細胞運命を以下に
2011年10月14日
この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します E大腸菌の細菌、顕微鏡下での感染の結果に続く、感染結果の分析。
本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて、ファージλ（ラムダ）による感染後のE. coliにおける硫酸塩の挙動をリアルタイムで追跡することです。まず、ファージλの粗ライセートを調製します。次に、ファージを精製し、チューブ内でE. coliにファージλを感染させます。
顕微鏡下で細菌細胞の運命の追跡を継続します。最終的に、細胞の増殖または死滅に関連する異なる蛍光タンパク質の発現を通じて、E. coliにおける異なる細胞運命をリアルタイムで示すことができます。一般的に、この手法における一つの検証事項は、精製されたフロントおよびラベル付きFIストックの作成です。
調製および精製の過程で凝集が起こるのを避けるため、また健全な細胞増殖を可能にするため、顕微鏡下のイメージングパラメータも最適化してください。E 3 92 Lambda LZ one PPL star Dのオーバーナイト培養液をLBM培地に接種します。細胞密度がOD 600で約0.6に達した時点で、42 °Cのウォーターバスシェーカーを用いてライソゲンを誘導します。
溶菌が認められるまで37 °Cでインキュベーションを継続します。培養液が透明になります。次に2%クロロホルムを加え、室温で15分間インキュベートします。
次に、ファージ溶解物を250 milliliterボトルに移し、培養液を遠心分離します。その後、ファージ粒子を含む上清を回収し、標準的なファージタイター法に従って、2回目の遠心分離を行い可視的なデブリを除去します。ファージ濃度を測定した後、塩化セシウム密度勾配によりファージを精製し、aroスラブの作製に向けてDPIで活性を測定します。
6枚の顕微鏡スライドを70% ethanolで洗浄します。5枚のスライドを図のように配置し、テープで固定します。次に、培地に含まれる1.5% aros溶液を固定したスライド上に注ぎます。
気泡が入らないように注意しながら、最後のスライドを一番上に重ねます。その上に重りを置き、AROSを約30分間冷却します。側面の4枚のスライドを取り除き、スライドの塊をラップで包みます。
形質転換細菌のオーバーナイト培養物を接種源として、LBMMで培養し、細菌を1 mL分ペレット化して再懸濁します。ワイドピペットチップを用い、氷冷した20 µLのLBMMに細胞を懸濁します。
精製したファージを20 µL添加します。穏やかに混合し、まず氷上で30分間インキュベートしてファージを吸着させます。その後、35 °Cのウォーターバスで5分間インキュベートします。
ファージDNAの注入を誘導するため、混合して細胞凝集体を分離させます。この混合液をLBMMで10倍に希釈します。次に、LBMアグロ平板に配置します。
カバーガラス上に、ファージ細胞混合液を1 µL加えます。吸収させた後、別のカバーガラスを上からそっと被せます。まず、初期時間枠のYFPチャンネルを通じて画像セットを取得します。
Z軸方向に200 nanometer間隔で15枚の連続画像を撮影します。加えて、位相差およびm cherryチャネルを用いて、ピントが合った画像を1枚撮影します。その後、感染後の細胞運命に関するタイムラプス動画を撮影してください。
タイムラプス動画撮影中の退色と光毒性を最小限に抑えるため、各チャンネルおよび各タイムポイントにつき単一のZ位置画像を使用し、位相差、YFP、およびmCherryチャンネルで約4時間にわたり10分間隔でサンプルを撮影します。まず、ファージの手動計数から画像の解析を開始し、あわせてファージの位置と細胞長を記録します。初期の時間枠において、溶菌性、溶原性、または非感染という細胞の運命を記録してください。
また、タイムラプス動画を再生することで溶菌時間やその他の必要な情報を記録し、自動細胞認識および系統追跡アルゴリズムを用いて、個々の細胞における経時的な蛍光レベルなどの定量的な情報を抽出します。通常、蛍光標識したファージのプラークは野生型よりも著しく小さくなり、正常に精製されたファージのYFP信号とDAPI信号は共局在します。これらのデータは、位相差、YFP、およびM cherryチャネルの画像セットと、タイムラプス動画から得られた対応するオーバーレイ画像を組み合わせたものです。
初期の時間枠では、個々のファージがはっきりと見えます。ここでは、単一のファージに感染した2つの細胞と、3つのファージに感染した1つの細胞が観察されます。通常、いくつかのファージが細胞表面に付着している一方で、他のファージは吸着されていない状態で観察されます。
時間の経過とともに、感染の結果に差異が現れます。80分後、単一のファージに感染した2つの細胞は、それぞれ溶菌サイクルに入っています。一方で、細胞内で新しいファージが産生される中、3つのファージに感染した細胞は、プレモーターからのmCherryの産生によって示される溶原サイクルに入っています。
このビデオを視聴することで、ファージλを用いて大腸菌を感染させるための精製ファージストックの作成方法と、顕微鏡下でのリアルタイム・ライフスタイルイメージングの実施方法について深く理解することができます。
概要
本記事では、蛍光標識したバクテリオファージλの調製法および大腸菌（E. coli）への感染について解説し、蛍光顕微鏡下で感染結果をリアルタイムに観察する方法について説明します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- ウイルス学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- バクテリオファージlambdaは、ウイルス感染プロセスの研究におけるモデル生物です。
