Name: 網膜切片の形態学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 学ぶ網膜切片の形態学的解析法。内顆粒層厚さ測定、網膜神経節細胞数の定量化、細胞サイズ測定をH&E染色標本で実施。神経変性疾患研究に応用可能な系統的手法を習得できます。

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この研究室で目の研究の仕事はアメリカの健康アシスタント財団、ツツジ（1972）基本財産基金、およびHKU小規模プロジェクト基金（20097176185）でサポートされています。

1。ツール顕微鏡、ニコンステレオ調査官、MBFバイオサイエンス - MicroBrightField株式会社 2。準備<ol><li>任意の形態学的分析の作業を行う前に、それぞれの網膜サンプルは、4ミクロンの厚さで切片であり、H＆E染色を受ける。 </li><li>上部の周辺領域、上部の中央部、下側の周辺領域と、下部中央の領域 - 網膜セクションは4つの領域に分割されています。 </li><li>領域を定義した後、各領域の画像は、ニコンの明るい光顕微鏡下で10X40倍率で取得されます。 </li><li>今、私たちは、網膜の形態計測分析を行うことができます。 </li></ol> 3。 INLの厚さを測定<ol><li>各地域のINLの厚さの4つの測定値を測定した。 4行は、INLの外側の境界に輪郭のベースラインから垂直に描画されます。 </li><li>ステレオ捜査官と呼ばれるソフトウェアを開き、メインツールバーから40倍レンズを選択します。 </li><li>タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。 </li><li>メインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択し、 "自動移動"ボタンを押してください。 </li><li>右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "単純なクリックしてトレース"を選択してください。 </li><li> INLの内側の境界に沿って輪郭線を描画します。 </li><li>描画が完了したら、右側のトレースウィンドウ内をクリックし、 "終了オープン輪郭"を選択します。 </li><li>マーカーツールバーでマーカーを選択して、接合点にマーカーを追加します。 </li><li>すべてのマーカーを追加した後、マーカーツールバーでマーカーのアイコンを選択解除します。 </li><li>マーカーの1つの中心にカーソルを置きます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"><ol start="11"><li> "クイックを選択します。ツール ""タブの下で、 "角度を測定します。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"><ol start="12"><li>右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "連続"オプションの選択を解除します。 </li><li>最初の行セグメントの終点のために選択マーカーに隣接しているマーカーの中心にクリックして、角度を測定します。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"><ol start="14"><li>その後、当該マーカーの中央にマウスを移動し、再度クリックします。 </li><li> INLの外側の境界線にゴムバンド線を拡張します。 </li><li> 90°に達するまでの角度を調整します。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"><ol start="17"><li>任意の位置で左クリックします。角度測定を示すダイアログボックスが右クリックした後にポップアップ表示されます。 </li><li>押すまだマウスを押しながら "Enter"キーを。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"><ol start="19"><li>ラインが​​1つの端から新たに選択最後に描画されるように、トレースウィンドウを左クリックしてください。 </li><li>右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "終了オープン輪郭"を選択します。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図6"><ol start="21"><li>前述のようにまったく同じ方法で異なる位置で他の線を描画します。 </li><li>すべての行を描画した後、編集モードを選択し、それに応じて4ラインセグメントの名前を変更します。 </li><li> 4つの測定は、 "輪郭測定"ボタンを押すことによって得ることができます。 </li><li>これらの4つの測定値を選択し、 "クリップボードにコピー"をクリックしてスプレッドシートに貼り付けることができます。 </li><li>選択したタブの "ファイル"の下に "名前を付けて保存"。トレースデータは、データファイルとして保存することができます。 </li></ol><ol><li>タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。 </li><li>メインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択します。 </li><li>神経線維層（NFL）の境界に沿って輪郭線を描画します。 </li><li>オプションの "Endオープン輪郭"でトレースを終了します。 </li><li>それぞれの終わりに、1行の先端にマーカーと先端に近い位置で別のを追加します。 </li><li>マーカーツールバーのマーカーアイコンを選択解除します。 </li><li>先端のマーカーの中心にカーソルを置きます。 </li><li>タブの "ツール"の下にある "クイック測定角度"を選択します。 </li><li>右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "連続"オプションの選択を解除します。 </li><li>ゴムバンド線を調整し、90°の角度を測定します。 </li><li>ダイアログボックスがポップアップされた後、 "Enter"キーを押します。 </li><li>左クリックトン彼は、新し​​い行が垂直に先端から延長することができるようにウィンドウをトレースします。 </li><li>もう終わりにまったく同じ方法で別の新しい線を引く。 </li><li> 2つの境界は、RGCの数がカウントされている内に作成されます。 </li><li>セルタッチがカウントされません除外ラインとして1つの境界線を選択してください。 </li><li>マーカーのいずれかのタイプを選択し、各ライブセルに1を添付してください。 </li><li>死んだ細胞のマーカーの別のタイプを選択します。 </li><li>に設定されたマーカーの種類ごとの数は、マーカーのツールバーに応じてマーカーアイコンの横に表示されます。 </li><li>編集モードを選択し、輪郭のベースラインを拾う。右のトレースウィンドウ内をクリックし、行の名前を変更します。 </li><li>コンターラインの長さは、 "輪郭測定"ボタンを押すことによって得ることができます。 </li><li>細胞の数は、長さのmm当たり表現することができます。 </li><li>選択したタブの "ファイル"の下に "名前を付けて保存"。ザトレースとマーカデータは、データファイルとして保存することができます。 </li></ol> 5。 RGCセルのセルサイズを測定する<ol><li>タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。 </li><li>生細胞でのズームとメインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択します。 </li><li>セルの円周に沿って輪郭線を描画します。 </li><li>約終了時には、右のトレースウィンドウをクリックすると "Endに近い輪郭"を選択してください。 </li><li>セルの面積は輪郭測定]ダイアログボックスでエリアの項目の下に表示されます。 </li></ol>

