強化されたマイクロおよびナノ操作のためのプラズモニックとフォトニック結晶ナノ構造の利用

本手順の全体的な目的は、プラズモニックピンセットおよびフォトニック結晶ピンセットを用いて、ミクロンサイズの生物学的物体を捕捉することです。まず、プラズモニック基板またはフォトニック結晶基板を作製します。次に、細胞溶液にBSAを添加し、上部カバーガラスの下に細胞溶液のための十分なスペースを確保することで、生物学的試料を調製します。

次に、適切なフィルター構成を装着した顕微鏡にレーザーを光軸合わせします。その後、顕微鏡を試料に焦点を合わせ、トラッピングを行います。最終的に、プラズモニック構造やフォトニック結晶ナノ構造を利用することで、入射強度を抑えてマイクロサイズまたはナノサイズの粒子をトラップすることが可能です。

従来の光ピンセットなどの既存手法に対する本手法の主な利点は、プラズモニックおよびフォトニック結晶ナノ構造を通じて光場を変換することで、細胞のような微小粒子のトラップに必要な強度を低減できる点にあります。また、高度に集光されたビームを必要としないため、放射線への曝露による細胞の光損傷のリスクを軽減できます。この手法は、細胞間相互作用や生物学におけるさまざまな力の研究など、多くの生物学分野における重要な疑問の解決に寄与します。さらに、マイクロ粒子やナノ粒子を精密に操作できるため、マイクロ・ナノテクノロジーにおける作製のための有用なツールとなります。電子ビーム蒸着機を用い、密着層としてクロムを使用して金ナノ粒子アレイを形成するには、ガラスカバースリップ上に金を20 nanometersの厚さまで蒸着させます。

表面の有機不純物を除去するため、酸素プラズマを用いてサンプルを約1分間洗浄します。ポリスチレン単分子層を自己組織化させた後、液体をサンプル上にドロップキャストし、約1時間インキュベートします。その後、多量の水で吸着していない球体を洗い流し、風乾させます。この単分子層の上に、さらに20 nanometerの金層を蒸着させ、ラテックス球の単分子層に金ナノ粒子ランダムアレイを形成させます。

これでナノ粒子アレイに生物学的サンプルを導入する準備が整いました。準備したナノ粒子スライドを蛍光顕微鏡のステージに設置します。次のステップでは、光トラップ用にマウス細胞核を調製します。

核が基板に付着するのを防ぐため、アニリンオレンジで標識したマウス細胞核を用意します。細胞核を小型バイアルに入れ、PBSで調製した10% BSAを、最終濃度が1〜10% BSAになるように加え、ボルテックスで混合します。次に、この細胞核BSA溶液を5 µL、準備したスライド上にピペットで分注します。

核とカバーガラスの間に間隔を設けるため、液滴の周囲にスペーサー用カバーガラスを2枚重ねて配置し、その上にさらに別のカバーガラスを被せます。トラッピングと同時にイメージングを行うには、バイパスされた励起フィルターと2つのカスタムダイクロイックビームスプリッターを含む、カスタマイズされた蛍光顕微鏡構成を使用します。光ピンセットは、GFP 17フィルターセットを搭載し、633 nanometerのレーザー放射が試料に到達するように改造されたzes axio imager D one M顕微鏡に、35 milliwattのヘリウムネオンレーザーを照射することで構成されています。

顕微鏡によってレーザービームがサンプルに集光され、その後、プラズモニックナノ粒子基板または回折格子によってビームが回折されます。直径約5 µmの細胞核をイメージングするには、Neola 50x対物レンズを備えたZeiss LDEC epi planを使用します。まずサンプルを対物レンズ上に配置し、核が基板の表面に位置しているため、最も多くの核が存在する平面に焦点を合わせます。

次に、表面の細胞層の上にある遊離した細胞核を探し、トラップする核に顕微鏡の焦点を合わせます。その後、粒子の上にレーザートラップスポットを配置します。この時点で粒子がトラップされ、ステージを移動させてもレーザースポット内での位置が保持されるはずです。

