Name: 細胞運命を以下に E大腸菌の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡を用いた大腸菌へのバクテリオファージλ感染のリアルタイム観察法。ライソゲニーとリシス経路の細胞運命解析により、ウイルス感染動態を可視化し、微生物学・ウイルス学研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々はマイケルFeissとファージの作成と精製に関するガイダンスジャンシッピーに感謝しています。我々は、細胞認識ソフトウェア、Schnitzcellを提供するためのマイケルElowitzに感謝します。 、ウェルチ財団（助成Q-1759）とヒューマン·フロンティア·サイエンス：ゴールディングラボの仕事は国立衛生研究所（R01GM082837）、国立科学財団（生きている細胞の物理学研究センター082265、PFC）からの補助金によってサポートされていますプログラム（RGY 2008分の70）。

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

菌株、ファージ及びプラスミド： ひずみLE392はsupFです。それは（詳細については表1を参照）は、ファージゲノム中SAM7突然変異を抑制するために選ばれました。溶菌経路を選択した感染細胞が意志としてこのように、誘導され溶原は、最終的に、ファージ粒子を溶解し、解放します。溶原性細胞は30℃で栽培されている℃のファージゲノム中857アレルCI温度感受性の存在に起因する。熱誘導後、GPD-EYFPおよび野生型GPDは、λLZ1のゲノムおよびプラスミドpPlate * Dのそれぞれから同時発現される。その結果、新たに作成されたλファージLZ2のキャプシドはGPD-EYFPおよびGPDタンパク質の混合物を含んでいます。このモザイクファージは、構造的に安定しており、個々のファージ5の検出を可能にするために十分に蛍光性である。 PP RE - mCherryは溶原pathwaの選択を検出するために使用されるプラスミドレポーターですyである。プロモーターP REは溶原性1,11の確立時にCIIによって活性化される。 PP RE - mCherry 5は mCherry 12でGFPを置き換えることにより、PE-GFP 11から派生したものです。詳細については、当社の以前の仕事5を参照してください。 成長条件パラメータ： 溶原誘導（第1節）の間に、180 rpmで軽度の揺れは良いウイルス収量13を与える。グルコース代謝があるので避けてください成長培地中のグルコースの使用は酸性代謝産物を生成し、成熟したラムダ粒子が酸性pH 13で不安定である。 MgSO 4の加算はファージカプ3を安定させることを目的としている。野生型CI（代わりにCI 857）を運ぶファージは、溶原菌は、DNA損傷剤のマイトマイシンC 3を使用して誘導することができる。ステップ1.3では、37℃でインキュベーション℃は通常90分を超えてはいけません。それは、USEFです<html> 30分ごとにOD 600により細胞密度を確認してUL。良いライセートは、OD 600が約0.2以下に低下し、残りのOD 600が細胞破片の結果です。新しく作成されたファージは、細胞の破片に自分のDNAを注入するために始めることができるから時間が経ちすぎインキュベートすると、下のファージの収率で発生する可能性があります。ステップ2.11と2.13で見えるファージバンド（少なくとも1×10 11ファージ粒子）を取得するには、ステップ1.2で少なくとも500 mlの培養液を栽培しています。ステップ5.1および5.2の増殖培地中に0.2％マルトースの添加は子羊、ラムダファージの吸着3,14に対する受容体の発現を誘導することを目的としている。 mCherry -ステップ5.2の代わりに、100倍1000倍に希釈し、レポータープラスミドのPP REからmCherryのバックグラウンドレベルを減らすことを目的としています。 、35をトリガファージDNA注入のためのステップ5.5°Cでは温度感受性cI857対立の誘発を避けるために選択されます。 ファージ精製： jove_content &quot;&gt;ファージの精製工程（2.11〜ステップ2.1）は、他の精製プロトコル5に置き換えられますが、CsCl平衡勾配（ステップ2.12と2.13）を介して最終的に超遠心分離は不可避であることができます。スイングバケットローターはステップ2.10と2.12で必要とされる鋭い目に見えるファージバンドを確保する。純粋ファージ株式の取得には一週間ほどかかる場合がありますので、中間段階の間に何かがうまくいかないことを確認するための方法に沿ってファージ力価を確認する必要があります。 ファージの取り扱い： 第2節の全精製手順の間に、それはファージは、ファージ頭部からファージ尾部を剪断避けるために穏やかにライセートを処理するために重要です。第5節で細胞感染（例えば、5.7を通じて5.5ステップ）の間に、それはまた、感染細胞からファージ粒子のせん断を避けることが重要です。のIE、ファージのDNAを注入した後、感染細胞から剪断される場合、結果は &quot;暗い&quot;感染症であることに注意してくださいクション結果が実験で観察されたが、感染ファージはしませんされます。ファージまたはファージ/細胞混合物を取り扱うときは、必ずこのような問題の発生を防ぐために、我々は広いピペットチップを使用しています。 DAPIのテスト： DAPI（4節）とファージストックを染色すると、ファージストックの純度を確認するには、迅速かつ効率的な方法です。また、時間をかけて既存のファージストックの分解の可能性をテストするために使用することができます。純粋な株式については、蛍光顕微鏡下でYFPおよびDAPI信号の共局在はほぼ100％であるべきである。我々は通常のYFPスポットの1％未満では、これらの粒子が正常にウイルスDNAをパッケージ化しなかったことを示していたり​​、既に他の場所で彼らのDNAを注入したDAPIを（ウイルスゲノムなしキャプシドを表す）は、含まれていないことを確認します。 DAPIのスポットの1％未満はYFP（非蛍光性のファージに相当）が含まれていません。