Name: の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶレーザー軸索切断システムの構築と調整法。C. elegansを用いて軸索再生を研究し、最小限の副次的損傷で正確な軸索切断を実現する低予算手法を解説します。

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本研究は、全米科学財団（National Science Foundation）、マクナイト神経科学基金（McKnight Endowment Fund for Neuroscience）、クリストファー・アンド・ダナ・リーブ財団（Christopher and Dana Reeve Foundation）、およびアメリシュア慈善財団（Amerisure Charitable Foundation）の支援を受けて行われました。

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li>
<li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li>
<li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Chem.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

異なるレーザーシステムを用いたレーザー微小手術については、いくつかの優れた議論がなされています3,5-11。フェムト秒IRレーザーは、細胞内レーザーアブレーションの「ゴールドスタンダード」であり12、イメージング設備と併用すれば便利ですが、個々のユーザーにとってコストが高すぎる場合が多くあります。イメージングの深さの関係でサンプルのイメージングにフェムト秒IRレーザーが必要な場合は、レーザー軸索切断（axotomy）にも同様のレーザーが必要になるでしょう。標的となる軸索が表面から30-50 um以内にある透明な組織であれば、高NA浸液レンズを用いて照射した20 uJ/pulse範囲の青色および緑色パルスレーザーで対応可能と考えられます。ナノ秒およびピコ秒レーザーでは、特に標的軸索の深さが増すにつれて、フェムト秒レーザーと比較して側副的な損傷が多くなります。C. elegansは透明であり、すべての軸索は表面から20-30 um以内にあります。我々は通常、表面から5 um以内にある運動軸索を切断しています。また、クチクラ表面から約20 umにある神経リング内の軸索も容易に切断できました。成虫の直径を通じた軸索切断の限界は約30-50 umであることがわかりました。ここで述べるレーザーアブレーションシステムは、透明性と標的軸索の深さという基準を満たす多くの異なる準備試料でうまく機能すると考えられます。それでも、フェムト秒IRレーザーの理論的な利点を考慮すると、ナノ秒およびピコ秒の355 nmおよび532 nmレーザーがC. elegansのレーザー軸索切断においてこれほど優れた性能を示すことは少々驚くべきことです6,13。ナノ秒440 nm、ナノ秒532 nm、およびフェムト秒IRレーザーによるレーザー軸索切断に対する軸索再生において、我々は差異を認めていません。
固体355 nm UVレーザーは、532 nmのダイオード励起パッシブQスイッチ固体レーザーとほぼ同等のコストですが、より高い出力、またはこれらの短波長を効率的に透過させる光学系を必要とします。ほとんどの光学系は、可視光の400-700 nmで良好に動作するように設計されています。355 nmレーザーを用いると、プラズマ閾値の低下やスポットサイズの縮小などの利点があり6、またロングパスダイクロイックミラーを使用することで、アブレーションレーザーを100%効率的にターゲットへ導き、サンプル信号を損なうことなくGFPの同時イメージングが可能になります。青色の440 nmレーザーは、可視光レーザーで動作させる利点（標準的な光学系での良好な性能と安全性）を維持できます。しかし残念ながら、現時点ではDPP Qスイッチ固体440 nmレーザーのコストは、同出力の355 nmまたは532 nmレーザーの3倍になります。ターゲットの深さが最小限であるC. elegans用の新システムを設計する場合、UV透過レンズ（355 nmで透過率50-70%の40X 1.3na油浸レンズでコストは約3,000ドル）と、1-20 kHzで5-10 uJ/pulseを出力する355 nmレーザーを選択します。
