の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス

この手順の全体的な目標は、CL gan の軸索再生を研究するためのレーザー アブレーション システムを組み立てて整列させる方法を示すことです。これは、最初にレーザーグランド、トンプソン偏光子、半波長板ターニングミラー、ペリスコープレール、レールミラーをブレッドボードに取り付けることによって達成されます。手順の次のステップは、レーザービームを顕微鏡コンデンサーレンズからの出射ビームに位置合わせすることです。

次に、レーザービームエキスパンダーレンズを取り付け、位置合わせし、レーザービームを中央に配置して発散をゼロにします。手順の最後のステップは、微調整を行うことにより、レーザーアブレーションスポットを画像の焦点と一致するようにすることです。最終的には、XY NCアライメントが不完全な場合、回折限界レーザービームを使用して、巻き添え組織の損傷を最小限に抑えてハーフミクロンの軸索を正確に切断することが可能です。

この技術の主な利点は、フェムトのセカンドレーザーのような既存の方法よりも、15, 000で比較的安価であることです。比較的メンテナンスフリーで、非常に正確な軸索切断を提供します。この方法は、ウミエルガンの軸索再生に関する洞察を提供するだけでなく、ハエ、ゼブラフィッシュマウス、末梢神経系、in vitro細胞などの他のシステムにも適用できます。

基本的には、表面から30〜50マイクロメートル以内にある任意の細胞です。ブレッドボード上に配置されたコンポーネントから始めて、レーザーペリスコープポストと高架レールサポートをボルトで固定します。このシステムは、目を傷つけやすいクラス3のBレーザーを使用していますので、レーザーの安全性には真剣に取り組んでいてください。

フリービームレーザーを安全に扱う方法について、地元の物理学部門の誰かに相談してください。アライメントプロセス中は常に、レーザーを最低出力に設定してください。接眼レンズを覗くときは、レーザーが機械的にシャッターされ、レーザーがオフになっていることを確認してください。

次に、顕微鏡を最初に配置して、レール軸に合わせます。次に、顕微鏡コンデンサーレンズからの透過光ビームに合わせます。第三に、レールに取り付けられた調整可能な開口部またはレンズを使用して、レールの両端をコンデンサービームに合わせます。

続行する前に、レベルジャッキとラボジャッキを使用してレールの高さを調整します。レールの両端が揃っていることを確認してください。次に、レーザービームがグランド、トンプソン偏光子、ハーフウェイプレートを通過し、回転してエッジに当たっていないことを確認します。

ハーフウェイプレートは、すべてのコンポーネントをブレッドボードに固定した状態でレーザーの出力を調整します。レーザーをオンにし、パルス周波数を100連続モードに設定し、ハーフウェイプレートを使用して電力を最小限に抑えます。付箋紙またはレンズ用紙を使用して、レーザービームを視覚化します。

次に、ブレッドボードからレーザービームを引き上げます。運動学的に取り付けられたミラーをレーザーから順番に調整して固定し、ビームを高架レールの端に取り付けられたミラーに持っていきます。終了したら、レーザービームをミラーのほぼ中央に合わせ、レーザービームを顕微鏡の透過光ビームに合わせる前に、ミラーをレーザービーム軸に対して約45度の向き

中間モジュールのNDフィルターと開口部をすべて取り外すか開きます。私たちは今、過度の巻き添え被害なしに軸索を正確に切断するための最も重要なステップを開始します。レーザーをX軸、Y軸、Z軸に最小のレーザー出力で正確に位置合わせして、アブレーションスポットを最小にします。

レーザーと透過光線は、紙に対して同時に見ることができます。用紙を顕微鏡ポートの近くに置いて開始します。次に、ペリスコープ上部のミラーとレールの端にあるミラーのコース調整を使用して、レーザーの位置合わせを開始します。

位置合わせされたコンデンサーレンズと開いた対物レンズの間に紙を置きます。レールミラーの微調整を続行して、レーザービームを大きな透過光ビームの中心に合わせます。次に、顕微鏡をクランプで所定の位置に固定します。

