Name: パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶパッチクランプキャパシタンス測定法を用いて、網膜スライスにおける単一 bipolar cell 神経終末のリボン型シナプス機能を電気生理学的に解析する手法です。視覚神経科学の研究に応用可能です。

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私たちがラボでプロトコルを使用して起動するときに我々は、寒天包埋網膜スライス標本の彼の種類の説明については、博士フレッドリーケに感謝。我々はまた、回路図の概要と博士の図については、ローリVaskalisに感謝。テキストとビデオでの有益なコ​​メントVeeramuthuバラクリシュナンとSoyounチョ。この作品は、NEI - NIH RO1の助成金によって支えられて、そしてまた、部分的に韓国政府の資金による韓国学術振興財団の助成金によって支えられている[KRF - 2008 - 357 - E00032]。

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</ol>

我々は、開示することは競合する利害関係はありません。

我々のプロトコルで重要かつ困難なステップは、寒天溶液（プロトコル3.4）への網膜の一部の移転です。それは慎重に網膜の部分から硝子体液と残留スライスの溶液を除去し、歪みや曲がりなく、それを転送する必要があります。これを達成するために、我々は先端が網膜の位置を斜めに先端の鉗子（11251〜35、ファイン科学のツール）、と一緒に、90 °の角度を形成するために曲がって小さなヘラを（21 - 401 - 25B、Fisherbrand）使用スライスのソリューションで転送処理を通して作品。網膜のスライスとヘラの残留スライスのソリューションは、折り畳まれたまたは巻きキムワイプ（キンバリークラーク）の角で表面の軽くたたくように注意して除去することができます。 横網膜スライスを準備する別の一般的な方法は、フィルター紙ベースのプロトコル23です。簡単に言えば、全体の網膜の反転部分は、ミリポアフィルターのディスク（神経節細胞は、レイアウトの長方形の部分に接続されていますERろ紙、上向きに光受容体層）に対してと手動垂直&quot;親指&quot;ス...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>低ゲル化温度寒天</td><td>シグマ</td><td> A0701 </td><td>アガロース型VII - </td></tr><tr><td>パッチピペット</td><td>世界の精密機器</td><td> 1B150F - 4 </td><td>肉厚（1.5ミリメートル外径）ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>垂直プラー</td><td>ナリシゲ</td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td>歯科用ワックス</td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15003〜08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 °傾斜微細な先端の鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251〜35 </td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td> Personna </td><td></td><td>両刃、70％エタノールとH 2 Oで洗浄</td></tr><tr><td>円筒管</td><td> Fisherbrand </td><td> 03から338 - 1B </td><td>ポリエチレンのサンプルバイアル2.5ミリリットル</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>シグマ</td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td>ビブラトームスライサー</td><td>ライカ</td><td> VT1000SまたはVT1200S </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60倍の水浸対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>ソニー</td><td> XC - 75 </td><td></td></tr><tr><td>カメラコントローラ</td><td>浜松市</td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td>モニター&lt;/ TD&gt; <td>ソニー</td><td></td><td> 13&quot;白と黒のモニタ</td></tr><tr><td>シリンジフィルタ</td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2μmの</td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>サッターインストゥルメント</td><td> MPC - 200 </td><td></td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10アンプは、ソフトウェアエミュレーションを持っている</td></tr><tr><td>回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡</td><td>横河電機</td><td> CSU - X1 </td><td>パッチクランプホールセル記録後に細胞イメージングを生きる</td></tr><tr><td> Slidebookソフトウェア</td><td>インテリジェントイメージングインスツルメンツ（3iの） </td><td></td><td>イメージングデータ収集と分析</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrostスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>スライドガラス</td></tr><tr><td>退色防止剤</td><td> Biomedaコープ。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> LSM 710 </td><td>固定組織のイメージング</td></tr><tr><td>へら</td><td> Fisherbrand </td><td> 21から401 - 25B </td><td></td></tr><tr><td>マヌエル垂直スライサー</td><td>ナリシゲ</td><td> ST - 20 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン488 BAPTA - 1 </td><td>インビトロジェン</td><td> O - 6806 </td><td>のCa 2 +感受性蛍光色素</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 555ヒドラジド</td><td>インビトロジェン</td><td> - 20501MP </td><td>蛍光染料</td></tr></tbody></table>