<ol><li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-D-Aspartate+%28NMDA%29%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9CInduced+Apoptosis+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)â€“Induced Apoptosis in Rat Retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).</li>
<li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+caspases+after+ischemia-reperfusion+injury+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).</li>
<li>Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Selective+Vulnerability+of+Retinal+Ganglion+Cells+in+Rat+Chronic+Ocular+Hypertension+Model+at+Early+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).</li>
<li>Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+citicoline+on+retinal+cell+damage+induced+by+kainic+acid+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats.</a> Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).</li>
<li>Hernandez, M., Urcola, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+neuroprotection+in+a+rat+model+of+glaucoma+following+brimonidine%2C+latanoprost+or+combined+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments.</a> Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

1。より正確な厚さの測定値を得る方法は？ あなたは、トレースウィンドウ内のボタンと左クリック "ズーム"をクリックして画像を拡大することができます。 INL境界線がはっきりと見ることができます。ラインの先端がINLの外側の境界でない場合は、我々は、編集モードで行を調整することができます。関係線を選んだ後、右のトレースウィンドウをクリックして "選択した輪郭で挿入ポイント"を選択します。追加された点は、同じラインに沿っている必要がありますがポイントは、外側の境界線で追加することができます。その後、元のポイントを削除する必要がありますとより正確な長さのラインを得ることができます。 2。ゴムバンド線の90°を維持するには？ 度を示すダイアログボックスがポップアップ表示されたら、 "Enter"キーを押しながら、まだマウスを保持する必要があります。その後、新しい行を描画することができるように、トレースウィンドウを左クリックしてください。 ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3377">Morphometric Analyses of Retinal Sections</a>. There was an error with an author's name.

Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ステレオ捜査官</td><td> MBFバイオサイエンス解析ソフトウェア</td><td> MicroBrightフィールド</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパスBX51 </td><td>オリンパス株式会社</td><td> BX51 </td></tr></tbody></table>