- 蛍光標識により、ファージと宿主細胞との相互作用の可視化が可能になります。
- リアルタイムイメージングは、感染後の細菌細胞の運命に関する知見を提供します。
- これらの相互作用を理解することは、より広範なウイルス学および微生物学の研究に役立ちます。
研究目的
- バクテリオファージλによるE. coliの感染を観察するためのプロトコルを開発する。
- 蛍光顕微鏡を用いて、ファージ感染時における細菌細胞の運命を解析する。
- ファージ感染のダイナミクスをリアルタイムで記録する。
使用された手法
- バクテリオファージlambdaの粗ライセートの調製。
- 塩化セシウム密度勾配遠心法を用いたファージ粒子の精製。
- 精製したファージによるE. coliの感染およびその後のイメージング。
- 細菌細胞の運命とファージのダイナミクスを観察するためのタイムラプス顕微鏡観察。
主な結果
- リアルタイムイメージングにより、溶菌性、溶原性、または非感染という明確な細胞運命が明らかになりました。
- 蛍光シグナルにより、ファージの感染と複製が成功したことが示されました。
- 蛍光レベルの定量分析により、細胞の状態に関する知見が得られました。
- 感染の結果は、個々の細胞に感染したファージの数によって異なりました。
結論
- 開発された手法により、E. coliにおけるファージ感染の詳細な観察が可能になります。
- 蛍光顕微鏡法は、ウイルスのダイナミクスをリアルタイムで研究するのに有効です。
- 得られた知見は、ファージの生物学および細菌との相互作用の理解に寄与します。
よくある質問
産業界における重要性
ファージλ感染後のE. coliにおける細胞運命のリアルタイム追跡は、二極的な細胞運命決定を分析するための高解像度モデルを提供し、微生物システムにおける標的検証およびメカニズムのリスク低減に直接的に寄与します。このアプローチにより、感染結果の定量的なシングルセル解析が可能となり、初期の探索およびスクリーニングの転換点において予測の信頼性を高めることができます。本手法は、宿主・病原体相互作用の理解および翻訳モデルシステムの最適化を目指すバイオファーマのチームにとって広く有用です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 単一細胞レベルでの細胞運命決定の直接観察を可能にし、メカニズム的な経路を明らかにします。
- 溶菌的経路と溶原的経路の結果をリアルタイムで区別することで、機能的ターゲットの検証をサポートします。
- 複数のイベントにわたる感染パラメータと結果を定量化することで、生物学的なリスク低減を促進します。
- 経路の解析およびモデル選択における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けた、検証済みの蛍光ベースの読み出し系を構築します。
- 感染結果を再現性高く測定するために、アッセイ条件を標準化します。
- 化合物または遺伝的スクリーニングにおける、細胞運命の高コンテンツ定量分析を可能にします。
- 自動画像取得および解析パイプラインを通じて、スケーラビリティとプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的な連続性を確保するため、感染結果の指標を疾患に関連するモデルシステムと整合させます。
- 前臨床検証研究において、感染状態の定量的なバイオマーカーを提供します。
- メカニズム的な洞察を表現型のアウトカムに結びつけることで、リスク調整後の進展決定を可能にします。
- 微生物および宿主・病原体研究ポートフォリオにおける予測的なリスク軽減をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期探索からスクリーニング、そして前臨床モデルでの検証までを統合し、研究開発（R&D）の全過程におけるシームレスなデータフローと意思決定を可能にします。
- 探索生物学：単一細胞レベルでの感染運命を追跡することで、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価のための、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：感染条件を比較するためのハイコンテンツ測定および統計的アウトプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：感染結果をモデルシステムの関連性と整合させることで、探索研究と前臨床検証を橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用：多様な微生物および宿主-病原体研究に利用可能な、再利用可能なイメージングおよび分析プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞運命解析における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：感染アッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値：堅牢で定量的なデータを提供することにより、go/no-go判断および資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：微生物および感染症関連プログラムのリスク調整後の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- 蛍光顕微鏡法および定量的な画像解析の専門知識が必要です。
- 自動画像撮影プラットフォームおよび計算解析ツールへのアクセスが求められます。
- 感染プロトコルおよびデータ処理について、チーム間での標準化が必要です。
- 異なる細菌株やファージシステムに合わせて調整が必要な場合があります。
- タイムラプス撮影中は、光退色および光毒性を管理しなければなりません。
