ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

この方法は、安定同位体希釈、cnor相、液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気圧、化学イオン化、および質量分析の組み合わせにより、細胞の生理活性脂質代謝物を正確に定量することを目的としています。まず、培地と細胞サンプルの両方を回収し、重同位体標識された内部標準ミックスを添加します。有機溶媒で生理活性脂質を抽出し、電子捕捉試薬で生理活性脂質を誘導し、液体クロマトグラフィーで生理活性脂質を精密に定量します。

細胞ライセートと培地の両方のLCMS分析による質量分析により、標的となる生理活性脂質の濃度と個々のAnant ERのレベルが正確に決定されます。逆相液体クロマトグラフィー、質量分析、その他の LCMS 法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、自動車順相クロマトグラフィーと安定化同位体希釈法を使用して、個々の抗体とアンターを正確に定量できることです。得られたデータは、細胞内で機能する酵素経路に関する貴重な洞察を提供することができます。

接着剤の10cmプレートごとに、細胞は10ミリリットルのガラス遠心チューブに3ミリリットルの培地を収集します。次に、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、1ミリリットルのPBSを加え、細胞をプレートからこすり落とし、サンプルを2番目から10ミリリットルのガラス遠心分離管に移します。

検量線用に、3ミリリットルのPBSを含む8本のチューブを追加で調製します。次に、各チューブに10マイクロリットルの適切な校正標準器を追加します。回収した3ミリリットルの細胞培養培地の各試験サンプルを、遊離生理活性脂質の抽出用に整列させます。

各キャリブレーション標準に10マイクロリットルの内部標準混合物を加え、室温で10分間平衡化して、5ミリリットルのダチルエーテルでサンプルを処理し、シェーカーに30分間置きます。サンプルを遠心分離し、上部有機相を10ミリリットルのガラス遠心チューブに移します。まず、回収した細胞サンプルを遠心分離で収集し、各パレットをVortex Reserveで2ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞溶解物の標準化のために各サンプルの25マイクロリットルを再懸濁します。

次に、各ライセートを10ミリリットルのガラス遠心チューブに均等に分割します。遊離細胞脂質を測定し、プロスタグランジンなどの脂質のアルカリ性分解を避けるために、各サンプルにさらに2ミリリットルのPBSと10マイクロリットルのISMを追加し、各サンプルの複製の1つを使用して、前に示したようにダチルエーテル抽出を実行します。エステル化脂質を抽出するには、残りの各サンプルに5ミリリットルのクロロホルムメタノール混合物を追加します。

シェーカーに低速で30分間置き、次に10分間遠心分離します。次に、下部の有機層を収集し、サンプルを窒素下で乾燥させてエステル化脂質を精製します。各チューブに0.4%メタノール中の0.4の正常水酸化カリウムを0.5ミリリットル加えます。.

サンプルを摂氏60度で1時間インキュベートします。次に、2ミリリットルのPBSを追加し、濃塩酸でpH two 6を調整します。最後に、各サンプルに10マイクロリットルのISMを加え、乾燥させたサンプルとキャリブレーション標準液へのダチルエーテル抽出に進みます。

誘導体化試薬を指定の順序で添加します。次に、サンプルをボルテックスし、摂氏60度で1時間インキュベートします。次に、サンプルを窒素下で乾燥させてから、保管および分析します。

この分析法では、安定同位体希釈法、chii法、液体クロマトグラフィー法、電子捕獲法、大気圧法、化学イオン化法、質量分析法を組み合わせて使用します。ヘキサンエタノールの100マイクロリットルでサンプルと校正標準を再構成し、インサート付きのHPLCバイアルにサンプル全体を移し、サンプルを冷やしたオートサンプラーに置きます。分析用のサンプルリストを作成します。

次に、順相分離の書面によるプロトコールの表 1 と表 2 に記載されているパラメーターを使用して、HPLC および MS メソッドをセットアップします。カイラルパックであるDHカラムを摂氏30度まで注入し、サンプルを注入して分析を開始します。次に、A PCIソースを使用してMSをマイナスイオンモードに設定します。

ヘキサンブランクから始めて、カラムを平衡化します。次に、SM濃度が上がる順にキャリブレーション用標準試料を泳ぎます。HBLC分離後も、培養培地の試験サンプルの処理を続けます。

コロナニードルへの堆積を避けるために、メタノールポストカラムを追加します。標準から生成されたデータを使用します。Y 軸上にサンプル領域をプロットする検量線を作成し、X 軸上の標準濃度から Y と MX と B の方程式を導き出します。

最後に、細胞の生理活性脂質の試験サンプル濃度を決定します。リセイト。これらの値を正規化するには、決定された生理活性脂質の濃度を、プレートあたりの細胞数または前のステップで正規化した総タンパク質で割ります。複数の反応モニタリングからのデータは、いくつかのリノール酸とアラキドン酸を示しています。

酸化代謝産物。13および9は、対応する13および9のオキソオードとともに保持され、リノール酸に由来する。さらに、アラキドン酸の熱代謝物とその酸化生成物も予想通り存在します。

ディレーティングされた内部標準の保持時間は、ラベルなし標準と比較してわずかにシフトします。重要なことに、このプロトコルは熱と舌を分離し、アラキドン酸の酵素酸化または活性酸素種との反応から生じる可能性のある立体異性体のユニークな遷移を決定します。たとえば、このクロマトグラムは、r と s の立体異性体の間の分離が 5 であることを示しています。

熱リピドミクス分析は、多数の脂質種の分析に有効な手法です。例えば、この実験では、プロスタグランジン、isop senes、ロイコトリエンB fourを評価および定量化します。Oxoが食べる熱とオメガヒドロキシル化代謝物に加えて、この方法は、血漿、尿、組織などの他の生物学的マトリックスからの生理活性脂質の抽出に最適化できます。

場合によっては、生理活性脂質が酸化ストレスの応答バイオマーカーとして使用されています。