この条件が満たされない場合、2.14を通じて2.12はoに繰り返されるために必要な手順再び精製するrder。長期的なライブセルイメージングがここに必要としないため、撮像パラメータに関しては、ステップ4.3の顕微鏡のセットアップでは、第5節でほど重要ではありません。 1の願いはただ一つのファージ粒子の蛍光強度を校正する場合は、第5節と同様に顕微鏡の設定を保存しておくことは有用である。 PBS-アガローススラブは非常にきれいで、またはDAPI染料が使用されても過言ではない場合には、ファージDNAに対応するいくつかのDAPIスポットは &quot;ハロ&quot;で囲まれていてもよい。少なすぎるDAPIの染料が使用されている場合は、DAPIのチャネ​​ルからの信号は非常に弱いかもしれません。 顕微鏡システム： 第6節のイメージングのために、私たちは100倍対物レンズ（プランのFluo、開口数1.40、油浸）と標準フィルターセット（ニコン）と、商業倒立落射蛍光顕微鏡（エクリプスTE2000-E、ニコン）を使用します。蛍光光源は、光強度の制御とアーク灯である。次の機能は、コンピュータ制御されています：x、y、zのPOsition、明視野と蛍光シャッター、及び蛍光フィルター選択。オートフォーカス機能が必要です。そうしないと、フォーカスが容易にタイムラプスムービー（通常は4時間長い）の間に流れ出すことがあります。それが並列で複数の感染イベントを追跡することが可能として、各時点で（x、y）は、複数のポジションを獲得する能力は、便利です。我々は一般的に100感染イベントに追従し、それぞれの映画の中で8段階のポジションを獲得。我々が使うカメラは16ビット（Cascade512、Photometrics）のダイナミックレンジを持つ16×16μmのピクセルのカメラと512×512冷却CCDである。買収は、MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices）を使用して実行されます。顕微鏡は、恒温室に置かれるべきである、或いは、顕微鏡ステージは、温度制御室で囲む必要があります。 画像取り込み： ライブセルイメージングのために、それは漂白とフォーにつながる可能性があり、試料の不必要な被ばくを避けるために重要ですtotoxicity。したがって、それは最初に漂白過大または細胞増殖を阻害するに至らない間に蛍光を検出することができ、最適な露光量を見つけるためにあなたのシステムを特徴づけるために最善の方法です。良い蛍光画像を得るためには、励起光強度、露光時間とカメラゲインと遊ぶ。ステップ6.2から6.3で、10分のフレーム間隔は、光の露出を最小限に抑えることを目的として選択されます。各フレームでは、単一の合焦画像は、位相コントラスト（細胞認識のために）および蛍光チャネル（細胞の運命を決定するため）が必要である。最初の時点では、しかし、YFPのチャネルを介して、複数のz位置の画像は、細胞表面上のすべての感染したファージをキャプチャする必要があります。初期フレームにおけるYFPの露光時間はまた後で時間枠でタイムラプスムービーで使用しているよりも高くする必要があるかもしれません。 画像解析： 非常に慎重にステップ7.1における細胞表面の周りファージ粒子を数える。として上で述べたように、我々は、ステップ6.2におけるYFPのチャネルを介してZ-スタックのシリーズを取る。しかし、これはまだカウントに挑戦一部の蛍光ファージ粒子アウトフォーカスを離れることができる。最初の時間枠内のセルの長さがMetamorphソフトウェアを使用して測定されています。セル長はまた、ImageJのか、他のソフトウェアツールによって測定することができる。さらに、自動化された家庭MATLAB組み込みプログラムは、そのような細胞系譜に沿って時間をかけて蛍光変化などの情報を取得する際に非常に役立つことがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>シグマ</td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> R4642〜10mgの</td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SMバッファー</td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td>セシウム</td><td>シグマ</td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td>注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585 </td></tr><tr><td>針</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 305176 </td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 66333 </td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>コー​​ニング</td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti超明確な管</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti超明確な管</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Tiローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Tiローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 335649 </td></tr><tr><td>屈折計</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から947 </td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプスTE2000-E </td></tr></tbody></table> 表2試薬と機器。