軸索切除は、プラズマの形成に起因すると考えられています。パルス幅を短くすると、より低い出力でプラズマ閾値に達し、プラズマ体積も小さくなります6。目的は、パルスエネルギーを最低出力に調整することで、最小かつ最短寿命のプラズマを生成することです。寿命の長い大きなプラズマはキャビテーション気泡を発生させ、周囲の細胞に損傷を与えます。一般的に、最高周波数（すなわち 2.5kHz）で約 50-100 パルスの切除を行うことが最良の結果をもたらすことがわかっています。これは、一連のパルスにわたって損傷を徐々に蓄積させることで、損傷範囲をより適切に制御できることを示唆しています。ここで説明するレーザー切除システムは、ビームが正確に整列され、拡大されていれば、非常に許容範囲が広いです。成虫の軸索切断は、レーザー出力 10%（2500 Hz で測定した平均 0.3 mW、推定 1 uJ/pulse）から開始し、14% の出力までであれば局所的な損傷を限定して切断することが可能です。15-39% のレーザー出力では損傷範囲が拡大するのが観察されますが、出力が 40%（2500 Hz で測定した平均 約 1 mW）を超えると、大きなキャビテーション気泡による影響とクチクラへの損傷により、虫体が破裂します。
Steinmeyerら（2010年）2の論文は、レーザーアブレーションシステムの構築における優れたリソースです。また、Leon Averyは、安価なN2ガス337 nmレーザーに基づいたレーザーアブレーションシステムの優れた実用的解説を掲載しており、非常に有用な実用的アドバイスを提供しています（elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/）。独自のシステムを設計する際は、まず顕微鏡の担当者に相談し、アブレーションレーザーをどのように顕微鏡対物レンズに導くかを決定する必要があります。顕微鏡は振動絶縁テーブル（Newport、TMI、Thorなど）に設置してください。ブレッドボード天板が最適ですが、マグネットポジションナーを使用すれば、強固なスチール製天板でも使用可能です。正立顕微鏡の専用中間モジュールを使用すると、すべての光学素子をそのまま配置できるため便利です。しかし、カメラポート（倒立顕微鏡）や、エピ蛍光ポートに取り付けた「コンバイナー」を使用する方が、費用を抑えられ、利便性が高い場合があります。使用予定の対物レンズの後方開口径と（アブレーションレーザーの波長における）透過率を把握しておく必要があります。レーザー（例：Crylas、TEEM、Crystal、CRCなど）を決定したら、適切な光学素子、ハードウェア、および安全装置の選定について、ThorまたはNewportに相談してください。本研究では、省スペース化のために二重ガリレオ式ビームエキスパンダーを採用しましたが、より単純なケプラー式エキスパンダーも選択肢となります（f2/f1＝拡大率）。カスタムのビームエキスパンダーが最も安価になりますが、NewportやThor、および複数のレーザーメーカーが高品質な市販のビームエキスパンダーを提供しています。一部のレーザーメーカーは、コスト効率が良く省スペースな手動または電子制御のアッテネーター（減衰器）も提供していますが、Glan-Thompson偏光子と半波長板ほどの汎用性はありません。また、レーザーの制御方法を決定する必要があります。LabViewベースのコントローラーを設計するか、市販のTTLジェネレーター、またはレーザー会社が提供するソフトウェアを使用できます。具体的なオプションについては、各レーザーメーカーと協議してください。
使用したハードウェアのリストは、あくまで一般的なガイドとして提供しています。ここに記載したシステムを既存のイメージングシステムに追加した際の費用は約$15,000でした。多くの場合、地域の物理学部などの専門部署に、フリービームレーザーを安全に取り扱うための実践的な導入を指導してくれる担当者がいるはずです。
