たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

本手順の全体的な目的は、主流煙中のフリーラジカル量を測定し、いくつかの抗酸化剤のスカベンジング能力を評価することである。まず、複数の異なるスカベンジャー化合物を含むフィルターと、スカベンジャーを含まないコントロールフィルターを準備する。続いて、研究用タバコの煙をスピントラッピング溶液に通すことで、喫煙シミュレーションを行う。

次に、電子スピン共鳴（ESRと略記）を用いて、トラップされたラジカルおよび参照試料のスペクトルを記録します。得られたESRスペクトルに対してルーチン解析を行い、トラップされた気相ラジカルの信号をバックグラウンドから分離し、参照試料を用いてラジカル濃度を定量します。最終的に、スピン trapping ESR分光法を通じて、主流タバコ煙中のフリーラジカル含量に関する定量的な情報と、天然抗酸化物質の消去能の推定結果が得られます。

ガスクロマトグラフィーのような既存のタバコ煙分析法に対する本手法の主な利点は、ESRが遊離基（フリーラジカル）に対して特異的に感度を持つことです。遊離基は主要な発がん性物質群であるため、この手法の活用はタバコ煙による有害な影響を軽減することに寄与し得ます。本法はタバコ煙中の遊離基の研究に知見を提供できるだけでなく、工業排煙などの他のシステムにも適用可能です。電子スピン共鳴技術に関する国立生物医学研究センター（certとしても知られる）は、最新のESR技術開発における当センターの広範な経験に基づいて設立されました。

電子スピン共鳴に従事している研究者の皆様、およびバイオメディカルコミュニティの皆様に向けて、多種多様なサービスを提供しています。当施設の設備は、タバコフィルターへの抗酸化剤の導入などの用途に定期的に利用可能です。まず、ピクノゲノールおよびグレープ種子エキスなどの抗酸化剤を95%ethanolに溶解し、リコピンをacetoneに溶解します。

抗酸化剤の溶解度に応じて溶媒量を調整します。次に、溶解させた抗酸化剤と活性炭を混合し、嫌気条件下で約12時間撹拌します。嫌気条件は、撹拌しながら混合液中にアルゴンをバブリングすることで達成します。

インキュベーション後、溶液をろ過し、真空下で乾燥させます。次に、従来の酢酸フィルターを2つに切り、抗酸化剤とカーボンを導入します。コートされた植物性抗酸化剤をフィルターの2片の間に挿入して抗酸化剤フィルターサンドイッチを形成し、それを再びシガレットペーパーシリンダーに戻します。

コントロールフィルターは、実験セットアップの前に抗酸化剤を添加しない点を除き、抗酸化剤フィルターと同様の方法で準備します。研究用タバコは開封し、飽和臭化ナトリウム溶液を用いて、最低2日間、一定の湿度環境で保存してください。タバコ葉を含むタバコロッドを取り出し、結合フィルターに取り付けます。

シングルポート喫煙装置を用い、室温で日常分析のための喫煙シミュレーションを行います。この装置は、一端が開いたT字接合部を介してスピン trapping アセンブリに接続された、ウォーターアスピレーターまたは真空ポンプ兼エアコンプレッサーで構成されています。流量計を使用してガス流量を確認し、ポンプとベントの間に設置されたバルブを調整して、約2.2 standard cubic feet per hourに設定します。研究用タバコを、35 millilitersの強いパフ量で2秒間吸引し、これを60秒ごとに繰り返します。

パフを行う際は喫煙デバイスの開口部を塞ぎ、パフの間は開いたままにしておきます。開口部が開いている間は、タバコを通過する気流がほとんどなく、これがパフ間の条件に相当します。各タバコについて10回の強いパフを行い、メインストリームのタバコ煙をケンブリッジフィルターパッドに通過させて気相フリーラジカルを回収し、その後、スピン trapping 液に導入します。

液体窒素トラップは主流煙から水蒸気を取り除きますが、気相ラジカルには実質的な影響を与えません。最後のパフの後、バブリングさせたトラッピング溶液の一分量を、長さ約10インチ、内径3mmのガラス試料チューブに移します。酸素はESRスペクトルを広げ、手法の感度を低下させるため、まずチューブを液体窒素に浸し、次にオイルポンプで溶液を排気し、その後アルゴン雰囲気下で溶液を融解させるフリーズポンプソウ法を用いて、溶液を脱酸素化します。

この凍結ポンプ融解法を数回繰り返します。次に、チューブを真空状態で封印します。これでチューブの準備が完了しました。

さらなるESR測定のため、Bruker EMX分光計を用いて9.34 gigahertzの周波数でXバンドESRスペクトルを記録します。標準条件については、使用される典型的な分光計の設定に関する書面プロトコルを参照してください。これらの実験では25回のESR蓄積を行い、通常は約20分かかります。

スピン trapping agent は、12時間後の実験条件下で比較的安定していますが、ベンゼン溶液中の ESR シグナルの強度は5分の1に減少しました。trapping agent の濃度を定量するために、初期の ESR 一次微分スペクトルを積分します。得られた吸収スペクトルは幅広なシングレットのバックグラウンドを示しており、これはおそらく煙に含まれるすすやタール生成物に起因するものと考えられます。

このバックグラウンドを差し引いた後、トラップされた付加体の分離された三重項を積分します。フリーラジカル濃度を求めるため、もう一度積分を行います。スピン trapping 溶液の二重積分の値は、本実験で実証した既知濃度のニトロキシラジカル TEMPO 溶液の値、および記述プロトコルにある追加の計算結果と比較します。

主流煙の気相におけるフリーラジカル濃度は約7.1 × 10⁻⁹ Mであった。これにより、タバコ1本全体の気相からトラップされたラジカルの総数は約1.5 × 10¹⁵個であると決定された。本実験において、初期の測定では煙流中の水分によりESR信号が弱く、再現性が低かった。

この問題を解決するため、ケンブリッジフィルターとスピン捕捉溶液の間に液体窒素トラップを喫煙シミュレーション装置に追加しました。液体窒素トラップは、主流のタバコ煙の流れから水を急速凍結させ、ガラス管の内壁に捕捉して除去します。これによりESR信号が大幅に改善され、高い再現性のある結果を得ることが可能になりました。

主流煙中の気相フリーラジカルに対する植物性抗酸化物質の異なる消去効果が観察され、その消去率が示されました。リコピンとブドウ種子エキスが最も高い率を示した一方、ピクノゲノールではより低い率が観察されました。一度習得すれば、適切に実施することでこの手法は1時間以内に完了させることができます。

本手順を実施する際は、煙を液体窒素トラップに通すことが重要です。これにより、SRスペクトルの品質が向上し、確立後の再現性が高まります。この手法は、健康および環境分野の研究者が、さまざまな揮発性化合物に含まれる健康に有害なフリーラジカルの存在を探索し、その検出感度を高めるのに役立ちました。

ビデオを視聴することで、喫煙による有害な影響を軽減させるため、主流煙中のフリーラジカルを定量化する方法について十分に理解できるはずです。