Name: ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ 細胞からのバイオアクティブ脂質抽出法。安定同位体希釈とLC-MSを用いて、細胞内脂質代謝物を正確に定量し、酵素経路の解析に有用なデータを提供します。

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生理活性脂質の測定に利用可能な現在のほとんどの生物分析法は、キラル順相クロマトグラフィーやSIDを含まないため、それほど広範ではありません。キラル順相LCは、エナンチオマーの分離や、酵素介在代謝とROS媒介代謝を区別するために重要です。SIDを使用すると、抽出または分析中に発生する人為的エラーや合併症が定量化時に考慮されます。これらの添加成分とECAPCI-MRMにより、生理活性脂質の分析に最も感度が高く、選択的な分析法となります。

1. 標準と内部の標準ミックス
<ol>
	<li>脂質抽出の前に、標準混合物(SM)と内部標準混合物(ISM)を調製する必要があります。SMについては、以下の試薬表に記載されている各標準試料(合計25個)の等量1 μgを、較正済みシリンジを使用して10 mLメスフラスコに分注します。標準試料を窒素下で乾燥させ、10 mLのアセトニトリル(ACN)に溶解します。標準混合物の最終濃度は100 pg/μLです。1 mLアリコートに分割し、必要になるまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>このスタンダードミックスから、6つのスタンダード希釈を行い、合計7つのキャリブレーションスタンダード(1 pg/μL、2 pg/μL、5 pg/μL、10 pg/μL、20 pg/μL、50 pg/μL、100 pg/μL)を希釈できます。これらの標準試料は、定量分析で使用する検量線を作成するために調製したサンプルの各バッチで分析します。</li>
	<li>ISMについては、以下の試薬表に記載されている各ISの等価容量1μg(合計14個)を、校正済みシリンジを使用して10mLメスフラスコに分注し、窒素下で乾燥させます。10 mLのACNでISMを再構成し、1 mLアリコートに分割します。ISMの最終濃度は100 pg/μLである必要があります。1000サンプルを処理するのに十分なISMがあります。</li>
	<li>SMとISMは-80°Cで保管してください。</li>
</ol>
2. 培地と細胞溶解液の採取
<ol>
	<li>接着細胞(~1 X 107)の10 cmプレートごとに、10 mLのガラス遠心チューブに3 mLの培地を回収します。次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。1 mLのPBSをプレートに加え、細胞をプレートからこすり落とし、2番目の10 mLガラス遠心チューブにピペットで移します。この時点で手順が続行されない場合、この時点で細胞および培地が保存されてもよい。サンプルは、長期保存の場合は-80°C、-20°Cの場合は1週間未満で保存します。</li>
</ol>
3. 培地からの脂質の抽出
<ol>
	<li>遊離生理活性脂質は細胞培地中に存在し、これらはワンステップのl-l抽出手順で容易に抽出できます。回収した培地(2.1)に、10 μLのISMを加えます。このとき、さらに8本の10 mLガラス製遠心チューブに、キャリブレーション標準用に#0-7とラベル付けする必要があります。これらの各チューブに3 mLのPBSを添加し、次にチューブ1〜7(1.1から1〜7)に適切なSMを10 μL加えます。</li>
	<li>各キャリブレーション標準試料とサンプルでISMを10分間平衡化した後、5 mLのジエチルエーテルを加えます。次に、サンプルとキャリブレーションスタンダードを室温で30分間低速でシェーカーに入れます。</li>
	<li>振とうした後、すべてのキャリブレーション標準試料とサンプルを1935 x gで10分間遠心分離します。次に、パスツールピペットを使用して、上相(有機)を新しい10 mLガラス遠心チューブに移し、窒素下で乾燥させます。</li>
</ol>
4. 細胞溶解物からの脂質の抽出
<ol>
	<li>ガラス製遠心チューブ内の細胞サンプルを1935 X gで5分間スピンダウンします。上清を処分します。各チューブに2mLのPBSを加え、短時間ボルテックスします。タンパク質定量のために25 μLのサンプルを取り出します。全タンパク質は、細胞ライセートの標準化に使用されます。</li>
	<li>次に、ライセート/PBS混合物の半分を別の10 mLガラス遠心チューブに移します。各サンプルに、さらに2 mLのPBSと10 μLのISMを加えます。3.2 および 3.3 のメディアについて説明した l-l 抽出プロセスに従います。このアリコートは、細胞内の遊離脂質を測定し、プロスタグランジンなどの脂質のアルカリ性分解を回避するために使用されます。このアリコートは、以下に説明するステップ4.3および4.4を経ません。</li>
	<li>エステル化脂質l-l抽出プロセスの最初のステップでは、各サンプルに5 mLのCHCl3/MeOH(2:1)を添加する必要があります。サンプルをシェーカーに低速で30分間セットします。振とうした後、サンプルを1935 x gで10分間遠心分離します。次に、パスツールピペットを使用して、l-l抽出の底部(有機)層を新しい10 mLガラス遠心チューブに移し、サンプルを窒素下で乾燥させます。</li>
	<li>エステル化脂質は、定量前に鹸化する必要があります。サンプルが乾いたら、0.5 mLの0.4N KOHを80% MeOHで各チューブに加えます。その後、サンプルを60°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBS2mLを加えます。濃厚なHCl酸(~30 μL)でpHを6に調整します。各サンプルに10 μLのISMを加えます。残りの手順は、培地からの脂質抽出と同じで、3.2および3.3で実行できます。</li>
	<li>これらの抽出を培地サンプルと同時に行う場合は、同じキャリブレーション標準試料を使用して検量線を作成できますが、これらのサンプルを別の時間に行う場合は、3.1-3.3で説明したようにキャリブレーション標準も処理する必要があります。</li>
</ol>
5. 臭化ペンタフルオロベンジル(PFB)誘導体化
<ol>
	<li>乾燥させたサンプルとキャリブレーション標準液に、無水ジクロロメタン(CH2Cl2)100 μL、続いて無水CH2Cl2に20%(v/v)N,N-ジイソプロピルエチルアミン100 μLを加え、最後に無水CH2Cl2に20%(v/v)PFBを100 μL加えます。</li>