C. elegansの固定およびタイムラプスイメージングのための代替手法が近年報告されています。14
トラブルシューティング
最も困難で重要なステップは、中心に合わせ展開されたビームを顕微鏡の光軸に整合させることです。ガリレイレンズを通してビームを中心させ展開させた後、ステアリングミラーを用いて最終的な中心合わせを行う前に、ビームを顕微鏡の光軸から5 um以内に整合させるよう努めてください。顕微鏡へのビーム整合にステアリングミラーを過度に使用すると、ビームエキスパンダーを通過する際の軸がずれてしまいます。細心の注意を払いながら、適切なNDフィルターでレーザービームを減衰させ、反射ターゲット（表面鏡）上でレーザービームプロファイルを直接観察します。顕微鏡を慎重に微動させ、60X対物レンズの視野内でビームを正確に中心に合わせます（上下の調整範囲内で中心に合わせられない場合は、レールの高さを調整する必要があります）。ビームプロファイルを用いて顕微鏡の光軸を正確に整合させ、中心に位置し、円形で対称的に「フレア」が生じているビームにします。フレアが非対称であることは、顕微鏡の軸が完全に整合していない（またはレールが水平ではない）ことを示しています。最後に、L3を調整し、ビームが均一かつ対称的に拡大・縮小することを確認します。顕微鏡をターゲット表面に正確にフォーカスさせ、次にL3を調整してレーザービームを最小のスポットに集光させます。これで、LSCMまたはCCDシステムで結像させた際にレーザービームが中心から5 um以内にあり、アブレーションスポットがZフォーカスから1um以内にあるはずです。
もし、虫が「破裂」したり、軸索を切断する際に大きなキャビテーション気泡が絶えず発生したりする場合は、多くの場合、アブレーションレーザーの微調整に問題があります。最小（&lt;500nm）のアブレーションスポットが、Z方向の焦点（L3レンズで収束を調整）およびXY方向のリファレンススポット（最後のキネマティックマウントミラーで調整）に正確に位置していることを確認してください。
表面に近い軸索を標的にする場合、必要となるレーザー出力は少なくなります。同様に、成体で同じ軸索を標的にする場合と比較して、より小型の個体（L1およびL2）で軸索切断を行うには、より少ないレーザー出力で済みます。
野生型の軸索が再生しない場合や、軸索の退色（ブリーチング）が起こる場合は、イメージング用レーザーの出力を下げるか、サンプリングレートを下げて試してください。線虫が死亡したり、不健康な状態になったりする場合は、アガロースの濃度を1%刻みで下げて調整してください。線虫をマウントした後は、カバーガラスを動かさないように注意してください。高濃度のアガロースとマイクロスフィアを使用している場合、カバーガラスを動かすことで線虫が死亡することがよくあります。
タイムラプス撮影中に線虫が破裂または死亡した場合、その原因は以下の通りです：1. アガロース濃度が高すぎる。2. アブレーションレーザーによるクチクラへの損傷。3. マウント後のカバーガラスの移動。クチクラへの損傷が原因である場合は、アブレーションレーザーの照射対象となったマウント個体のみに影響が現れます。
タイムラプス撮影中に線虫が動きすぎる場合は、アガロースの濃度を0.5%刻みで上げてみてください。健康な線虫の健康な軸索は常に「活性」しており、一定レベルの蛍光を示します。蛍光や活性が急激に低下した場合は、線虫が死にかけているか、あるいは死んでいます。複数の数珠状または断片化した軸索が見られるのは、線虫が死にかけているか死んでいる確実な兆候です。
タイムラプス撮影の全セッションを通じて軸索のフォーカスを維持できない場合は、いくつかの異なる原因が考えられます。まず、ガラススライド上の不活性サンプルを10時間かけて撮影し、ステージドリフトを確認してください。数 µm のドリフトは熱的不安定性に起因することがありますが、5 µm を超える場合は、顕微鏡の機械的な問題である可能性が高いです。また、マウントに関する問題の方が一般的です。タイムラプスを開始する前に、マウントした線虫を顕微鏡ステージ上で30分間静置させ、平衡状態にしてください。また、タイムラプスセッションの途中で、ワセリンによる密封部に漏れが生じていないかを確認してください。

