パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング
January 19th, 2012
ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。
この手順の全体的な目的は、シナプス前双極細胞神経終末に位置する微小回路の研究のために、寒天に埋め込まれた網膜スライスを準備することです。これは、最初に暗く適応した金魚の目から網膜を取得し、この網膜の小さな長方形の部分を切断することによって達成されます。次に、網膜片を透明で低融点の寒天溶液に浸し、次にそれを良好なコールドスライス溶液で固化させます。
次のステップは、バイブレーターを使用して、網膜の長方形の部分を含む固体寒天ブロックをスライスすることです。最後のステップは、視覚化、識別、パッチ適用です。双極細胞の神経終末をクランプします。
最終的に、結果は、噴霧された無傷のバイポーラ細胞末端からの膜容量測定によるシナプス前カルシウム電流とシナプス物理的エキソサイトーシスを示しています。こんにちは、私の名前はハン・キムです。私はBurham Instituteの研究室のPCOでポスドクをしています。
今日は、冷たい顔面網膜のAGA埋め込みスライス調製を紹介し、単一のパイプラインでのパッチクランプ容量測定を実演します。この手順を開始するには、春のハサミで目の前を均等に切って、金魚の各目を半身にします。次に、アイカップをカルシウムを含まない冷やしたスライス溶液に入れます。
必要に応じて、ピンセットでレンズを取り外します。次に、45度の角度の先端細鉗子のペアで網膜をアイカップから剥がすことにより、網膜に付着した色素上皮を取り除きます。その後、細い鉗子またはスプリングハサミで視神経を切断します。
次に、改造されたパスタピペットまたは大きなチップトランスファーピペットで吸引を適用します。網膜を切除するには、網膜に付着している色素上皮の残りの部分をそっと除去します。きれいで健康な網膜の表面は滑らかに見えるはずです。
次に、分離された網膜を約0.03%高いIDEで室温で15〜30分間処理します。硝子体液を除去するには、この手順を暗い場所で行う必要があることに注意してください。次のステップでは、かみそりの刃で湾曲したエッジを取り除いて、網膜の全厚さを含む約2 x 2ミリメートルの長方形の網膜を切り取ります。
次に、レチナールピースを寒天溶液で満たされた小さな容器に移し、液体寒天に入れるときに網膜の周りの溶液の量を最小限に抑えようとします。その後、寒天を固化するために、網膜を寒天に直接氷冷スライス溶液に浸します。次に、網膜の長方形の部分を含む固体寒天ブロックを1つずつセンチメートルの立方体にカットします。
ブロックをプレコスライスチャンバーのスライスプレートの表面に接着します。次に、氷冷したスライス溶液でブロックを200〜250ミクロンの厚さのスライスにスライスします。ビブラートを使用すると、合計5〜10スライスが得られ、約5〜6時間生存できます。
その後、スライスの1つを記録チャンバーに移します。スライスの上にナイロン糸のグリッドが付いたU字型のプラチナフレームを配置します。カルボゲンで泡立った記録溶液を使用して、1分あたり1〜2ミリリットルの速度でスライスを連続的に灌流します。
このステップでは、0.2ミクロンのフィルターチップを備えたシリンジを使用して、ガラスパッチピペットにピペットの背面から1〜2センチメートルのレベルまで内部溶液を充填します。その後、先端から気泡を取り除きます。ピペットをホルダーに固定します。
ピペットに正圧を加え、マイクロマニピュレーターを使用して、チップをスライス内で下向きに動かしながら、ピペットを目的の端子に向かって動かします。ピペットを横方向に動かして、スライスが先端と一緒に引っ張られないようにします。次に、ピペットの先端を端子の周りで動かして、メンブレン表面を清掃します。
先端を端子の端に対して下に押してくぼみを作り、陽圧を解放します。ギガオームシールが形成されていない場合は、すぐにピペットにわずかな負圧を加えてください。ギガオームシールが形成されたら、E PC 9パッチクランプアンプをオンセル録音モードに切り替え、保持電位をマイナス60またはマイナス70ミリボルトに変更します。
高速キャパシタンス補正を適用し、シールが5〜10ギガオームの間で安定するのを待ちます。次に、鋭く穏やかな吸引で膜を破裂させます。全細胞記録構成を確立するため。
注射器の代わりにマウスサクションを使用することもできます。アトマイズされたMB端子に全セル構成が確立されたら、マイナス70ミリボルトからゼロミリボルトまで200ミリ秒のステップ脱分極を適用します。この脱分極の前後に、電圧クランプモードで2キロヘルツの正弦波が印加されることを覚えておいてください 膜容量を測定するために、脱分極は、セシウムベースの内部溶液を備えた電圧依存性L型カルシウムチャネルの開口によって活性化される内向きのカルシウム電流を直接測定することを可能にします。
並行して、シナプス小胞のカルシウム依存性エキソサイトーシスによって引き起こされる静電容量のジャンプを監視することができ、これにより膜表面積が増加します。無傷のMBバイポーラ細胞をシナプス末端のピペットでパッチすると、MBバイポーラ細胞のdo権のギャップ結合結合による大きなリーク電流のために、識別可能なカルシウム電流は観察されません。観察されるのは、電流のような大きな外部漏れです。
ただし、示されている脱分極ステップの前後に活性化される高周波正弦波刺激を使用して、静電容量ジャンプを監視することはできます。以下は、I-R-D-I-Cの例、Mバイポーラ細胞端末の画像です。無傷の端子は、AとBに示すように楕円形に見える可能性が高くなりますが、Cは丸くて円形に見えるミスド端子を示しています。
染料充填法は、細胞末端の分類にも使用できます。以下は、Dに無傷の軸索、eに部分的に切断された軸索、Fに完全に除去された軸索を持つMBIバイポーラ細胞末端の蛍光画像の例です。ここでは、カルシウムイメージングシグナル、エキソサイトーシス、および抑制性フィードバックの直接測定を示します。
MBバイポーラ細胞端末では、MB端末のテレリアにおける一時的なカルシウム濃度の上昇が、電圧クランプステップの脱分極によって活性化され、対応するMBテレリアの蛍光画像はB.B.神経伝達物質放出の短期的なシナプス抑制の例をC.に示しています。この手順を試みながら、 網膜をキット寒天に入れるときに、網膜の周りの溶液の量を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。これにより、寒天ブロックからのLatinizedの取り付けが改善されます。
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概要
この記事では、シナプス前双極細胞神経末端のマイクロ回路を研究するのに適したアガー埋め込み網膜切片の調製プロトコルについて説明しています。この方法により、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録が可能になり、網膜回路におけるリボン型シナプスの研究を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 電気生理学
- イメージング技術
背景
- 網膜マイクロ回路は視覚処理において重要な役割を果たしています。
- シナプス機構の理解は神経科学研究に不可欠です。
- アガー埋め込みは薄い切片に構造的サポートを提供します。
- パッチクランプ技術により、精密な電気測定が可能になります。
研究目的
- 電気生理学的分析のための網膜切片の調製。
- リボン型シナプスの機能の研究。
- 網膜マイクロ回路力学の理解を深めるため。
使用された方法
- 暗順応したゴールドフィッシュの眼からの網膜の取得。
- 低融点アガーへの網膜片の埋め込み。
- 振動ブレードを使用した固体アガーブロックの切片化。
- 双極細胞神経末端の可視化とパッチクランプ。
主要な結果
- アガー埋め込み網膜切片の成功した調製。
- 直接パッチクランプ記録の実現可能性が実証されました。
- 網膜回路におけるリボン型シナプスの同定。