	<li>誘導体化試薬を添加した後、サンプルをボルテックスし、60°Cで1時間インキュベートし、窒素下で乾燥させます。サンプルと校正用標準試料は、すぐに分析しない場合は-80°Cで、または-20°Cで最大1週間保存できます。</li>
</ol>
6. 安定同位体希釈キラル液体クロマトグラフィー 電子捕獲 大気圧化学イオン化質量分析 (SID-LC-ECAPCI-MS) 分析
<ol>
	<li>乾燥させたサンプルとキャリブレーションスタンダードを100 μLのヘキサン/エタノール(97:3)に再溶解します。その後、サンプル全体をインサート付きのHPLCバイアルに移すことができます。チルドオートサンプラー(4°C)にサンプルを入れ、分析用のサンプルリストを作成します。</li>
	<li>次に、以下の表 1 および表 2 に記載されているパラメーターを使用して、HPLC および MS メソッドをセットアップします。表 3 には、各脂質の MRM 遷移エネルギーとコリジョンエネルギー(CE)、Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 分析からの推定保持時間など、特定の化合物情報が含まれています。CE は、分析法開発中に個々の脂質を調整することによって決定されます。</li>
	<li>順相分離には、30°Cに加熱したChiralpak AD-Hカラム(4.6 X 250 mm、5 μ)を使用します。開始移動相は 98% ヘキサンと 2% メタノール/イソプロパノール(1:1)です。HPLC分離後、メタノールをポストカラム(0.75 mL/分)に添加して、感度の低下を引き起こすコロナ針への沈着を回避します。MSは、APCIソースを使用してマイナスイオンモードに設定されます。ソースをESIからAPCIに変更する必要がある場合は、必ずコロナ針を挿入してください。</li>
	<li>最初に実行する必要があるサンプルは、常にヘキサンブランクです。これにより、カラムが平衡化され、キャリブレーション標準およびサンプル分析に干渉する可能性のある汚染がカラムに存在しないかどうかも明らかになります。</li>
	<li>次に実行するサンプルは、0〜7の順でキャリブレーション標準サンプルである必要があります(SM濃度が増加します)。これらの標準試料は、Y 軸上の標準面積/IS 面積と X 軸上の標準濃度または質量の比を含む検量線を作成するために使用されます。このプロットから導かれるy = mx + bの式から、サンプル面積/IS面積(y)の比率を使用して、サンプル(未知)の量または濃度(x)を決定できます。</li>
	<li>培地に含まれる生理活性脂質の量は、培地の総量に正規化でき、細胞溶解物に含まれる脂質の量は、細胞/プレートの総数または総タンパク質/プレートの量のいずれかに正規化できます。プロトコルの4.1では、細胞のカウントまたはタンパク質の定量化を確実にするための対策を講じる必要があります。</li>
</ol>
7. 代表的な結果:
図 1 のクロマトグラムは、ターゲットリピドミクスプロファイルを表しています。最初のパネル(図1A)は、13-HODEと9-HODE、およびリノール酸に由来する対応する13-および9-オキソODEを示しています。また、15-HETEの酸化代謝物である15-oxoETEも2枚目のパネルに示されています。下の 2 つのパネルは、20-HETE と 20-HETE-IS、[2H6]-20-HETE を示しています。図 1B は、AA の酵素酸化または ROS によって生じる HETE 立体異性体の分離と固有の遷移を示しています。図1Cは、PG、isoP、およびLTB4を表しています。一部の標準には、市販されている重水素化ISがありません。したがって、保持時間が類似しているISが定量化に使用されます。例えば、[2H8]-12(S)-HETEは、12(R)-HETEおよび12(S)-HETEに加えて、11-HETEおよび8-HETE種を定量するために使用されます。
代表的なクロマトグラムから、重水素化ISの保持には、非標識標準と比較してわずかなシフトがあることが明らかです。この保持時間の後方へのシフトは、順相カラムとの重水素相互作用の結果です。重水素は水素よりも極性が高いです。したがって、カラムの順相との相互作用が強くなります。この分離が逆相カラムを使用して行われていた場合、より極性のある部分が逆相との相互作用が弱くなるため、より早い保持時間に移行します。
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Figure 1"> 
図 1.この図は、ターゲットリピドミクス分析の代表的な例です。 図 1A は、最初のパネルの 13-oxoODE および 9-oxoODE、2 番目のパネルの 15-oxoETE、13-HODE および 9-HODE(パネル 3 および 5)、20-HETE(パネル 7)を含むいくつかの LA および AA 酸化代謝物の総イオンクロマトグラム(TIC)を示しています。 HODEと20-HETEは、下のパネル(4、6、8)に対応する重水素化ISを持っています。図 2B の TIC は、AA に由来する HETE 立体異性体の分離と固有の遷移を示しています。 図2Cは、PG、isoP、およびLTを表しています。 コリジョンエネルギー(CE)、MRM トランジション、および保持時間(RT、分)は、Waters 2695 LC と Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra を組み合わせて最適化し、各化合物の表 3 に示します。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>時間 (分)</td>
			<td>パーセントA</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>名
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>名
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>名
			<td>96.4</td>%
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>名
			<td>92</td>名
			<td>8</td>名
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>名
			<td>92</td>名
			<td>8</td>名
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>名
			<td>50</td>名
			<td>50</td>名
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>名
