胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで

この手順の全体的な目的は、発生中のドーパミン作動性ニューロンを解析するために、E 12.5 胚の中脳から器官培養スライスを作製することです。まず胚の脳を解剖し、次にその脳を低融点アガロースに包埋することでこれを達成します。

第3のステップは、バイブレーターを用いて脳切片を作成することです。最終ステップでは、培養およびタイムラプスイメージングに適した脳切片を選択します。最終的に、タイムラプスイメージングと免疫蛍光顕微鏡法を用いて、ドパミン作動性ニューロンの初期段階、遊走挙動、および分化を明らかにします。

この手法は、発達中の腹側脳におけるニューロンの追跡や移動挙動の観察など、神経発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。解剖の前日に1X Krebs緩衝液を調製し、培養基は解剖の約2時間前に調製してください。Krebs緩衝液を用いて4%低融点アガロース溶液100 mLを調製します。電子レンジで加熱し、アガロースが完全に溶解するまで溶解させてください。

次に、arosを45°Cの恒温水槽に入れます。続いて、Vibramバッファトレイに氷冷したKrebsバッファーを満たします。冷却エレメントのスイッチを入れ、4°Cに維持します。

その後、ブレードキャリアにカミソリ刃を固定します。後で振動切片機（バイブレーター）内から切片を回収してセクショニングを行うため、メス、細い絵筆、および小型の穴あきスプーンを用意します。次に、滅菌済みのペトリ皿にKrebs緩衝液を加え、氷上に保持します。

解剖エリアにて、解剖用の大きな滅菌シャーレ3枚と、埋め込み用の小さな滅菌シャーレ2枚、小型の鋏1本、精細ピンセット2本、小型の穴あきスプーン、先端を丸く火 polishing 処理したガラス製パステールピペット、および氷上の Krebs buffer 1 Lを準備します。すべての解剖器具を70% ethanolで拭いてください。次に、6ウェルプレートの各ウェルに培地を加え、37 °Cで2時間インキュベートします。

次に、滅菌条件下で、別の6ウェルプレートの各ウェルにペニシリン・ストレプトマイシンを含むKrebs緩衝液を1.5 milliliters加えます。ウェルにミリセルメンブレンインサートを設置します。脳切片をフィルターメンブレン上に移せるよう、6ウェルプレートをバイブレーターの隣に配置します。

切片作成後すぐに、胚がステージ E 12.5 の妊娠マウスを安楽死させ、ピンセットで子宮を持ち上げて摘出します。次に、別のピンセットを使用して子宮から子宮筋層を引き剥がします。その後、子宮を顕微鏡下の氷冷 Krebs バッファー中に置きます。

微細ピンセットを用いて、子宮の筋壁、リカー膜、および内胚葉卵黄嚢を胚から分離します。次に、胚を子宮から取り出し、滅菌済みのKrebs緩衝液を入れた別のペトリ皿に移します。続いて、各胚の頭部を切り離します。

細いピンセットを用いて、目の高さで頭部を貫通させて固定します。別のピンセットを使用して、皮膚と頭蓋骨を注意深く除去します。その後、脳を慎重に持ち上げ、滅菌済みのKrebs緩衝液が入ったペトリ皿に移します。

その後、脳を4% Low melting point agaroseで洗浄します。一度に2〜3個の脳を、新鮮な4% Low melting point agaroseに埋没させます。この際、先端を火炎研磨したパスツールピペットを使用してください。

次に、包埋用ディッシュをできるだけ水平に氷上に置きます。続いて、アロスが底まで凝固するまで脳を持ち上げ、脳が均等に沈降し、アロスブロックの底面と平行になるようにします。アロスが完全に凝固したら、脳の周囲のアロスをトリミングします。

その後、ブロックを振動切片機の試料ステージに接着します。ブロックを接着する際は、脳の腹側がプラットフォームと平行になるようにしてください。周波数 50 hertz、刃の振幅 1.1 millimeters、速度 25 millimeters per second の条件で、厚さ 300 micron の水平切片を作成します。

細い筆を使用してスライスをミニ穴あきスプーンに押し込み、脳スライスを回収します。次に、顕微鏡下で、滅菌済みの氷冷Krebs緩衝液が入ったディッシュにスライスを移します。腹側中脳組織を含むスライスを選択してください。

このステップでは、ミニ穴あきスプーンと細い絵筆を使用して、脳切片を事前に準備したKrebs緩衝液が入った6ウェルプレート内のミリセル膜インサートに転送します。次に、切片が載った膜を培養液を入れた別の6ウェルプレートに転送します。この際、膜の上面を乾燥した状態に保ち、脳切片が下方から培養液を、上方から空気を供給されるようにしてください。

スライスを5% carbon dioxide、37 °Cに設定したインキュベーターに入れます。解剖の最初のステップから2時間以内にスライスをインキュベーターに入れることが非常に重要です。これらのスライスは、in vitroで3〜4日間維持することが可能です。

4〜5時間の回復後、スライスをタイムラプスイメージングに使用できます。イメージングの直前に、光毒性からスライスを保護するため、200 millimolar アスコルビン酸を1.5 µL、ディッシュに添加します。

タイムラプス撮影の間、スライスを37 °C、5% 二酸化炭素の環境チャンバー内でインキュベートします。ここでは、前脳への投射がまだ発達していない、腹側中脳におけるドーパミン作動性ニューロンの正常な位置を示す急性スライスを示します。培養1日後、黄色い矢印で示されるように、前脳への投射が形成され始めます。

白い矢頭は、挿入図で高倍率で示されている細胞体の位置を示しています。ここでは、YFPで標識されたニューロンの遊走ルートを示します。急性水平切片において、細胞の初期位置を赤色の矢頭で示しています。

このビデオを視聴することで、生存可能で完全な切片を得るために、E 12.5の海洋胚中脳から遺伝型切片を調製する方法について十分に理解できるはずです。胚脳の解剖を慎重に行うこと、およびビブラトームによる切断後に、培養およびタイムラプスイメージングに適した正しい脳切片を選択することが重要です。