細胞運命を以下に E大腸菌の
October 14th, 2011
この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します E大腸菌の細菌、顕微鏡下での感染の結果に続く、感染結果の分析。
この手順の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用して、ファージラムダによる感染後に大腸菌の硫酸塩をリアルタイムで追跡することです。まず、ファージラムダの粗溶解物を作成します。次に、ファージを精製し、チューブ内のファージラムダによって大腸菌に感染させます。
顕微鏡下で細菌細胞の運命を追い続けます。最終的には、細胞の成長または死に関連するさまざまな蛍光タンパク質の発現を通じて、大腸菌のさまざまな細胞脂肪を結果としてリアルタイムに示すことができます。一般に、この方法の1つのチェックは、精製されたフロントとラベル付けされたFIストックの作成にあります。
調製および精製中のイチジクの共有を避けるために、顕微鏡下でのイメージングパラメータを最適化して、健康な細胞増殖を接種できるようにします。E 3 92ラムダLZの一晩の培養物LBMに1つのPPL星D。細胞密度がOD 600の約0.6の培地は、摂氏42度のウォーターバスシェーカーでライゲンを誘導します。
溶解が明らかになるまで、摂氏37度でインキュベートを続けます。文化が明確になります。次に、2%クロロホルムを加え、室温で15分間インキュベートします。
次に、ファージ溶解物を250ミリリットルのボトルに移し、培養物を遠心分離します。次に、ファージ粒子を含む上清を回収し、2回目の遠心分離を行って、標準的なファージ滴定プロトコルで目に見える破片を除去します。ファージ濃度を測定し、塩化セシウムグラジエントを介してファージを精製し、DPIで活性をアッセイしてaroスラブを調製します。
6枚の顕微鏡スライドを70%エタノールで洗浄します。図のように5枚のスライドを並べ、テープで固定します。次に、1.5%アロスの溶液を中程度に注ぎ、固定されたスライドに注ぎます。
最後のスライドを上に配置し、気泡を避けます。上に重りを置き、AROSを約30分間冷まします。側面にある4枚のスライドを取り外し、スライドのスラブをラップで包みます。
形質転換細菌を接種物として一晩培養し、LBMMペレットで1ミリリットルの細菌を培養して蘇生させます。細胞を20マイクロリットルの氷冷に懸濁します。幅広のピペットチップを備えたLBMM。
精製ファージを20マイクロリットル加えます。穏やかに混合し、最初に氷上で30分間インキュベートして、ファージが吸収されるようにします。その後、摂氏35度のウォーターバスで5分間
。ファージDNA注入をトリガーするには、任意の細胞凝集体を混合して分離します。混合物を1〜10にLBMMに希釈します。次に、LBMアグロスラブを配置します。
カバースリップに、ファージ細胞混合物を1マイクロリットル加えます。吸収されたら、別のカバースリップを上にそっと置きます。まず、初期時間枠のYFPチャネルを介して画像セットを取得します。
200ナノメートルのZ軸間隔で15枚の画像を撮影します。さらに、位相差とmチェリーチャンネルを通じて1枚のピントの合った画像を撮影します。その後、感染後の細胞の運命をタイムラプス動画で撮影します。
タイムラプス動画中の漂白および光毒性を最小限にするために、タイムポイント画像につきチャンネルごとに1つのZ位置画像を使用し、サンプルは時間内に位相差のあるYFPおよびMチェリーチャネルを、約4時間10分間隔で使用します。手動でファージをカウントする画像解析を開始し、ファージの位置と細胞長も記録します。最初の時間枠では、溶解性、溶解性、または非感染性の細胞運命を記録します。
また、タイムラプス動画を再生して溶解時間やその他の必要な情報を文書化し、自動細胞認識と系統追跡アルゴリズムを使用して、個々の細胞の蛍光レベルなどのより定量的な情報を抽出します。通常、蛍光標識されたファージのプラークは野生型のプラークよりも有意に小さく、精製に成功したファージのYFPおよびDAPIシグナルは共局在化します。これらのデータは、位相差YFPおよびMチェリーチャネルの画像セットと、タイムラプス動画の対応する重ね合わせ画像を組み合わせたものです。
個々のファージは、最初の時間枠ではっきりと見えます。ここでは、2つの細胞がそれぞれ1つのファージに感染し、1つの細胞が3つのファージに感染していることがわかります。通常、細胞表面には多数のファージが見られますが、他のファージは吸収されません。
時間が経つにつれて、感染結果は区別可能になります。80分後、単一のファージに感染した2つの細胞は、それぞれ溶解経路に入りました。新しいファージの細胞内産生により、3つのファージに感染した細胞は、プレモーターからのmチェリーの産生によって特徴付けられる溶解性経路に入りました。
このビデオを見れば、ファージラムダによってe co細菌に感染するための精製ファージストックを作成する方法、および顕微鏡下でリアルタイムにライフスタイルイメージングを行う方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、蛍光標識されたバクテリオファージラムダの調製方法と、大腸菌への感染、および蛍光顕微鏡下で感染結果をリアルタイムで観察する方法について説明しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 微生物学
- ウイルス学
- 蛍光顕微鏡
背景
- バクテリオファージラムダは、ウイルス感染プロセスを研究するためのモデル生物です。
- 蛍光標識により、ファージと宿主細胞との相互作用を可視化できます。
- リアルタイムイメージングは、感染後の細菌細胞の運命に関する洞察を提供します。
- これらの相互作用を理解することで、より広範なウイルス学および微生物学研究に情報を提供できます。
研究目的
- バクテリオファージラムダによる大腸菌の感染を観察するためのプロトコルを開発すること。
- 蛍光顕微鏡を用いてファージ感染中の細菌細胞の運命を分析すること。
- ファージ感染のダイナミクスをリアルタイムで記録すること。
使用された方法
- バクテリオファージラムダの粗抽出物の調製。
- セシウム塩化物勾配遠心分離によるファージ粒子の精製。
- 精製されたファージを用いた大腸菌の感染とその後のイメージング。
- 細菌細胞の運命とファージのダイナミクスを監視するためのタイムラプス顕微鏡。
主要な結果
- リアルタイムイメージングにより、溶解性、溶菌性、または未感染の異なる細胞の運命が明らかになりました。
- 蛍光信号は、ファージ感染と複製の成功を示しました。
- 蛍光レベルの定量的分析により、細胞の健康状態に関する洞察が得られました。
- 感染結果は、個々の細胞に感染するファージの数に基づいて変化しました。
結論