<table><tbody><tr><td>試薬名</td><td>メーカー</td><td>カタログ番号</td><td>備考（任意）</td></tr><tr><td>535 nm レーザー</td><td>Crylas</td><td>FDSS532Q3</td><td>（TEEM、Crystal、CRC社からも同等のレーザーが提供されています）</td></tr><tr><td>すべての光学部品およびハードウェア</td><td></td><td></td><td>（Thor社からも同等の光学部品およびハードウェアが提供されています）</td></tr><tr><td>SUPREMA 光学マウント、直径 1.0-in</td><td>Newport Corp.</td><td>SS100-F2KN</td><td>2</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポスト、高さ 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポストフォーク</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>色消しゼロ次波長板、&amp;frac12; 波長遅延、400-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10RP52-1</td><td>1</td></tr><tr><td>回転ステージ、開口径 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>RSP-1T</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポスト、高さ 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポストフォーク</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>グランレーザー方解石偏光子、430-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10GL08AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>偏光子回転マウント</td><td>Newport Corp.</td><td>RM25A</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポスト用 &amp;#188;&quot; スペーサー</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.25</td><td>1</td></tr><tr><td>高さ &amp;frac12;&quot;、直径 1&quot; ポスト</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.5</td><td>1</td></tr><tr><td>フォーク、直径 1&quot; ポスト</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>ビームダンプ</td><td>Newport Corp.</td><td>PL15</td><td>1</td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズマウント</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-OBJ1</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポスト、高さ 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1&quot; ポストフォーク</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>高エネルギー Nd:YAG レーザーミラー、直径 25.4 mm、45&amp;#x00B0;、532 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10Q20HE.2</td><td>4</td></tr><tr><td>SUPREMA 光学マウント、直径 1.0 inch、クリアランス取付穴</td><td>Newport Corp.</td><td>SN100C-F</td><td>2</td></tr><tr><td>高精度ノブ調整ネジ、移動量 12.7mm、100TPI</td><td>Newport Corp.</td><td>AJS100-0.5K</td><td>4</td></tr><tr><td>ネジアダプタ、&amp;#188;-20 オス、8-32 メス</td><td>Newport Corp.</td><td>SS-1-B</td><td>2</td></tr><tr><td>直径 1.5 inch ロッド用ロッドクランプ</td><td>Newport Corp.</td><td>340-RC</td><td>2</td></tr><tr><td>ロッド、高さ 14 inch (35.5 cm)</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>1</td></tr><tr><td>X26用レールキャリア、正方形 40mm 長</td><td>Newport Corp.</td><td>CN26-40</td><td>4</td></tr><tr><td>スチールレール、長さ 384mm (15&quot;)</td><td>Newport Corp.</td><td>X26-384</td><td>1</td></tr><tr><td>直径 1.5 inch ロッド用ロッドプラットフォーム</td><td>Newport Corp.</td><td>300-P</td><td>2</td></tr><tr><td>ロッド、高さ 14 inch (35.5 cm)</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>2</td></tr><tr><td>平凹レンズ、直径 12.7mm、-25mm EFL、430-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPC025AR.14</td><td>2</td></tr><tr><td>平凸レンズ、直径 25.4mm、50.2mm EFL、430-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX082AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>平凸レンズ、直径 25.4mm、62.9mm EFL、430-700nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX085AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>固定レンズマウント、直径 0.5&quot;、軸高さ 1.0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-0.5</td><td>2</td></tr><tr><td>固定レンズマウント、直径 1.0&quot;、軸高さ 1.0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-1</td><td>2</td></tr><tr><td>マイクロスフィア 0.1um</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td>EEO matters</td></tr><tr><td>ムシモール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1523</td><td></td></tr></tbody></table>