			<td>50</td>名
			<td>50</td>名
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>名
			<td>98</td>名
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>名
			<td>98</td>名
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1.キラル順相リピドミクス分離のためのHPLCグラジエント条件。溶媒Aは100%ヘキサンで、溶媒Bはメタノール/イソプロパノール(1:1)です。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>質量分析パラメータ</td>
			<td>設定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>源</td>
			<td>APCIの</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>モード</td>
			<td>マイナスイオン</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>メソッドの長さ</td>
			<td>40分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM スキャン幅</td>
			<td>0.002メートル/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM スキャン時間</td>
			<td>0.15秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM ピーク幅</td>
			<td>0.70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>チューブレンズ</td>
			<td>164ボルト</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>出典:CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2コリジョンガス</td>
			<td>ユニット : 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>気化器の温度</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>キャピラリー温度</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放電電流</td>
			<td>0μAの</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>シースガス圧力</td>
			<td>ユニット : 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>イオンスイープ圧力</td>
			<td>ユニット : 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>補助ガス圧力</td>
			<td>ユニット : 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2.上記にリストされているのは、生理活性脂質の測定に最適化された質量分析パラメーターです。 これらのパラメータは、サーモフィッシャーTSQ Quantum Ultraから取得されます。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>遷移</td>
			<td>セリウム (eV)</td>
			<td>RT (分)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-オキソODE</td>
			<td>293.03→113.10</td>
			<td>21</td>名
			<td>9.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-オキソODE</td>
			<td>293.03→113.10</td>
			<td>21</td>名
			<td>17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-オキソETE</td>
			<td>317.05→113.18</td>
			<td>18</td>名
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-ホード</td>
			<td>295.03→195.12</td>
			<td>18</td>名
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-ホーデ</td>
			<td>295.03→195.12</td>
			<td>18</td>名
			<td>14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299.03→198.12</td>
			<td>18</td>名
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-ホーデ</td>
			<td>295.03→171.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-ホーデ</td>
			<td>295.03→171.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299.03→172.12</td>
			<td>18</td>名
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETEの</td>
			<td>319.03 → 289.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325.03→295.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04→115.04</td>
			<td>16</td>名
			<td>15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04→115.04</td>
			<td>16</td>名