- 開発された方法により、大腸菌におけるファージ感染の詳細な観察が可能になります。
- 蛍光顕微鏡は、リアルタイムでウイルスダイナミクスを研究するのに効果的です。
- 得られた洞察は、ファージ生物学と細菌相互作用の理解に貢献できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Real-time tracking of cell fate in E. coli after phage lambda infection provides a high-resolution model for dissecting binary cell fate decisions, directly informing target validation and mechanistic de-risking in microbial systems. This approach enables quantitative, single-cell analysis of infection outcomes, supporting predictive confidence at early discovery and screening inflection points. The methodology is broadly relevant for biopharma teams seeking to understand host-pathogen interactions and optimize translational model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of cell fate decisions at the single-cell level, clarifying mechanistic pathways.
- Supports functional target validation by distinguishing lytic versus lysogenic outcomes in real time.
- Facilitates biological de-risking by quantifying infection parameters and outcomes across multiple events.
- Improves predictive confidence for pathway interrogation and model selection.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, fluorescence-based readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions for reproducible measurement of infection outcomes.
- Enables high-content, quantitative analysis of cell fate for compound or genetic screening.
- Supports scalability and platform reuse through automated imaging and analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns infection outcome metrics with disease-relevant model systems for translational continuity.
- Provides quantitative biomarkers of infection state for preclinical validation studies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking mechanistic insights to phenotypic outcomes.
- Supports predictive de-risking in microbial and host-pathogen research portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through screening and preclinical model validation, enabling seamless data flow and decision-making across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tracking infection fate at single-cell resolution.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers high-content measurements and statistical outputs for comparing infection conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning infection outcomes with model system relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse microbial and host-pathogen studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fate analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of infection assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of microbial and infection-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to automated imaging platforms and computational analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols and data processing.
- Adaptation may be needed for different bacterial strains or phage systems.
- Photobleaching and phototoxicity must be managed during time-lapse imaging.