の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 c.エレガンス</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

タイムラプス顕微鏡に続くレーザー軸索切断はCの軸索再生の表現型の高感度アッセイであるエレガンス1。このアッセイの主要な難しさは認知コスト（$ 25 - 100K）とレーザーアブレーションシステム2,3を実装するために必要な技術的専門知識です。しかし、控えめなコスト（&lt;$ 10K）の固体パルスレーザーは、ターゲットの軸索は、組織の表面に&quot;近い&quot;透明な製剤中のレーザーアブレーションのための堅牢な性能を提供することができます。システムの構築と配置は一日で達成することができます。アブレーションレーザーに焦点を当てたコンデンサーからの光が提供する光路は、便利な位置合わせガイドを提供します。削除されたすべての光学系との中間モジュールがアブレーションレーザーに専念しない光学素子は、レーザーアブレーションのセッション中に移動する必要はありませんことを保証することができます。中間モジュールのダイクロイックは同時イメージングとレーザーアブレーションすることができます。レーザービームtをセンタリングOは、焦点を絞った顕微鏡の集光レンズからの出射ビームは、システムの初期配置をガイドします。レンズの様々な条件に使用され、選択された対物レンズの背面に開口部を埋めるためにレーザービームを展開されています。最終的なアラインメントとテストは、フロント面のミラー化ガラスのスライドのターゲットで実行されます。レーザパワーは、最小サイズのアブレーションのスポット（&lt;1um）を与えるために調整されます。アブレーションのスポットは、イメージングのウィンドウで修正が十字カーソルに最後の運動学的にマウントされているミラーの微調整で中央に配置されます。軸索切断用レーザパワーは、ターゲットのスライド上の最小アブレーションスポット（これは、使用するターゲットと異なる場合があります）に必要なより高い約10倍になります。ワームは、アガロースパッド（またはマイクロ流体室4内）に取り付けてレーザー軸索切断とタイムラプスイメージングのために固定化することができる。アガロースパッドは簡単に電子レンジで溶かしたバランスのとれた食塩水で10％アガロースで作られています。溶融アガロースの液滴をガラススライド上に配置され、別の平坦化されパッドにスライドガラスは、厚さ約200ミクロン（隣接したスライド上に時間のテープの単層は、スペーサとして使用されます）。 &quot;シャーピー&quot;キャップは13mmの均一な直径の円形パッドを切り出すために使用されます。彼らは、その左側に横たわっているように、麻酔薬（1ULムシモール20mMの）とミクロ​​スフェア（クリス牙 - 円私信）（1UL 2.65パーセントポリスチレン水中0.1 UM）は指向3月5日ワームに続いてパッドの中央に追加されます。ガラスのカバースリップが適用され、その後ワセリンはカバーを密封し、試料の蒸発を防ぐために使用されます。

レーザー軸索切断に続くタイムラプスイメージングは、C. elegansにおける変異が軸索再生に及ぼす影響を評価するための感度の高い手法です。高品質かつ安価なレーザーアブレーションシステムは、ほとんどの顕微鏡に容易に追加することが可能です。15時間にわたるタイムラプスイメージングには、線虫を慎重に固定する必要があります。

の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス</em

レーザー軸索切断に続くタイムラプス顕微鏡観察は、C. elegansにおける軸索再生表現型の感度の高いアッセイである1。このアッセイの主な困難は...