細胞運命を以下に<em&gt; e大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

バクテリオファージ（ファージ）ラムダと細菌大腸菌を含むシステム大腸菌は長い細胞運命決定の1,2のためのパラダイムを務めている。ファージの数によって、細胞の同時感染後、2つの経路のものが選ばれる：溶解（強毒性）または溶原（休止状態）3,4。我々は最近、蛍光個々のファージを標識するための方法を開発し、個々のファージとセル5のレベルでは、顕微鏡下でリアルタイムで感染後の決定を調べることができました。ここで、我々は以前の仕事5に記載された感染実験を行うための完全な手順について説明します。これは蛍光ファージの作成、細胞の感染、顕微鏡下でのイメージングおよびデータ分析が含まれています。蛍光ファージは、カプシドGPDタンパク質の &quot;ハイブリッド&quot;、共発現する野生型およびYFP融合バージョンです。原油ファージ溶菌液は最初GPD-EYFP（ENHの溶原菌を誘導することによって得られるプラスミドを発現する野生型GPDを宿す、黄色蛍光タンパク質）ファージをとれた。精製工程のシリーズは、その後、顕微鏡下でのDAPI標識やイメージング、続いて行われます。これは、均一性、DNAパッケージング効率、蛍光シグナル及びファージストックの構造安定性を確認するために行われます。細菌にファージの初期吸着は、その後、35℃で短時間のインキュベーションに続いて、氷の上で実行される°Cは、ウイルスDNA注入6をトリガする。ファージ/細菌混合物を、次いで、薄い栄養寒天平板の表面に移動したカバーガラスで覆われており、落射蛍光顕微鏡下で撮像される。感染後の処理は10分間隔で、4時間続きます。複数のステージの位置は約100細胞の感染は、単一の実験でトレースすることができるように追跡されます。それぞれの位置と時間の時点で、画像は位相コントラストと赤と緑の蛍光チャネルで取得されています。位相コントラスト画像は、自動化されたセルのために後で使用されている新しい蛍光ファージの生産（緑）細胞溶解、または再開細胞の増殖と分裂に続いて溶原性因子の発現（赤色）が続いています。蛍光チャンネルが感染の転帰を特徴付けるために使用されるのに対し、Lは認識。取得したタイムラプスムービーは、手動と自動の方法を組み合わせて使用​​して処理されます。各感染事象（感染ファージの例数と位置）だけでなく、感染症の転帰（溶解/溶原性）のための感染パラメータの同定におけるデータ解析結果。必要に応じて追加のパラメータを抽出することができる。

この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します<em&gt; E大腸菌の</em&gt;細菌、顕微鏡下での感染の結果に続く、感染結果の分析。