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327.04→116.04</td>
			<td>16</td>名
			<td>16.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETEについて</td>
			<td>319.04→179.11</td>
			<td>14</td>名
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319.04→179.11</td>
			<td>14</td>名
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327.13→184.11</td>
			<td>14</td>名
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETEの</td>
			<td>319.04→219.12</td>
			<td>13</td>名
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319.04→219.12</td>
			<td>13</td>名
			<td>15.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327.03→226.12</td>
			<td>13</td>名
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319.04→167.11</td>
			<td>16</td>名
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319.04→167.11</td>
			<td>16</td>名
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319.04→155.09</td>
			<td>16</td>名
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319.04→155.09</td>
			<td>16</td>名
			<td>12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>の
			<td>335.03→195.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339.03→197.10</td>
			<td>18</td>名
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGEの2</td>
			<td>351.03→271.15</td>
			<td>18</td>名
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355.03→275.15</td>
			<td>18</td>名
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGDの2</td>
			<td>351.03→271.15</td>
			<td>25</td>名
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355.03→275.15</td>
			<td>25</td>名
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-ISO-PGE2</td>
			<td>351.03→271.15</td>
			<td>18</td>名
			<td>37.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGFの2</td>
			<td>353.03→193.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357.03→197.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353.03→193.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357.03→197.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353.03→193.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>34.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357.03→197.11</td>
			<td>25</td>名
			<td>34.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 3.この表は、図 1A-C の全イオンクロマトグラムで検出された化合物の一覧です。 2 番目の列は MRM/MS に使用される遷移を示し、3 番目の列はコリジョンエネルギー (CE、eV) を、最後の列は保持時間 (RT、分) を示します。 パラメーターの最適化は、Waters 2695 分離モジュールと Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra を組み合わせて使用しました。

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

このプロトコルで使用される標準および内部標準は、標的リピドミクス法の表現を提供します。LC-MS 分析には Waters 2695 分離モジュールと Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra を使用し、最適なパラメーター設定を 表 1 および 表 2 に示します。さらに、この抽出プロトコルは接着細胞用に設計されましたが、他の細胞型や尿、血液、組織などの他の生物学的マトリックス用に変更することもできます。多くの脂質標準物質が市販されており、この分析に組み込むことができます。誘導体化手順では、無水溶媒と最高純度の N,N-ジイソプロピルエチルアミンを使用することが重要です。LC-MS分析では、最高純度の溶媒を使用することも重要です。これらの溶媒は試薬リストにリストされています。メタノールのポストカラム添加は、メソッドの感度を大幅に低下させるため、コロナ針への堆積の蓄積を防ぐためにも重要です。
校正標準物質を含めることで、正確な定量の手段が提供されるだけでなく、研究者は抽出または...

