこれらの神経突起を包み込んでいる様子が見られます。デジタル拡大図では、ニューロフィラメント陽性突起に対するMBP陽性膜の重複範囲が示されています。こんにちは、私はオタワ病院研究センターの博士研究員のScott Ryanです。これらの手法により、マウスを用いたオリゴデンドロサイトとDRGニューロンの共培養系を構築することが可能になります。この手法は、実験的に誘発された脱髄疾患モデルおよびトランスジェニックモデルの両方の研究において有用です。また、新規治療化合物のスクリーニングにも有効です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。...

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出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

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