この手順の全体的な目的は、CLガンの軸索再生を研究するためのレーザーアブレーションシステムの組み立ておよびアライメント方法を示すことです。まず、レーザーグランド、Thompson偏光子、半波長板、回転ミラー、ペリスコープレール、およびレールミラーをブレッドボードに取り付けます。次の手順では、レーザービームを顕微鏡コンデンサーレンズからの出射ビームに合わせてアライメントします。次に、レーザービームエクスパンダーレンズを取り付け、アライメントを行い、レーザービームを中央に配置して発散角をゼロにします。手順の最終ステップは、微調整を行ってレーザーアブレーションスポットを画像の焦点と一致させることです。最終的に、XY NCのアライメントが不完全な場合でも、回折限界レーザービームを用いることで、周囲の組織へのダメージを最小限に抑えながら、0.5 µmの軸索を精密に切断することが可能です。フェムト秒レーザーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、15,000という比較的低コストであることです。また、比較的メンテナンスが不要であり、非常に精密な軸索切断が可能です。この方法は線虫の軸索再生に関する知見を得るだけでなく、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、末梢神経系、およびin vitroの細胞などの他の系にも適用可能です。基本的には、表面から30〜50 µm以内にあるすべての細胞が対象となります。ブレッドボード上にコンポーネントを配置し、レーザーペリスコープポストと昇降レールサポートをボルトで固定することから始めてください。本システムでは、目に重大な損傷を与える可能性のあるクラス3Bレーザーを使用しているため、レーザー安全対策を徹底してください。フリービームレーザーを安全に使用する方法について、所属先の物理学科の担当者に相談してください。アライメント作業中は、常にレーザーを最低出力に設定してください。接眼レンズから覗く際は、レーザーが機械的にシャッターで遮断され、電源がオフになっていることを確認してください。次に、顕微鏡を配置します。まず、レール軸に合わせて位置決めを行います。次に、顕微鏡のコンデンサーレンズからの透過光ビームに合わせて調整します。最後に、レールに取り付けられた調節可能な絞りまたはレンズを使用して、レールの両端をコンデンサービームに合わせて調整します。作業を続ける前に、水準器とラボジャッキを使用してレールの高さを調整してください。レールの両端が揃っていることを確認します。次に、レーザービームがグランド、Thompson偏光子、および1/2波長板を通過しており、回転時にそれらの端に当たっていないことを確認してください。ハーフミラープレートを使用して、すべてのコンポーネントをブレッドボードに固定した状態でレーザー出力を調整します。レーザーの電源を入れ、パルス周波数を100の連続モードに設定し、ハーフミラープレートを用いて出力を最小限まで下げます。ポストイットまたはレンズペーパーを使用して、レーザービームを可視化してください。次に、ブレッドボードからレーザービームを上昇させます。レーザーから順に、キネマティックマウントされたミラーを調整および固定し、ビームを昇降レールの端に取り付けられたミラーまで導きます。完了後、レーザービームが各ミラーの中央付近に概ね整列し、顕微鏡の透過光ビームとレーザービームを光軸合わせする前の段階で、各ミラーがレーザービーム軸に対して概ね45度に配置されている必要があります。中間モジュールのNDフィルターおよび絞りをすべて取り外すか、開いてください。ここから、側副的な損傷を最小限に抑えつつ、軸索を精密に切断するための最も重要なステップに入ります。レーザー出力を最低に設定してアブレーションスポットを最小にし、x、y、z軸に合わせてレーザーを精密に調整します。レーザー光と透過光を、紙を背景にして同時に確認することができます。まず、顕微鏡ポートの近くに紙を配置します。次に、ペリスコープ上部のミラーとレールの端にあるミラーの粗調整を行い、レーザーの光軸調整を開始します。アライメント済みのコンデンサーレンズと開いた対物レンズ回転筒の間に紙を置きます。レールミラーの微調整を続け、レーザービームを透過光ビームの大きな中心に合わせます。その後、クランプで顕微鏡を固定します。レーザーのアライメント評価に関する追加の手順は、本文の原稿で確認してください。10 mm対物レンズの背面開口部を充填するために、300 µmのレーザービームを33倍に拡大させるデュアル・ガリレオ式ビームエクスパンダーを設置する必要があります。まず、4枚のレンズをキャリアに取り付けることから始めてください。次に、すべてのレンズが同一の光軸上にあり、かつレーザービームに対して完全に直交するように、レンズをレールに取り付けます。