<table><tbody><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7酸</td><td>ケイマン化学</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE 内部標準</td></tr><tr><td>5S-ヒドロキシ-6E,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸-5,6,8,9,11,12,14,15-d8酸</td><td>ケイマン化学</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE 内部標準</td></tr><tr><td>12S-ヒドロキシ-5Z,8Z,10E,14Z-エイコサテトラエン-5,6,8,9,11,12,14,15-d8酸</td>ケイ<td>マン化学</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE 内部標準</td></tr><tr><td>15S-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエン酸-5,6,8,9,11,12,14,15-d8酸</td><td>ケイマン化学</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE内部標準</td></tr><tr><td>20-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸-16,16,17,17,18,18-d6 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE 内部標準</td></tr><tr><td>9S-ヒドロキシ-10E,12Z-オクタデカジエン酸-9,10,12,13-d4 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE 内部標準</td></tr><tr><td>13S-ヒドロキシ-9Z,11E-オクタデカジエン酸-9,10,12,13-d4 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE 内部標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-トリヒドロキシ-プロスタ-5Z,13E-ジエン-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha;</サブ>内部標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-トリヒドロキシ-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4酸</td>ケイ<td>マン化学</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a 内部標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4酸</td>ケイ<td>マン化学</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2内部標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-ジヒドロキシ-11-オキソ-プロスタ-5Z,13E-ジエン-1-オイック-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4酸</td>ケイ<td>マン化学</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2内部標準</td></tr><tr><td>9-オキソ-11&α;,15S-ジヒドロキシプロスタ-5Z,13E-ジエン-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4酸</td><td>ケイマン化学</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 内部標準</td></tr><tr><td>5S,12R-ジヒドロキシ-6Z,8E,10E,14Z-エイコサテトラエン酸-6,7,14,15-d4 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 内部標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-トリヒドロキシ-トロンバ-5Z,13E-ジエン-1-oic-3,3,4,4-d4 酸</td><td>ケイマン化学</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 内部標準</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>ケイマン化学</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE 標準</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,8Z,10E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE 標準</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE 標準</td></tr><tr><td>5R-ヒドロキシ-6E,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE 標準</td></tr><tr><td>5S-ヒドロキシ-6E,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE 標準</td></tr><tr><td>8R-ヒドロキシ-5Z,9E,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE 標準</td></tr><tr><td>8S-ヒドロキシ-5Z,9E,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE 標準</td></tr><tr><td>11R-ヒドロキシ-5Z,8Z,12E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE 標準</td></tr><tr><td>11S-ヒドロキシ-5Z,8Z,12E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE 標準</td></tr><tr><td>12R-ヒドロキシ-5Z,8Z,10E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE 標準</td></tr><tr><td>12S-ヒドロキシ-5Z,8Z,10E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE 標準</td></tr><tr><td>15R-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE 標準</td></tr><tr><td>15S-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE 標準</td></tr><tr><td>20-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>90030</td><td>20-HETE 標準</td></tr><tr><td>9R-ヒドロキシ-10E,12Z-オクタデカジエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>38405</td><td>9(R)-HODE 標準</td></tr><tr><td>9S-ヒドロキシ-10E,12Z-オクタデカジエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>38410</td><td>9(S)-HODE 標準</td></tr><tr><td>13R-ヒドロキシ-9Z,11E-オクタデカジエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>38605</td><td>13(R)-HODE 標準</td></tr><tr><td>13S-ヒドロキシ-9Z,11E-オクタデカジエン酸</td><td>ケイマン化学</td><td>38610</td><td>13(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>ケイマン化学</td><td>16010</td><td>PGF2&alpha;</サブ>スタンダード</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-トリヒドロキシ-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>ケイマン化学</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alpha;標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;,15S-トリヒドロキシ-プロスタ-5Z,13E-ジエン-1-オイック酸</td><td>ケイマン化学</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 標準</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-ジヒドロキシ-11-オキソ-プロスタ-5Z,13E-ジエン-1-オイック酸</td><td>ケイマン化学</td><td>12010</td><td>PGD2 標準</td></tr><tr><td>9-オキソ-11&alpha;,15S-ジヒドロキシ-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>ケイマン・ケミカル</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 スタンダード</td></tr><tr><td>9-オキソ-11&alpha;,15S-ジヒドロキシ-プロスタ-5Z,13E-ジエン-1-オイック酸</td><td>ケイマン・ケミカル</td><td>14010</td><td>PGE2 スタンダード</td></tr><tr><td>5S,12R-ジヒドロキシ-6Z,8E,10E,14Z-エイコサテトラエン酸</td><td>ケイマン・ケミカル</td><td>20110</td><td>LTB4 スタンダード</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>ケイマン化学</td><td>19030</td><td>TxB2 