- この方法によりシナプス機能の詳細な研究が可能になりました。
結論
- このプロトコルは網膜マイクロ回路を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 直接パッチクランプ記録によりシナプスダイナミクスを明らかにすることができます。
- このアプローチは視覚神経科学の研究を進展させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct electrophysiological and optical interrogation of presynaptic nerve terminals in retinal microcircuits, supporting mechanistic de-risking of synaptic targets involved in visual signal processing. By quantifying calcium-dependent exocytosis and inhibitory feedback at ribbon-type synapses, it provides predictive confidence in target validation for neuroscience discovery programs. The approach addresses a key inflection point in early discovery where functional validation of presynaptic mechanisms informs go/no-go decisions for modulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring presynaptic calcium currents and capacitance changes linked to vesicle exocytosis.
- Operational Value: Enables biological de-risking of ribbon-type synapse function through direct access to isolated nerve terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying short-term plasticity of excitatory and inhibitory neurotransmitter release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by stabilizing retinal slices for electrophysiology and imaging.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible membrane capacitance and calcium imaging readouts enabling compound effect comparison.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple terminals per slice, enhancing throughput for synaptic mechanism interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with retinal neurodegenerative disease models where synaptic dysfunction precedes cell loss.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by preserving native microcircuit architecture in agar-embedded slices.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on modulator efficacy by capturing reciprocal feedback inhibition dynamics from amacrine cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing functional readouts of presynaptic activity in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of presynaptic mechanisms via direct measurement of calcium influx and exocytosis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable terminal access for repeated recordings.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions using membrane capacitance jumps and calcium imaging as dependent variables.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by preserving synaptic microcircuits in retinal slices for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing synaptic function across multiple experimental sessions per preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in presynaptic signaling.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized agar embedding and slicing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative data on synaptic plasticity and feedback inhibition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds modulating presynaptic calcium channels or vesicle release machinery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch-clamp electrophysiology and calcium imaging techniques.
- Depends on vibratory slicing equipment and low-melting-point agar for tissue stabilization.
- Necessitates cross-team standardization for consistent slice quality and terminal identification.
- Involves adaptation considerations when transferring to other model systems with different synaptic architectures.
- Limited by tissue viability window of 5–6 hours post-slicing, requiring same-day experimental execution.