レーザーをオンにし、出力を最小に設定して連続モードにします。各レンズを通してビームの光軸を概略的に調整します。紙を用いてビームを確認します。次に、レーザーの電源を切ります。レーザーにセーフティシャッターを取り付け、レーザービームの光路から顕微鏡を退避させます。レーザーを再びオンにし、近くの壁で視認します。レンズの微調整を行い、ビームを拡大させます。次に、最後にある2枚のキネマティックマウントミラーを調整し、対物レンズの後方開口部の推定位置で、ビームが均一な明るさの円形になるように調整します。紙を用いてビームのサイズと均一性を確認します。次に、紙をレンズから遠ざけた際のビームサイズの変化に注意しながら、ビームを調整して収束をゼロにします。レーザーの電源を切り、メカニカルシャッターを閉じます。固定クランプを用いて正しいアライメントを定義し、顕微鏡をレーザービーム光路に戻します。顕微鏡のフリー側のクランプを取り付けますが、完全に締め付けないでください。これでレーザーを点灯させます。セーフティシャッターを取り外し、対物レンズ回転筒をオープンポジションまで回転させます。ステージ上に紙を置き、拡大され均一化されたレーザービームがコンデンサーからの透過光軸に中心合わせされていることが確認できる状態にします。中心がずれている場合は、顕微鏡のクランプを緩め、顕微鏡を慎重に動かしてビームの中心を合わせます。その後、セーフティシャッターを閉じ、レーザーをトリガーモードに設定してください。60倍の対物レンズをその場で回転させます。次に、ターゲットスライド上の表面の傷を撮影します。セーフティーシャッターを取り除き、アブレーションレーザーを作動させ、アブレーションスポットが最小になるようにレーザー出力を調整します。スポットは円形で、画像中心から5〜10 µm以内に位置している必要があります。これがアブレーションスポットとなります。キネマティックマウント付きレールミラーの微調整を用いて、スポットを中心位置に維持し、ビームプロファイルを均一にするために、レールマウントミラーと上部ペリスコープミラーを繰り返し調整する必要があります。フォーカスを1 µmステップで系統的に上下に移動させ、各ステップでアブレーションレーザーを作動させることで、レーザーのZフォーカスを評価してください。ビームが正しく拡張・整列され、収束が適切に調整されていれば、画像上の焦点でアブレーションが最大となり、焦点の 1 µm 上方または下方ではアブレーションが弱くなるか、あるいは全く起こらないはずです。最大アブレーションスポットが画像焦点の上方または下方に位置する場合は、ガリレオ望遠鏡のレンズ L3 を移動させて拡張ビームの Z 焦点の最終調整を行い、レーザーアブレーションを画像焦点と一致させます。線虫をカスタマイズしたスライドに固定し、構築したシステムを用いて軸索をアブレーションしたところ、レーザー外切除（Laser exosomy）および軸索再生のタイムラプスイメージングは非常に堅牢に実施できました。電動ステージを用いることで、5匹の異なる個体から得られた5本の軸索を、1枚のスライド上でルーチンかつ精密に切断および撮像することが可能であった。軸索の撮像時間が制限要因となった。約10%の実験で高品質なタイムラプス動画が得られました。残りの実験でもすべて良好なデータが得られましたが、固定から5〜8時間後に一般的に発生するワームのわずかなジッタリング（小刻みな動き）のため、視覚的な訴求力は劣っていました。本手順を試みる際は、x軸、y軸、z軸におけるレーザーのアライメントを正確に評価することが常に重要です。軸索を切断しようとする際に最も頻繁に起こる問題は、側副的な損傷や軸索を完全に切断できないことであり、これはほぼ常にレーザーの光軸がずれていることが原因です。このレーザーアブレーションシステムとc Againsにおける軸索再生の可視化手法を用いることで、あらゆる遺伝子変異が軸索再生に及ぼす影響を日常的に評価することが可能になります。NCL Agains。

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

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インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

学ぶレーザー軸索切断システムの構築と調整法。C. elegansを用いて軸索再生を研究し、最小限の副次的損傷で正確な軸索切断を実現する低予算手法を解説します。

の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス

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