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

バクテリオファージ（ファージ）λと大腸菌（E. coli）からなる系は、長きにわたり細胞運命決定のパラダイムとして利用されてきた1,2。...に続き、

本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて、ファージλ（ラムダ）による感染後のE. coliにおける硫酸塩の挙動をリアルタイムで追跡することです。まず、ファージλの粗ライセートを調製します。次に、ファージを精製し、チューブ内でE. coliにファージλを感染させます。顕微鏡下で細菌細胞の運命の追跡を継続します。最終的に、細胞の増殖または死滅に関連する異なる蛍光タンパク質の発現を通じて、E. coliにおける異なる細胞運命をリアルタイムで示すことができます。一般的に、この手法における一つの検証事項は、精製されたフロントおよびラベル付きFIストックの作成です。調製および精製の過程で凝集が起こるのを避けるため、また健全な細胞増殖を可能にするため、顕微鏡下のイメージングパラメータも最適化してください。E 3 92 Lambda LZ one PPL star Dのオーバーナイト培養液をLBM培地に接種します。細胞密度がOD 600で約0.6に達した時点で、42 °Cのウォーターバスシェーカーを用いてライソゲンを誘導します。溶菌が認められるまで37 °Cでインキュベーションを継続します。培養液が透明になります。次に2%クロロホルムを加え、室温で15分間インキュベートします。次に、ファージ溶解物を250 milliliterボトルに移し、培養液を遠心分離します。その後、ファージ粒子を含む上清を回収し、標準的なファージタイター法に従って、2回目の遠心分離を行い可視的なデブリを除去します。ファージ濃度を測定した後、塩化セシウム密度勾配によりファージを精製し、aroスラブの作製に向けてDPIで活性を測定します。6枚の顕微鏡スライドを70% ethanolで洗浄します。5枚のスライドを図のように配置し、テープで固定します。次に、培地に含まれる1.5% aros溶液を固定したスライド上に注ぎます。気泡が入らないように注意しながら、最後のスライドを一番上に重ねます。その上に重りを置き、AROSを約30分間冷却します。側面の4枚のスライドを取り除き、スライドの塊をラップで包みます。形質転換細菌のオーバーナイト培養物を接種源として、LBMMで培養し、細菌を1 mL分ペレット化して再懸濁します。ワイドピペットチップを用い、氷冷した20 µLのLBMMに細胞を懸濁します。精製したファージを20 µL添加します。穏やかに混合し、まず氷上で30分間インキュベートしてファージを吸着させます。その後、35 °Cのウォーターバスで5分間インキュベートします。ファージDNAの注入を誘導するため、混合して細胞凝集体を分離させます。この混合液をLBMMで10倍に希釈します。次に、LBMアグロ平板に配置します。カバーガラス上に、ファージ細胞混合液を1 µL加えます。吸収させた後、別のカバーガラスを上からそっと被せます。まず、初期時間枠のYFPチャンネルを通じて画像セットを取得します。Z軸方向に200 nanometer間隔で15枚の連続画像を撮影します。加えて、位相差およびm cherryチャネルを用いて、ピントが合った画像を1枚撮影します。その後、感染後の細胞運命に関するタイムラプス動画を撮影してください。タイムラプス動画撮影中の退色と光毒性を最小限に抑えるため、各チャンネルおよび各タイムポイントにつき単一のZ位置画像を使用し、位相差、YFP、およびmCherryチャンネルで約4時間にわたり10分間隔でサンプルを撮影します。まず、ファージの手動計数から画像の解析を開始し、あわせてファージの位置と細胞長を記録します。初期の時間枠において、溶菌性、溶原性、または非感染という細胞の運命を記録してください。また、タイムラプス動画を再生することで溶菌時間やその他の必要な情報を記録し、自動細胞認識および系統追跡アルゴリズムを用いて、個々の細胞における経時的な蛍光レベルなどの定量的な情報を抽出します。通常、蛍光標識したファージのプラークは野生型よりも著しく小さくなり、正常に精製されたファージのYFP信号とDAPI信号は共局在します。これらのデータは、位相差、YFP、およびM cherryチャネルの画像セットと、タイムラプス動画から得られた対応するオーバーレイ画像を組み合わせたものです。初期の時間枠では、個々のファージがはっきりと見えます。ここでは、単一のファージに感染した2つの細胞と、3つのファージに感染した1つの細胞が観察されます。通常、いくつかのファージが細胞表面に付着している一方で、他のファージは吸着されていない状態で観察されます。時間の経過とともに、感染の結果に差異が現れます。80分後、単一のファージに感染した2つの細胞は、それぞれ溶菌サイクルに入っています。一方で、細胞内で新しいファージが産生される中、3つのファージに感染した細胞は、プレモーターからのmCherryの産生によって示される溶原サイクルに入っています。このビデオを視聴することで、ファージλを用いて大腸菌を感染させるための精製ファージストックの作成方法と、顕微鏡下でのリアルタイム・ライフスタイルイメージングの実施方法について深く理解することができます。

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7...

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1...

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。...

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス...

マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

ここでは、すぐに精製することにより腹腔内接種に従い、蛍光して注射部位からの彼らの取り込みと動きを監視し、これらのイベントを媒介する細胞を特徴づける感染脳材料から集約されたプリオンロッドを標識する免疫細胞によるプリオンの取り込みと人身売買を監視するための新たなアッセイを説明します。...

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。...

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。...

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

学ぶ蛍光顕微鏡を用いた大腸菌へのバクテリオファージλ感染のリアルタイム観察法。ライソゲニーとリシス経路の細胞運命解析により、ウイルス感染動態を可視化し、微生物学・ウイルス学研究に貢献します。

細胞運命を以下に

さらに動画を探す