デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

本手順の全体的な目的は、GFP-Degron融合タンパク質を用いて生細胞内のプロテアソーム活性を測定することです。まず、DegronおよびDegronフレームシフト用のカスタムオリゴヌクレオチドをクローニングします。pEGFP-C1ベクターに組み込み、Vitrogen社のGatewayシステムの手順に従って処理した後、HEK 293 FT細胞を用いて各コンストラクトのウイルスを作製します。タイターを決定後、ウイルスで細胞を導入し、抗生物質による選択を行い、得られたGFP-DegronまたはGFP-Degronフレームシフト発現安定細胞を拡大培養します。

この手法を用いることで、蛍光信号の測定を通じて、特定の処理に対する細胞応答をモニタリングする実験が可能になります。例えば、エピ蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて、プロテアソーム活性を容易に評価できます。全細胞基質を用いたルミノジェニックまたはフルオロジェニックアッセイなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、生存細胞内でプロテアソーム活性を測定できる点にあります。トランスフェクションを行うには、まずリポ2000試薬 36 µLを 1.5 mLのDMEMで希釈します。別の15 mLファルコンチューブで、DNAコンストラクトを 1.5 mLのDMEMで希釈します。

5分後、2つの溶液を混合し、室温で20分間インキュベートします。次に、T 75フラスコ内のコンフルエントに達したHEK 293 FT細胞の培地を、7 mLのDMEMに交換します。その後、DNAリポ混合液をフラスコに加え、前後に揺らして混ぜ合わせます。

フラスコを5%CO2インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。翌日、培地を10 mLのDMEMに交換します。48時間後、上清を回収します。ウイルスを含む上清を0.45 µmのPVDFフィルターでろ過します。

ウイルスを濃縮するために、4容量の上清に1容量のPEG溶液を加え、時々転倒混和しながら4 °Cで2時間インキュベートします。遠心分離によってウイルスを回収し、白色ペレットの上の上清を吸引した後、再度遠心分離を行って残存しているPEG溶液を除去します。最終的なペレットをピペットでPBSに再懸濁し、20～30秒間激しくボルテックスします。

ウイルスの100 µL分注液を-80 °Cで保存します。U2 OS細胞を6ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートします。トランスフェクションのために、培地を8 µg/mLのPolybreneを含むDMEM 1 mLに交換します。1つのウェルをポジティブコントロールとして確保し、残りのウェルで一連のウイルス濃度を試験します。

翌日に一晩インキュベートします。培地を2 mLのDMEMに交換し、24時間インキュベートします。10 µg/mLのブラスチシンを用いて選択を開始し、2日ごとに抗生物質含有培地を交換し続けます。

約6〜7日後、非導入細胞の細胞死を確認します。その後、細胞を染色するため、PBSで3回洗浄します。クリスタルバイオレットを加え、室温で5〜10分間インキュベートし、染料を吸引除去した後、ウェルを2回二回蒸留水ですすぎ、プレートを風乾させます。

最後に、コロニー数をカウントし、ウイルス1 mLあたりのトランスフェクションユニットを算出します。ヒト二倍体線維芽細胞を6ウェルプレートに播種し、トランスダクション増強剤として8 µg/mLのPolybreneを添加します。

合計1mLの液量で、感染多重度（MOI）を2として用います。培地を交換します。翌日、培養細胞が70～80%コンフルエントになったことを確認します。

10 µg/mLで慢性的選択を開始します。数日かけて、細胞死が完了し選択が終了したことを確認しながらモニタリングします。GFP DERONまたはGFP Deron Frameshift融合タンパク質を発現する安定細胞株を樹立するため、安定的に導入された細胞を拡大培養します。まず、GFP DRONまたはGFP DRON frameshiftを保持する細胞を播種し、翌日のファクスの3時間前に準備します。

コントロール細胞をプロテアソーム阻害剤で処理します。PBSで2回洗浄し、0.5 millilitersのトリプシンを用いて細胞を回収します。トリプシン反応を停止させます。

4.5 millilitersの培地を使用し、細胞を15 milliliterのFalconチューブに移します。遠心分離により細胞を回収します。PBSで1回洗浄した後、ペレットを400 microliterのfax bufferで再懸濁します。細胞をfaxチューブに移し、氷上に置きます。

次に、フローサイトメトリーでサンプルを測定します。GFP Deron融合タンパク質は、即座に分解されるようプロテアソームを標的とする配列を持っています。対照的に、フレームシフト変異体であるGFP Deron FSは、プロテアソームによって分解されません。

したがって、GFP Deronを導入した、プロテアソーム活性が高いことが予想される若年ヒト由来線維芽細胞では、エピ蛍光顕微鏡下で低い蛍光シグナルが観察されます。一方、GFP Deron Frameshiftを導入した同一の細胞では、39.7%の細胞が陽性を示します。これらの細胞をプロテアソーム阻害剤llおよびLで処理すると、GFP Deron導入細胞とGFP Deron frameshift導入細胞の両方において、シグナルが増加し、最大で約63%に達します。

若年、中年、および高齢のドナーから単離した皮膚線維芽細胞における同様の測定では、若年個体と中年前ドナーの間でGFPシグナルの明確な増加が認められ、高齢ドナーから得られたサンプルにおいてプロテアソーム活性が低下していることが示されました。このビデオを視聴することで、レンチウイルス粒子の作製、細胞へのトランスフェクション、および生存細胞におけるプロテアソーム活性の測定方法について十分に理解できるはずです。