顕微鏡の焦点面にあるマウスの核は、サンプルの加熱や蒸発によって生じるわずかなマイクロ流動電流に伴ってドリフトする可能性がありますが、トラップ内の核は一定の位置に保持されます。この図は、それぞれ直径約 450 nanometers の自己組織化金ナノ粒子の走査電子顕微鏡写真を示しています。こちらは、ナノ粒子の分布がまばらなプラズモニクス基板の近接場走査光学顕微鏡像であり、近接場放射を示しています。

励起レーザーの波長は633 nanometersであり、ここにピークが624 nanometersに現れるプラズモニック基板の散乱効率スペクトルを示します。プラズモニック基板の吸収効率スペクトルでは、668 nanometersにピークが見られます。金ナノ粒子が1×1正方形の2次元領域にランダムに分布しています。

ここにマイクロメーターを示します。各青色の円はナノ球の中心を表しています。これらのパネルには、ランダムなナノ球アレイに平行な観測面における散乱場の分布が示されています。

これらのプロットは、周囲の流体の流量の関数として、トラップを維持するために必要な最小レーザー強度を示しています。プラズモニックトラッピングを利用し、すべての光強度は顕微鏡対物レンズ下の試料面で測定されています。各パネルには、直径の異なる単一のポリスチレンビーズの測定結果が示されています。

挿入図は、対応する粒子の顕微鏡画像を示しています。すべての画像におけるスケールバーは 5 µm の長さを表しています。ここでは、前のプロットにおける原点を通る近似直線の傾きを粒子径に対してプロットしています。

プラズモン・トラッピングについて。エラーバーは線形近似の標準偏差を示しています。この結果は、粒子が大きくなるほど、十分なトラッピング安定性を維持するためにより高いレーザー強度が必要であることを示しています。

この概略図は、1D周期ナノ構造を利用した強化光学トラッピングを示しています。入射ビームは、遠方場において周期ナノ構造によって回折されます。ここでは、アルミニウムグレーティング表面における2つの直交偏光を持つ光の強度分布を示しています。

有限差分時間領域法（FDTD）シミュレーションによって得られた417 nanometerの周期を用い、分布を平坦なアルミニウム表面上の強度で正規化しました。これらの図は、グレーディング表面の直上にある粒子のトラッピングポテンシャルを粒子の位置に対して示したものです。CAの350 nanometerポリスチレンビーズおよびDAの1 µmポリスチレンビーズについて、白丸で粒子のサイズを示しています。

挿入図は、平坦なアルミニウム表面上のトラッピングポテンシャルを示しています。比較のため、同一の粒子サイズを用いています。値は粒子サイズごとに正規化されています。

すべてのFDTDシミュレーション図において、視野は10 $\mu\text{m}$ $\times$ 8 $\mu\text{m}$です。ここでは、ビームの偏光方向がグレーディング線に垂直な条件下で測定された、さまざまなサイズのポリスチレンビーズのトラップ効率と最小トラップ強度が示されています。挿入図は、3.87 $\mu\text{m}$のポリスチレンビーズをグレーディングの罫線に対して垂直および平行に移動させた際の、トラップ効率のトラップ非対称性を示しています。

粒子における並進角の模式的な表現をここに示します。この挿入図は、異なる偏光および粒子サイズにおける並進方向に対する増強度を示しています。実線で示された大きな非対称性は、グレーディングに対して垂直に偏光した入射光を用いて得られ、破線は...

グレーディングに平行に偏光した入射光を用いると、小さな非対称性が得られます。これらのパネルは、蛍光590 nanometerポリスチレンビーズのトラッピングの実演を示しています。レーザー光は当初、視認できないほど弱かったため、赤色の円でレーザースポットの位置を示しています。

高出力では、粒子はスポット内に捕捉されます。出力を下げると、粒子のブラウン運動が捕捉力を上回り、粒子が脱出できるようになります。ここでは、蛍光標識した卵巣癌細胞の核を捕捉しており、捕捉を開始するために必要な最小強度は、20倍対物レンズを用いて得られた16 micro watts per micrometer squaredでした。

このビデオを視聴することで、プラズモニックおよびフォトニック結晶ナノ構造基板を用いた、マイクロおよびナノサイズの生物学的試料を非侵襲的に操作するための低強度光トラップの構築方法について、十分に理解することができます。