生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

この手順の全体的な目標は、機能解析に使用できる凝集細胞と細胞由来マトリックスから3D組織コンストラクトを作成することです。これは、最初にポリカーボネート型をフライス加工して丸底の環状ウェルを作成することによって達成されます。次に、ポリジメチルスローンまたはPDMSをポリカーボネート型にキャストしてテンプレートを作成します。

次に、PDMSテンプレートを使用してarosウェルを形成します。最後のステップは、細胞をアロスウェルに播種して、細胞が凝集して凝集性組織リングを形成できるようにすることです。最終的に、この方法は、さまざまな細胞タイプを使用して細胞の自己組織化と組織工学を達成するために使用できるため、組織の構造と機能に対する細胞と細胞由来の細胞外マトリックスの寄与の解析が可能になります。

この技術の主な利点は、他の組織工学的アプローチよりも、我々は完全に細胞とそれらが以前に報告されたよりも迅速に生成する細胞外マトリックスから組織構築物を生成することができることであり、機械分析を助長する形式で、ポリカーボネートの半分インチの厚さの部分を粉砕することから始める2ミリメートルの中央ポスト直径を持つ15の丸底環状ウェルを作成します。ポリカーボネート型を清掃して、フライス加工プロセスで発生するプラスチックの破片を取り除き、型を乾かします。次に、PDMSを10対1の比率で塩基硬化剤を混合し、溶液を脱気してすべての気泡を除去し、ポリカーボネート金型に注ぎます。

その後、金型上で混合物を再度脱気して残留気泡を取り除き、PDMSが硬化溶解している間、PDMSを摂氏60度のオーブンで4時間硬化させます。DMEM中の2%AROSは、硬化したら、ポリカーボネートからゆっくりと剥がしてPDMSテンプレートを慎重に除去し、PDMSを石鹸と水で洗浄し、DMEM AROS溶液と一緒にオートクレーブします。次に、オートクレーブPDMSテンプレートを平らな面に置き、最初にアロを各中央ポスト型にピペッティングし、次にアロをそれらの周囲のスペースにピペッティングして、溶融アロを充填します。

アロスが約15分間固まるのを待ちます。次に、金型を反転させて、PDMSからarosを解放します。各ウェルの周りから余分なアロを切り取り、12ウェルプレートの各ウェルに1つのアロをウェルに入れます。今。

細胞培養培地をウェルの上部を覆わずに、arosの外側にウェルを追加します。次に、プレートをインキュベーターに入れて、細胞が準備されている間、プレートが平衡化できるようにします。90%コンフルエンストリプシンで、ラット大動脈平滑筋細胞と蘇生。

細胞を1ミリリットルあたり6個の細胞の10倍5倍の濃度で懸濁します。次いで、再懸濁した細胞懸濁液の100マイクロリットルを平衡化されたアロスウェルのそれぞれにピペットで移します。円運動を使用して、細胞を各ウェルに適用します。

プレートをインキュベーターに入れて、24時間邪魔されずに置きます。ウェルの周りからメディアを吸引し、アロスモールドが完全に水没するまで各ウェルを補充することにより、2日ごとに培地を交換します。そして、文化の終わりに、小さなペトリ皿にPBSを入れます。

各リングをセンターポストの上部にスライドさせて、各リングをアロスモールドから取り外します。デジタルイメージングシステムの下のリングであるPBSセンターを使用して、リングをペトリ皿に置きます。エッジ検出ソフトウェアを使用して、リングの周囲を上、下、左、右の4つの位置でリングの厚さを測定します。

単軸引張試験を実施するため。リングサンプルを2本の細いワイヤーグリップに取り付けます。5ミリニュートンの引き裂き荷重がリングに加えられるまでグリップを伸ばします。

次に、厚さ測定値から計算された断面積を入力し、標点距離を記録します。引裂荷重と50キロパスカルの間でリングを8回プレサイクルします。8番目のプレサイクルが毎分10ミリメートルで故障に引っ張られた後、毎分10ミリメートルの速度で応力が発生します。

各リングについて、極限引張応力と破壊ひずみを測定し、取得したデータから最大接線弾性率を計算します。機能的なin vitro研究に加えて、これらの生細胞リングは融合して組織チューブを形成することもできます。外科用ハサミを使用してシリコンチューブの端を斜めに切断し、斜めのエッジを作成し、チューブがオートクレーブされている間にシリコンチューブをオートクレーブします。

ペトリ皿に培地を充填し、滅菌したカスタムシリコンチューブホルダーをバイオセーフティキャビネットに移し、空のペトリ皿に入れます。次に、アロスウェルからリングを取り外し、メディアで満たされたペトリ皿に入れます。シリコンチューブを同じシャーレに入れて濡らしてから使用してください。

鉗子を使用してシリコンチューブの先端をリングの中央に置き、リングをシリコンチューブにそっとスライドさせます。リングをスライドさせて互いに接触させ、チューブに沿って両方向に連続してゆっくりと押します。リングを取り付けたら、ポリカーボネートホルダー内のシリコンチューブを位置合わせし、ホルダーの2つの部分をねじ込みます。

ペトリ皿に55ミリリットルのメディアを追加します。培養期間中は3日ごとに培地を交換し、組織チューブを取り外してください。まず、ペトリ皿にPBSを入れます。

次に、ポリカーボネートホルダーからシリコンチューブを外し、鉗子を使用してティッシュチューブをシリコンチューブからディッシュにスライドさせます。正しく行われると、細胞はアロスウェルの底に沈殿し、着座後24時間以内に収縮してアガロウェルの中央支柱の周りに組織リングを生成する、これはラット平滑筋細胞から生成された2ミリメートルの組織リングの一軸引張試験から得られた応力ひずみ曲線の代表的なプロットである。次に、極限引張強度、最大引張弾性率、および破壊ひずみ値を使用して、さまざまな培養パラメータで成長した組織リングサンプルの機械的特性を比較します。

組織リングの機械的特性は、細胞の座席数、培養の長さ、培地、使用する細胞の種類などの培養パラメータを変更することで制御できます。ラットの平滑筋細胞に加えて。ヒトの初代平滑筋細胞は、同様の引張強度を持つ組織リングを形成します。

ヒト間葉系幹細胞も凝集して環を形成しますが、機械的試験には十分な強度がありませんでした。当社のシステムは、カスタムのarosウェルに細胞を播種するだけで、完全に細胞から人工組織構築物を製造できます。最初のポリカーボネート金型が機械加工されたら、PDMSテンプレートを無制限に作成して、それを使用して金型を作成できるため、追加の機器は必要ありません。

このシステムは、システム内でさまざまな細胞タイプを使用して組織リングを作製したという点で汎用性が高いため、このシステムは、組織工学アプリケーションだけでなく、組織構造と機能に対する細胞と細胞外マトリックスの寄与に関するin vitro研究にも使用できる可能性があります。