網膜切片の形態学的解析

こんにちは。私は香港大学解剖学部の神経変性疾患研究室のReginaです。本日は、網膜切片の進行解析の手順について説明します。それでは始めましょう。解析を行う前に、網膜サンプルの切片を作成し、4 µmの厚さに切り出し、H&E染色を行います。

その後、網膜セッションを4つの領域に分割します。具体的には、上部周辺領域、上部中央領域、下部中央領域、および下部周辺領域です。領域を定義した後、decorの明視野顕微鏡を用いて、各領域の画像を10倍および40倍の倍率で取得します。

それでは、網膜の形態情報を解析します。このセッションでは、内顆粒層の網膜厚を測定する方法を説明します。Thorough Investigatorというソフトウェアを起動してください。

40 typesを選択し、メインの2つのバーから「image open」を選択します。「file」タブの下から、解析したい網膜領域の画像を選択してください。メインの2つのバーにあるドロップダウンから、等高線の種類を選択します。

オートムーブがオンになっていることを確認してください。ズームインボタンをクリックすると、画像を拡大できます。ズームアウトボタンを使用すると、画像表示のサイズを小さくできます。

トレースおよび標本の両方は、移動ボタンをクリックすることで4つの異なる方向に移動させることができます。トレースウィンドウ内で右クリックし、simple crack tracingを選択してください。内層の内側の境界に沿って輪郭線を引きます。

間違いがあった場合は、トレースウィンドウで描画を中断し、元に戻すボタンを押して直前の描画点を消去してください。線の終点までトレースを続けます。描画が完了したら、トレースウィンドウで描画を中断し、オープンコンターを選択して、ズームインをクリックして画像を起動します。

トレースウィンドウ内でボタンを左クリックします。画像を拡大するには、マーカー2バーでマーカーを選択し、接合点に配置してください。

すべてのマーカーを追加した後、マーカー2のバー位置にあるマーカーアイコンを選択し、カーソルを合わせます。マーカーのいずれかの中心で、トレースウィンドウ内を右クリックし、タブの下にある「quick measure angles」を選択して、「continuous」オプションを選択します。選択したマーカーに隣接するマーカーの中心を順にクリックして、角度を測定します。

線分端部については、関心領域の中心に向かって移動させます。マーカーと亀裂を確認してください。再度、ラバーバンドの線をinia層の外縁まで伸ばし、角度が90度になるまで調整します。

目的の左側の亀裂まで移動します。クリック直後に、角度測定を表示するダイアログボックスが表示されます。マウスを左に保持したまま、Enterキーを押してください。

トレースウィンドウをクリックし、一方の端から新しく選択した端まで線を引きます。トレースウィンドウ内で線を切り離し、オープンコントロールを選択します。各領域の内顆粒層フィンガーを4箇所測定する必要があるため、4本の線を引きます。

コントロールベースから核の外縁に向かって垂直に線を引き、境界が明確に見えるように画像を調整します。線の先端が核の外縁に位置していない場合は、編集モードで線を延長させるか短縮します。編集モードを選択し、該当する線を選択してください。

トレースウィンドウをクリックし、電気制御のサーチポイントを選択します。点編集を行いながら、外枠に沿って点を追加してください。その後、元の点を削除します。これにより、新しいリフトに合わせた調整が可能になります。

ズームアウトボタンをクリックして、画像のサイズを縮小します。編集モードを解除し、最後の線分を描画します。オーダーラインの描画後、編集モードを選択します。

トレースウィンドウを右クリックし、それに合わせて4本の線分を配置します。次に、CONT測定ボタンを押して、4つの測定値を取得します。これら4つの測定値を選択し、「コピー」をクリックして専用ソフトに貼り付けます。

「File」タブにある「Save as」をクリックして選択します。トレースデータはデータファイルとして保存できます。このセクションでは、「Image」から「Open」を選択し、red tail gagan細胞の数を定量化します。

「ファイル」タブの下で、解析したい網膜領域の画像を選択します。まず、どの細胞が生きており、どの細胞が死滅しているかを識別する必要があります。おおよそ円形で、淡い細胞質と核がはっきりと観察される細胞を、生存している網膜神経節細胞とみなします。

小さく凝縮した細胞であるものは、同一の細胞とみなします。メインツールバーのドロップダウンから輪郭線の種類を選択してください。左側の線維層の境界に沿って線を描き、「オプション」および「オープンコントア」を使用してトレースします。

各端にマーカーを1つずつ追加し、1つは線の先端に、もう1つはチームに近い位置に配置します。マーカー2バーでマーカーアイコンを選択してください。カーソルをマーカーの中央に合わせます。

ツールチップで、タブの下にある「quick measure angles」を選択します。次に、トレーシングウィンドウで右クリックし、「continuous」オプションを選択してラバーバンド線を描き、19 degreeの角度を測定します。ダイアログボックスが表示された直後にEnterキーを押してください。

ただし、マウスは依然として同時に左側に位置していることに注意してください。トレースウィンドウを区切り、先端から新しい線が特に延長できるようにします。トレースウィンドウ内で区切りを入れ、オープンコントロールを選択してください。

もう一方の端と同じ方法で、もう一本の新しい線を描きます。これにより、ラティンガガン細胞（ratingagan cells）の数をカウントするための2つの境界線が作成されました。1種類のマーカーを選択し、5個の細胞につき1つのマーカーを付けてください。

細胞が接触していない境界線を1つ除外線として選択します。死細胞用の別のマーカータイプを選択してください。各マーカータイプの数と領域が、マーカーアイコンの横に表示されます。

マーカー2バーで編集モードを選択し、輪郭ベースラインをピックアップします。トレースウィンドウでそれを切断し、ラインを再終端させます。輪郭ベースラインの名前は、輪郭測定ボタンを押すことで取得できます。

その後、細胞数を膜の1mmあたりの数として表すことができます。それでは、「ファイル」タブの下に保存しましょう。トレースデータとマーカーデータはデータファイルとして保存できます。

このパートでは、網膜神経節細胞の細胞体のサイズを測定する方法を実演します。［ファイル］タブの下から、解析したい任意の網膜領域の画像を選択して開いてください。前のパートで説明した基準に従って、生存している広視野型神経節細胞を選択してください。

Life Cellにて、メインツールバーのドロップダウンメニューから等高線の種類を選択します。トレースウィンドウの右端にあるボタンをクリックし、細胞の周囲に沿って等高線を描画して、「End Close Contour」を選択します。細胞の面積が、「Control Measurement」ダイアログボックスの「Area」の項目に表示されます。

このビデオでは、網膜を客観的に分析できる3つの簡便な方法を実演しました。このビデオがお役に立てば幸いです。