パッチクランプキャパシタンス測定とca 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

視覚刺激は、脊椎動物の網膜の専門ニューロンによる光の強度と周波数の変化の広いダイナミックレンジにわたって検出され、搬送される。網膜神経細胞、光受容体と双極細胞の2つのクラスは、長期間にわたって持続的かつ高スループットの神経伝達物質の放出を可能にするリボン型アクティブゾーンを、使用することによってこれを実現する。光刺激に対する脱分極との混合ロッドと錐体視の入力を受け取る金魚の網膜のON型の混合双極細胞（Mb）の端末は、サイズが大きいため、両方のリボン型シナプス（〜10-12の研究に適していますμmの直径）とアマクリン細胞の樹状突起との数多くの側面と相互シナプスの接続に。パッチクランプ法と金魚網膜スライスにおけるMbの双極細胞の端末へのダイレクトアクセスは、シナプス前のCa 2 +電流、膜容量の変化、およびGABAによって仲介相互シナプスフィードバック阻害の測定を可能にする&lt;サブ&gt; AおよびGABA C受容体は、端末上で表明した。エキソサイトーシスのシナプス前膜の容量測定は1つが興奮性神経伝達物質の放出14,15の短期可塑性を調べることができます。さらに、アマクリン細胞から抑制性神経伝達物質放出の短期的および長期的な可塑性はまた、Mbの端子21に到達する相互フィードバック阻害の記録によって調査することができます。時間の短い期間（例えば〜10秒）以上、アマクリン細胞からのGABA作動性相互フィードバック阻害は、GABA小胞プールの枯渇11を介してペアパルスうつ病を受ける。網膜の内網状層における網膜マイクロ回路のシナプスダイナミクスは、このように直接研究することができる。 脳スライスの技術は40年以上前に導入したが、神経細胞の電気的特性の調査のためにまだ非常に便利です、両方とも単一の細胞体、単一の樹状突起や軸索、およびmにしたicrocircuitシナプスのレベル19。スライスチャンバーに直接接着するには小さすぎる組織は、多くの場合、最初寒天に埋め込 ​​む（またはろ紙上に配置）し、20、23、18、9スライスされています。このビデオでは、我々は金魚の網膜を使用してプリ埋め込み寒天法を採用しています。金魚の網膜の私達のスライスに巨大な双極細胞の一部の端子は、スライス手順の間に（軸索カット）axotomizedされています。 axotomized端子から録音が相馬樹のコンパートメントからの信号を除外するため、これは、私たちは、単一のシナプス前神経終末の入力を分離することができます。別の方法として、また、スライス作業中に切断されていない軸索に接続された端末から記録することで、無傷のMbの双極細胞から記録することができます。全体的に、この実験的なプロトコルの使用は、網膜シナプス生理学、マイクロ回路機能解析、およびリボンシナプスにおけるシナプス伝達の研究に役立ちます。

ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

視覚刺激は、脊椎動物の専門化したニューロンによって、光強度の広いダイナミックレンジおよび周波数の変化にわたって検出され、伝達されます。

本手順の全体的な目的は、前シナプス側双極細胞神経終末に位置するマイクロ回路の研究のために、アガロース埋込み網膜スライスを調製することです。まず、暗順応させたキンギョの眼から網膜を取り出し、その網膜から小さな長方形の断片を切り出します。次に、この網膜断片を透明で低融点のアガロース溶液に浸し、適切な低温のスライス溶液中で固化させます。次のステップでは、ビブラトームを用いて、網膜の矩形片を含む固体アガロスのブロックをスライスします。最終ステップでは、可視化、同定、およびパッチクランプを行います。双極細胞の神経終末をクランプしてください。最終的に、霧化および無傷の両極細胞終末からの膜容量測定により、シナプス前カルシウム電流とシナプス物理的エキソサイトーシスが示されます。こんにちは、ハン・キムです。バーナム研究所のPCOラボのポストドクターです。本日は、金魚の冷 facial retina（顔面網膜）のAGA埋没切片作成法を紹介し、単一パイプラインでのパッチクランプ容量測定を実演します。まず、スプリングシザーを用いて目の前面を均等に切り、金魚の眼球を半分に分割します。次に、カルシウムを含まない冷却切片溶液にアイカップを浸します。必要に応じて、ピンセットで水晶体を除去します。次に、45度角度付き微小鑷子を用いて網膜を眼球から剥離させ、網膜に付着している網膜色素上皮層を除去します。その後、微小鑷子またはスプリング鋏で視神経を切断します。次に、改造したパスタピペットまたは大容量チップ転送ピペットを用いて吸引します。網膜を取り出すために、網膜に付着している残りの色素上皮を慎重に除去します。洗浄され、健全な状態の網膜表面は滑らかに見えるはずです。次に、分離した網膜を約0.03%のIDEで室温にて15～30分間処理します。硝子体を除去する際、この操作は低照度下で行う必要があることに注意してください。次のステップでは、カミソリで湾曲した端を取り除き、網膜の全層を含む約2 mm × 2 mmの長方形の網膜片を切り出します。次に、網膜片をアガロース溶液を満たした小型容器に移します。この際、液体アガロースに網膜を配置する際に、網膜周囲の溶液量を最小限に抑えるようにしてください。続いて、アガロースと共に網膜を氷冷したスライス溶液に直接浸し、アガロースを凝固させます。次に、長方形の網膜片を含む凝固したアガロースブロックを、1 cm × 1 cm × 1 cmの立方体に切り出します。ブロックをprecoスライスチャンバー内のスライスプレート表面に接着します。次に、氷冷したスライス溶液中で、ブロックを200〜250 µmの厚さにスライスします。ビブラトームを使用することで、合計5〜10枚のスライスを得ることができ、これらは約5〜6時間生存可能です。その後、スライスの1枚を記録チャンバーに移します。ナイロン糸のグリッドが付いたU字型の白金製フレームをスライスの上に置きます。カーボゲンでバブリングした記録液を、毎分1〜2 mLの速度でスライスに持続的に灌流させます。このステップでは、0.2 micronフィルターチップ付きのシリンジを使用して、ガラスパッチピペットに内部溶液を注入し、ピペットの背面から1〜2 cmの高さまで満たします。その後、チップから気泡を取り除きます。ピペットをホルダーに固定します。ピペットに陽圧をかけ、マイクロマニピュレーターを用いて、チップをスライス方向へ下げながら目的の末端へと移動させます。チップと一緒にスライスが引きずられないよう、ピペットを側方に掃くように動かしてください。その後、ピペットチップを末端の周囲に動かし、膜表面を洗浄します。チップを端子の端に押し付けてディンプルを作成し、正圧を解除します。すぐにギガオームシールが形成されない場合は、ピペットにわずかな負圧をかけます。ギガオームシールが形成されたら、EPC-9パッチクランプアンプをオンセル記録モードに切り替え、保持電位を-60 mVまたは-70 mVに変更します。高速キャパシタンス補正を適用し、シール抵抗が 5 ～ 10 GΩ の間で安定するまで待ちます。その後、鋭く緩やかな吸引を行い、細胞膜を破裂させます。これにより、ホールセル記録構成を確立します。シリンジの代わりにマウスサクション（口吸い）を使用することも可能です。アトマイズされたMB端子にホールセル構成が確立された後、-70 mVから0 mVまで200ミリ秒のステップ脱分極を適用します。この脱分極の前後に、ボルテージクランプモードで2 kHzの正弦波が適用されることに留意してください。膜容量を測定するため、この脱分極により、セシウムベースの内部溶液を用いて、電圧依存性L型カルシウムチャネルの開口によって活性化される内向きカルシウム電流を直接測定することが可能になります。並行して、シナプス小胞のカルシウム依存性エキソサイトーシスによって膜表面積が増加し、それに伴う容量跳躍（capacitance jump）をモニタリングすることが可能です。もし、無傷のMB双極細胞のシナプス末端をピペットでパッチクランプした場合、MB双極細胞のギャップ結合によるカップリングに起因する大きなリーク電流があるため、識別可能なカルシウム電流は観察されません。そこで観察されるのは、大きな外向きのリーク様電流です。しかしながら、図示された脱分極ステップの前後で活性化させた高周波正弦波刺激を用いて、キャパシタンスの跳躍をモニターすることが可能です。ここでは、M双極細胞終末の画像であるI-R-D-I-Cの例を示します。AおよびBに示すように、正常な終末は楕円形に見えやすく、一方でCは、円形に見える崩壊した終末を示しています。色素充填法を用いて細胞終末を分類することも可能です。ここでは、Dに軸索が温存された、eに軸索が部分的に切断された、Fに軸索が完全に除去されたMBI双極細胞終末の蛍光画像の例を示します。それぞれの終末は青色の矢印で示されています。ここでは、カルシウムイメージング信号によるエキソサイトーシスと抑制性フィードバックの直接測定結果を示します。MB二極細胞終末において、電圧クランプステップ脱分極によりMB終末のテレリアにおける一過性のカルシウム濃度上昇が活性化されました。対応するMBテレリアの蛍光画像はBに示されています。神経伝達物質放出の短期的なシナプス抑制の例はCに示されています。この手順を行う際は、網膜をキットアガーに配置する際に網膜周囲の溶液量を最小限に抑えることが重要です。これにより、アガーブロックへの固定状態が向上します。