標準</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>無水</td></tr><tr><td><>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>ペンタフルオリルベンジルブロマイド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック サイエンティフィック <td>366927</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコン ラボラトリーズ</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ガラス遠心分離管</td><td>キンブルチェイス</td><td>73785-10</td><td>スクリューキャップ</td></tr><tr><td>フェノールスクリューキャップ</td><td>キンブルチェイス</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Chiralcel ADH カラム</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>HPLC バイアル</td><td>ウォーターズ</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>HPLC インサート</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

アラキドン酸(AA)やリノール酸(LA)などの脂肪酸の代謝は、多数の立体異性体1,2を含む酸化された生理活性脂質の形成をもたらします。これらの代謝産物は、遊離脂肪酸またはエステル化脂肪酸から形成できます。これらの酸化代謝産物の多くは生物学的活性を持ち、心血管疾患や神経変性疾患、喘息、癌など様々な疾患に関与している3-7。酸化された生理活性脂質は、酵素的に形成されるか、活性酸素種(ROS)によって形成されます。脂肪酸を代謝する酵素には、シクロオキシゲナーゼ(COX)、リポキシゲナーゼ(LO)、およびシトクロムP450(CYPs)1,8が含まれます。酵素代謝はエナンチオ選択的形成をもたらしますが、ROS酸化は製品のラセミ形成をもたらします。
このプロトコルは、主にAAおよび一部のLA由来の生理活性代謝物の分析に焦点を当てていますが、他の脂肪酸の代謝物にも簡単に適用できます。生理活性脂質は、液液(l-l)抽出を使用して細胞溶解物または培地から抽出されます。l-l抽出プロセスの開始時に、サンプル調製中のエラーを考慮して、安定同位体内部標準を添加します。安定同位体希釈(SID)は、質量分析(MS)分析中に代謝物が経験する可能性のあるイオン抑制などの差も考慮します9。抽出後、電子捕獲(EC)試薬である臭化ペンタフルオリルベンジル(PFB)による誘導体化を行い、検出感度を向上させる10,11。多重反応モニタリング(MRM)は、MS分析の選択性を高めるために使用されます。MS分析の前に、キラル順相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して脂質を分離します。HPLC条件は、モニター対象脂質12のエナンチオマーと種々の立体異性体を分離するように最適化されている。この特定の LC-MS 分析法は、プロスタグランジン(PG)、イソプロスタン(isoP)、ヒドロキシエイコサテトラエン酸(HETE)、ヒドロキシオクタデカジエン酸(HODE)、オキソエイコサテトラエン酸(オキソET)、オキソオクタデカジエン酸(オキソ ODE)をモニターします。しかし、HPLCおよびMSパラメータは、任意の脂肪酸代謝物を含むように最適化することができる13。
現在利用可能なバイオアナリシス法のほとんどは、エナンチオマーの個別の定量を考慮していません。これは、代謝産物が酵素的に形成されたのか、ROSによって形成されたのかを推測しようとする場合に非常に重要です。さらに、エナンチオマーの比率は、特定の酵素形成経路の証拠を提供する可能性があります。SIDを使用すると、代謝物の正確な定量が可能になり、調製中のサンプル損失やイオン化中に経験した違いを説明できます。PFB電子捕獲試薬を使用すると、従来のAPCI法に比べて検出感度が2桁向上します。全体として、この方法(SID-LC-EC-大気圧化学イオン化APCI-MRM/MS)は、生理活性脂質の定量において最も感度が高く、選択的で、正確な方法の1つです。

このプロトコールは、細胞からの遊離およびエステル化された生理活性脂肪酸の抽出および分析を実証します。脂肪酸は、安定同位体希釈、キラル液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気化学イオン化、多重反応モニタリング質量分析(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)を用いて正確に定量されます。

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