網膜切片の形態学的解析

Morphometric Analyses of Retinal Sections

網膜切片の形態学的分析は、網膜疾患を調べるに使用されている。例については、神経細胞が大幅にN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）誘発性興奮1、網膜虚血再灌流障害2、緑内障3ラットモデルの網膜神経節細胞層（RGCL）で失われた。 INLおよび内網状層の減少（IPL）は、カイニン酸介在型グルタミン酸興奮毒性4に受けたラットの目にシチコリン治療と逆転した厚さ。 RGC密度とソーマのサイズの変化は、眼圧上昇3,5,6の目に別の薬物治療で観察した。したがって、網膜morphometriesを分析する客観的方法を持つことは、網膜の病態と治療戦略の有効性を評価する上で大きな意義であるかもしれない。 網膜の構造は、マルチレイヤーとニューロンEXIいくつかの異なる種類です。網膜の聖。そのような細胞数、細胞の大きさと異なった層の厚さとして、網膜の形態学的パラメータは、細胞培養系よりも複雑です。早い段階で、これらのパラメータは他の市販のイメージングソフトウェアを使用して検出することができます。値は相対値で、通常であり、正確な値に変更すると、さらに正確な計算が必要な場合があります。また、セルサイズと形態のトレースは、特に慢性緑内障モデルでは、正確な統計分析のための十分な感度ではありません。このプロトコルで使用されている測定値は、より正確かつ簡単な方法を提供しました。セルの行とサイズの絶対的な長さは、直接他のファイルにコピーすることが簡単に報告することができます。たとえば、我々は、INLの内側と外側の最も核のマージンを追跡して、厚さを測定するために90度の角度を描画するソフトウェアを使用してラインを形成した。ソフトウェアの助けを借りずに、多分斜線と網膜の厚さの変化がしれませんが個々のオブザーバーの間で再現性がありません。さらに、RGCの数と密度も定量することができる。このプロトコルは、成功すると、網膜の機能を定量の変動を減少させる最小限の変更を検出する感度を向上させます。 このビデオでは、網膜切片の形態学的分析の3種類のデモンストレーションを行います。彼らは、RGCの数を定量化し、絶対値でRGCのサイズを測定し、INLの厚さを測定しています。これらの3つの解析は、ステレオ調査官（ - MicroBrightField株式会社MBFバイオサイエンス）を用いて行われています。技術は、形態学的解析のためのシンプルでありながら科学的なプラットフォームを提供することができます。

このビデオでは、内顆粒層の厚さ、網膜神経節細胞（RGC）の数を定量化し、RGCのサイズを測定する測定含まれる網膜の形態学的分析、3つのタイプを示しています。技術は、形態学的解析のためのシンプルでありながら科学的なプラットフォームを提供することができます。