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

ここでは、電気生理学的記録のためのマウスの網膜の暗順応のスライスを生成するための手順を説明します。...

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

このビデオは、フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプ技術を示しています。電極付きの薄いガラスピペットを使用して、網膜内のスターバーストアマクリン細胞(SAC)にアプローチします。シールを形成した後、吸引を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞パッチクランプ構成を形成します。最後に、SACシナプス受容体を通るイオンの流れは、この構成を使用して測定されます。...

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

このビデオでは、脳スライスを固定し、ピペットを配置して全細胞構成を実現し、シナプス前ニューロンを刺激してシナプス後応答を記録することで、ニューロンの接続性を解明する手順を示しています。...

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。...

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。...

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

8時間 - 身体から取り出されると、神経組織を大幅に6後の組織の最終的な劣化につながる、環境条件によって影響されます。密接に監視し、組織の細胞外の環境を調節する独特の培養方法を用いて、組織生存率を有意に&gt; 24時間延長することができます。...

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。...

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

人工網膜には、視覚を発生させる能力があります。新しいプロテーゼの開発を進めるためには、移植前にデバイスを試験する ex vivo...

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

動的クランプ電気生理学は、ニューロンの発火障害とイオンチャネル機能障害との間の因果関係を確立できます。マウス小脳プルキンエニューロンにおける動的クランプ法とプロトコルについて説明し、有用なリソースと技術的考慮事項に注目します。代表的な研究では、モデル化されたナトリウムコンダクタンスを Tsc1-/-...

自閉症に関連するニューロンの興奮性障害を調査するための動的クランプ法

学ぶパッチクランプキャパシタンス測定法を用いて、網膜スライスにおける単一 bipolar cell 神経終末のリボン型シナプス機能を電気生理学的に解析する手法です。視覚神経科学の研究に応用可能です。

パッチクランプキャパシタンス測定とCa^{2 +イメージング}

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