レーザーのアライメントを評価するための追加の手順は、書かれた原稿に記載されています。300ミクロンのレーザービームを33倍に拡大して10mm対物レンズの背面開口部を埋めるには、デュアルガリレオビームエキスパンダーを取り付ける必要があります。まず、4つのレンズをキャリアに取り付けます。

次に、レンズをレールに取り付けて、レンズがすべて同じ光軸にあり、レーザービームと正確に直交するようにします。レーザーをオンにし、最小電力と連続モードに調整します。各レンズを通るビームの位置合わせを大まかに調整します。

紙を使って梁を見てください。次に、レーザーをオフにします。レーザーに安全シャッターを取り付け、レーザービームの経路から顕微鏡を取り外します。

レーザーを再びオンにして、近くの壁に対して視覚化します。レンズの微調整を使用して、ビームを拡大します。次に、運動学的に取り付けられた最後の2つのミラーを調整して、対物レンズの後部開口部の推定位置でビームを均一な明るさの円に位置合わせします。

紙に対するビームのサイズと均一性を表示します。次に、用紙がレンズから遠ざかるにつれてビームサイズがどのように変化するかに注意して、ビームをゼロコンバージェンスに調整します。レーザーをオフにし、メカニカルシャッターをかみ合わせます。

固定クランプを使用して顕微鏡をレーザービーム経路にスライドさせて戻し、正しい位置合わせを定義します。clを元に戻しますamp 顕微鏡の自由側にありますが、締めないでください。次に、レーザーをオンにします。

安全シャッターを取り外し、ステージ上の紙を使用して対物砲塔を開いた位置に回転させると、コンデンサーからの透過光ビームを中心に拡大した均一なレーザービームが見えるはずです。中央に配置されていない場合は、顕微鏡クランプを緩め、顕微鏡を慎重に動かして、ビームを中央に配置します。次に、安全シャッターを作動させ、レーザーをトリガーモードに設定します。

所定の位置で60倍の目標を回転させます。次に、ターゲットスライドの表面の傷の画像です。安全シャッターを取り外し、アブレーションレーザーをトリガーし、レーザー出力を最小アブレーションスポットに調整します。

スポットは円形で、画像の中心、中心、アブレーション スポットから 5 〜 10 ミクロン以内である必要があります。キネマティックに取り付けられたレールミラーの微調整を使用してスポットを中央に置き、ビームプロファイルを均一に保つために、レールに取り付けられたミラーと上部ペリスコープミラーを繰り返し調整する必要があります。レーザーのZフォーカスを評価するには、フォーカスを1ミクロンステップで体系的に上下に動かし、各ステップでアブレーションレーザーをトリガーします。

ビームが正しく拡大され、位置合わせされ、収束が正しく調整されている場合、画像の焦点で最大限にアブレーションされ、焦点の1ミクロン上または下に弱いかまったくない場合にアブラブする必要があります。最大アブレーションスポットが画像焦点より上または下にある場合は、レーザーアブレーションが画像焦点と一致するまでガリレオ望遠鏡のレンズL 3を動かして、拡大ビームのZ焦点に最終調整を加えます。線虫はカスタマイズされたスライドに取り付けられ、構築されたシステムを使用して軸索をアブレーションしました レーザーエクソソミー 軸索再生のタイムラプスイメージングは非常に堅牢でした。

電動ステージを使用して、5つの異なる動物の5つの軸索を日常的かつ正確に切断し、画像化することが可能でした。1 枚のスライドで。軸索のイメージング時間が制限要因でした。

約10%の実験で高品質のタイムラプス動画が作成されました。残りの実験はすべて良好なデータを提供しましたが、一般的に5〜8時間の固定後に開始される線虫の小さなジッター運動のために、見た目は魅力的ではありませんでした。この手順を試行する際には、x、y、Z軸のレーザーの位置を正確に評価することが常に重要です。

軸索を切断しようとする人々が抱える最も一般的な問題は、巻き添え被害や軸索を完全に切断できないことであり、これはほとんどの場合、レーザーの位置がずれていることが原因です。このレーザーアブレーションシステムと、c Againsで軸索再生を視覚化する技術により、あらゆる遺伝子変異が軸索再生に及ぼす影響を日常的に分析することができます。NCLアゲインズ。