網膜切片の形態計測分析は、網膜疾患の検討に用いられてきた。例えば、...において神経細胞が有意に消失していた。

こんにちは。私は香港大学解剖学部の神経変性疾患研究室のReginaです。本日は、網膜切片の進行解析の手順について説明します。それでは始めましょう。解析を行う前に、網膜サンプルの切片を作成し、4 µmの厚さに切り出し、H&amp;E染色を行います。その後、網膜セッションを4つの領域に分割します。具体的には、上部周辺領域、上部中央領域、下部中央領域、および下部周辺領域です。領域を定義した後、decorの明視野顕微鏡を用いて、各領域の画像を10倍および40倍の倍率で取得します。それでは、網膜の形態情報を解析します。このセッションでは、内顆粒層の網膜厚を測定する方法を説明します。Thorough Investigatorというソフトウェアを起動してください。40 typesを選択し、メインの2つのバーから「image open」を選択します。「file」タブの下から、解析したい網膜領域の画像を選択してください。メインの2つのバーにあるドロップダウンから、等高線の種類を選択します。オートムーブがオンになっていることを確認してください。ズームインボタンをクリックすると、画像を拡大できます。ズームアウトボタンを使用すると、画像表示のサイズを小さくできます。トレースおよび標本の両方は、移動ボタンをクリックすることで4つの異なる方向に移動させることができます。トレースウィンドウ内で右クリックし、simple crack tracingを選択してください。内層の内側の境界に沿って輪郭線を引きます。間違いがあった場合は、トレースウィンドウで描画を中断し、元に戻すボタンを押して直前の描画点を消去してください。線の終点までトレースを続けます。描画が完了したら、トレースウィンドウで描画を中断し、オープンコンターを選択して、ズームインをクリックして画像を起動します。トレースウィンドウ内でボタンを左クリックします。画像を拡大するには、マーカー2バーでマーカーを選択し、接合点に配置してください。すべてのマーカーを追加した後、マーカー2のバー位置にあるマーカーアイコンを選択し、カーソルを合わせます。マーカーのいずれかの中心で、トレースウィンドウ内を右クリックし、タブの下にある「quick measure angles」を選択して、「continuous」オプションを選択します。選択したマーカーに隣接するマーカーの中心を順にクリックして、角度を測定します。線分端部については、関心領域の中心に向かって移動させます。マーカーと亀裂を確認してください。再度、ラバーバンドの線をinia層の外縁まで伸ばし、角度が90度になるまで調整します。目的の左側の亀裂まで移動します。クリック直後に、角度測定を表示するダイアログボックスが表示されます。マウスを左に保持したまま、Enterキーを押してください。トレースウィンドウをクリックし、一方の端から新しく選択した端まで線を引きます。トレースウィンドウ内で線を切り離し、オープンコントロールを選択します。各領域の内顆粒層フィンガーを4箇所測定する必要があるため、4本の線を引きます。コントロールベースから核の外縁に向かって垂直に線を引き、境界が明確に見えるように画像を調整します。線の先端が核の外縁に位置していない場合は、編集モードで線を延長させるか短縮します。編集モードを選択し、該当する線を選択してください。トレースウィンドウをクリックし、電気制御のサーチポイントを選択します。点編集を行いながら、外枠に沿って点を追加してください。その後、元の点を削除します。これにより、新しいリフトに合わせた調整が可能になります。ズームアウトボタンをクリックして、画像のサイズを縮小します。編集モードを解除し、最後の線分を描画します。オーダーラインの描画後、編集モードを選択します。トレースウィンドウを右クリックし、それに合わせて4本の線分を配置します。次に、CONT測定ボタンを押して、4つの測定値を取得します。これら4つの測定値を選択し、「コピー」をクリックして専用ソフトに貼り付けます。「File」タブにある「Save as」をクリックして選択します。トレースデータはデータファイルとして保存できます。このセクションでは、「Image」から「Open」を選択し、red tail gagan細胞の数を定量化します。「ファイル」タブの下で、解析したい網膜領域の画像を選択します。まず、どの細胞が生きており、どの細胞が死滅しているかを識別する必要があります。おおよそ円形で、淡い細胞質と核がはっきりと観察される細胞を、生存している網膜神経節細胞とみなします。小さく凝縮した細胞であるものは、同一の細胞とみなします。メインツールバーのドロップダウンから輪郭線の種類を選択してください。左側の線維層の境界に沿って線を描き、「オプション」および「オープンコントア」を使用してトレースします。各端にマーカーを1つずつ追加し、1つは線の先端に、もう1つはチームに近い位置に配置します。マーカー2バーでマーカーアイコンを選択してください。カーソルをマーカーの中央に合わせます。ツールチップで、タブの下にある「quick measure angles」を選択します。次に、トレーシングウィンドウで右クリックし、「continuous」オプションを選択してラバーバンド線を描き、19 degreeの角度を測定します。ダイアログボックスが表示された直後にEnterキーを押してください。ただし、マウスは依然として同時に左側に位置していることに注意してください。トレースウィンドウを区切り、先端から新しい線が特に延長できるようにします。トレースウィンドウ内で区切りを入れ、オープンコントロールを選択してください。もう一方の端と同じ方法で、もう一本の新しい線を描きます。これにより、ラティンガガン細胞（ratingagan cells）の数をカウントするための2つの境界線が作成されました。1種類のマーカーを選択し、5個の細胞につき1つのマーカーを付けてください。細胞が接触していない境界線を1つ除外線として選択します。死細胞用の別のマーカータイプを選択してください。各マーカータイプの数と領域が、マーカーアイコンの横に表示されます。マーカー2バーで編集モードを選択し、輪郭ベースラインをピックアップします。トレースウィンドウでそれを切断し、ラインを再終端させます。輪郭ベースラインの名前は、輪郭測定ボタンを押すことで取得できます。その後、細胞数を膜の1mmあたりの数として表すことができます。それでは、「ファイル」タブの下に保存しましょう。トレースデータとマーカーデータはデータファイルとして保存できます。このパートでは、網膜神経節細胞の細胞体のサイズを測定する方法を実演します。［ファイル］タブの下から、解析したい任意の網膜領域の画像を選択して開いてください。前のパートで説明した基準に従って、生存している広視野型神経節細胞を選択してください。Life Cellにて、メインツールバーのドロップダウンメニューから等高線の種類を選択します。トレースウィンドウの右端にあるボタンをクリックし、細胞の周囲に沿って等高線を描画して、「End Close Contour」を選択します。細胞の面積が、「Control Measurement」ダイアログボックスの「Area」の項目に表示されます。このビデオでは、網膜を客観的に分析できる3つの簡便な方法を実演しました。このビデオがお役に立てば幸いです。

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