この方法は、安定同位体希釈、cnor相、液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気圧、化学イオン化、および質量分析の組み合わせにより、細胞の生理活性脂質代謝物を正確に定量することを目的としています。まず、培地と細胞サンプルの両方を回収し、重同位体標識された内部標準ミックスを添加します。有機溶媒で生理活性脂質を抽出し、電子捕捉試薬で生理活性脂質を誘導し、液体クロマトグラフィーで生理活性脂質を精密に定量します。細胞ライセートと培地の両方のLCMS分析による質量分析により、標的となる生理活性脂質の濃度と個々のAnant ERのレベルが正確に決定されます。逆相液体クロマトグラフィー、質量分析、その他の LCMS 法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、自動車順相クロマトグラフィーと安定化同位体希釈法を使用して、個々の抗体とアンターを正確に定量できることです。得られたデータは、細胞内で機能する酵素経路に関する貴重な洞察を提供することができます。接着剤の10cmプレートごとに、細胞は10ミリリットルのガラス遠心チューブに3ミリリットルの培地を収集します。次に、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、1ミリリットルのPBSを加え、細胞をプレートからこすり落とし、サンプルを2番目から10ミリリットルのガラス遠心分離管に移します。検量線用に、3ミリリットルのPBSを含む8本のチューブを追加で調製します。次に、各チューブに10マイクロリットルの適切な校正標準器を追加します。回収した3ミリリットルの細胞培養培地の各試験サンプルを、遊離生理活性脂質の抽出用に整列させます。各キャリブレーション標準に10マイクロリットルの内部標準混合物を加え、室温で10分間平衡化して、5ミリリットルのダチルエーテルでサンプルを処理し、シェーカーに30分間置きます。サンプルを遠心分離し、上部有機相を10ミリリットルのガラス遠心チューブに移します。まず、回収した細胞サンプルを遠心分離で収集し、各パレットをVortex Reserveで2ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞溶解物の標準化のために各サンプルの25マイクロリットルを再懸濁します。次に、各ライセートを10ミリリットルのガラス遠心チューブに均等に分割します。遊離細胞脂質を測定し、プロスタグランジンなどの脂質のアルカリ性分解を避けるために、各サンプルにさらに2ミリリットルのPBSと10マイクロリットルのISMを追加し、各サンプルの複製の1つを使用して、前に示したようにダチルエーテル抽出を実行します。エステル化脂質を抽出するには、残りの各サンプルに5ミリリットルのクロロホルムメタノール混合物を追加します。シェーカーに低速で30分間置き、次に10分間遠心分離します。次に、下部の有機層を収集し、サンプルを窒素下で乾燥させてエステル化脂質を精製します。各チューブに0.4%メタノール中の0.4の正常水酸化カリウムを0.5ミリリットル加えます。.サンプルを摂氏60度で1時間インキュベートします。次に、2ミリリットルのPBSを追加し、濃塩酸でpH two 6を調整します。最後に、各サンプルに10マイクロリットルのISMを加え、乾燥させたサンプルとキャリブレーション標準液へのダチルエーテル抽出に進みます。誘導体化試薬を指定の順序で添加します。次に、サンプルをボルテックスし、摂氏60度で1時間インキュベートします。次に、サンプルを窒素下で乾燥させてから、保管および分析します。この分析法では、安定同位体希釈法、chii法、液体クロマトグラフィー法、電子捕獲法、大気圧法、化学イオン化法、質量分析法を組み合わせて使用します。ヘキサンエタノールの100マイクロリットルでサンプルと校正標準を再構成し、インサート付きのHPLCバイアルにサンプル全体を移し、サンプルを冷やしたオートサンプラーに置きます。分析用のサンプルリストを作成します。次に、順相分離の書面によるプロトコールの表 1 と表 2 に記載されているパラメーターを使用して、HPLC および MS メソッドをセットアップします。カイラルパックであるDHカラムを摂氏30度まで注入し、サンプルを注入して分析を開始します。次に、A PCIソースを使用してMSをマイナスイオンモードに設定します。ヘキサンブランクから始めて、カラムを平衡化します。次に、SM濃度が上がる順にキャリブレーション用標準試料を泳ぎます。HBLC分離後も、培養培地の試験サンプルの処理を続けます。コロナニードルへの堆積を避けるために、メタノールポストカラムを追加します。標準から生成されたデータを使用します。Y 軸上にサンプル領域をプロットする検量線を作成し、X 軸上の標準濃度から Y と MX と B の方程式を導き出します。最後に、細胞の生理活性脂質の試験サンプル濃度を決定します。リセイト。これらの値を正規化するには、決定された生理活性脂質の濃度を、プレートあたりの細胞数または前のステップで正規化した総タンパク質で割ります。複数の反応モニタリングからのデータは、いくつかのリノール酸とアラキドン酸を示しています。酸化代謝産物。13および9は、対応する13および9のオキソオードとともに保持され、リノール酸に由来する。さらに、アラキドン酸の熱代謝物とその酸化生成物も予想通り存在します。ディレーティングされた内部標準の保持時間は、ラベルなし標準と比較してわずかにシフトします。重要なことに、このプロトコルは熱と舌を分離し、アラキドン酸の酵素酸化または活性酸素種との反応から生じる可能性のある立体異性体のユニークな遷移を決定します。たとえば、このクロマトグラムは、r と s の立体異性体の間の分離が 5 であることを示しています。熱リピドミクス分析は、多数の脂質種の分析に有効な手法です。例えば、この実験では、プロスタグランジン、isop senes、ロイコトリエンB fourを評価および定量化します。Oxoが食べる熱とオメガヒドロキシル化代謝物に加えて、この方法は、血漿、尿、組織などの他の生物学的マトリックスからの生理活性脂質の抽出に最適化できます。場合によっては、生理活性脂質が酸化ストレスの応答バイオマーカーとして使用されています。

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。...

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