Name: たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶスピントラップESR分光法を用いて、たばこ主流煙中の気相フリーラジカルを検出し、リコピンやピクノジェノールなどの植物性抗酸化剤のラジカル消去能力を評価する方法です。

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この作品は、国立衛生研究所、助成番号NIH / NCRR P41 - RR 016292（ACERT用）によってサポートされていました。

1。材料本研究で使用したすべての溶媒は試薬グレードであった。 N - tert -ブチル-α- phenylnitrone（PBN）と標準的スピンラベルが2,2,6,6 - テトラメチル-1 - piperinyoxyl（TEMPO）を含むスピントラップは、Sigma社から入手し、供給として使用された。植物酸化防止剤は、スワンソン社米国から商業的に入手した。 2。タバコの煙やフリーラジカルの分析の準備<ol><li>リコピンは、アセトンに溶解しながら、フィルタに酸化防止剤を導入するために、抗酸化物質のピクノジェノールとブドウ種子抽出物は、まず、95％エタノールに溶解した。溶媒量は、抗酸化物質の溶解度に応じて異なっていた。 </li><li> 0.4酸化防止剤の量はmg /フィルターを使用した。彼らはその後、活性炭、10mgので被覆した。この目的のために活性炭を真空下で濾過し、乾燥嫌気的条件下で抗酸化溶液との〜12時間、攪拌した。 酸化防止剤は、従来のアセテートフィルター（CAフィルタ）に導入した。この目的のために、フィルタは2つの部分に切断した。抗酸化物質は、フィルタの2つの間に挿入し、フィルタを形成するためにテープの一部でラップされたコーティングされた植物 - 抗酸化物質フィルターサンドイッチ（図1A）。この組み合わせのフィルタは、その後、タバコを含むタバコのロッドに装着された。制御フィルタは、無酸化防止剤を除く抗酸化フィルタが追加されたのと同じ方法で行われました。 </li><li>喫煙のシミュレーションに先立って、研究のタバコが解凍され、2日間の最低飽和NaBrのソリューションを使用して一定の湿度環境（20℃、相対湿度60％）に格納されていました。 </li><li>ルーチン分析のための喫煙シミュレーションは、水アスピレーターまたはGAST DOA - P104 - BNの真空ポンプ/エアーコンプレッサー（ベントンハーバー、ミシガン）接続で構成され、図1に示すように、シングルポート喫煙装置を用いて周囲温度で実施したスピントラッピングへ一端が開いた状態でT字路を介してアセンブリ。パフは、パフの間に開いたままに開放端を塞ぐことによって行った。ガス流量は、ポンプと通気孔の間に配置されたバルブを調整することによって、〜2.2 SCFH = 17.5 ml / sの時に流量計とセットにより確認した。 </li><li>研究のタバコは、2秒の持続時間を35 mLのパフのボリュームの条件で燻製された1と同様に、60秒ごとに繰り返す。図に示すように、気相フリーラジカルの定量的な推定のための喫煙シミュレーションは、スピントラッピングシステムと連携して実施した。 1。 </li><li>十強烈なパフ（35ミリリットル/パフ）は各タバコのために採取した。気相フリーラジカルは、ケンブリッジフィルターパッドを介してMCSを渡すことによって回収し、スピントラップ溶液（ベンゼン、2.0 mLの0.05 M PBN）に導入した。 </li><li>最後のパフの後、バブルトラップのソリューションは、同じベンゼンとの最初の体積（2.0 ml）に再調整した。アリコート〜25に移した長さ0 mmの一端に封止さ3mmのIDのガラス管。 </li><li>トラッピングソリューションは、凍結 - ポンプ - 解凍の手順を使用して脱酸素した。それは、液体窒素で凍結され、真空を適用した。それはトラップされた気泡が脱出できるように、アルゴン雰囲気下で融解され、そして再び凍結。このサイクルを3回繰り返した後、チューブは真空下で炎シールであり、さらにESR測定に使用。ベンゼンでも可溶である酸素は、有機ラジカルのESR線を広げるため、この手順が必要です。脱酸素化が劇的に信号対雑音比を向上させます。 </li><li> X -バンドESRスペクトルは、標準的条件下で9.34 GHzの周波数でブルカーEMX分光計で記録した。ほとんどの実験で使用した分光器の設定は次のとおりだった：センターフィールド3312.5G、スキャン幅80G、変調振幅0.5G、時定数82マイクロ秒、スキャン時間40秒。 </li><li>スピントラップ付加体は、いくつかのケースではREQの実験条件、で比較的安定しています通常、〜20分を要した25の蓄積を、uired。しかし、12時間後にベンゼン溶液中でのESR信号の強度は〜5倍に減少した。 </li><li>トラッピング付加体の濃度を定量化するために、その最初の一微分ESRスペクトルが統合されました。結果として得られる吸収スペクトルは、煙に含まれるすす/タール製品に起因する可能性が最も高いブロードシングレットの背景を示しています。 このバックグラウンドを差し引いた後にトラップ付加体の分離されたトリプレットが複数の時間（図2）統合されました。 </li></ol> 3。代表的な結果タバコ生産煙を（気相）の燃焼におけるフリーラジカルのほとんどは、瞬時と不安定である。これらの基を観察するために、スピントラップ技術が採用されている。それはより安定であり、ESR（図1）によって検出することができるスピン付加物にそれらを変換することによって気相フリーラジカルを捕捉。 0.05本研究では、スピントラップソリューションM PBNは、酸素と炭素中心15を分離することが困難な基の混合物である煙の気相フリーラジカルを、収集するために使用されていました。私たちのケースでは、しかしながら、観測された超微細分裂定数N = 13.7GとH = 1.95Gは、主要な製品であることを示唆し、アルコキシルフリーラジカルの付加体（RO.）2をトラップするための対応する値に非常によく似ています。我々は、煙の流れの水分によるものであったその弱いESR信号と（図2）私たちの初期の測定で観測された低再現性を示した。この問題を解決するために、我々はケンブリッジフィルターとスピントラップのソリューションとの間の液体窒素（LN2）トラップを追加しました。 LN 2トラップでは、急速凍結によるMCSの流れから水を除去し、ガラス管の内壁に、それを捕捉することも可能です。これは非常にESR信号を改善し、再現性の高い結果（図3）を可能にした。 トラップされたフリーラジカルの量は、使用して決定したリファレンスサンプル。酸化防止剤なしのコントロールのサンプルについては、TEMPOの濃度が既知のための二重積分スペクトルとの重積分スペクトルの比較により推定されたベンゼンの典型的な付加体の濃度は1.24μM（図2）であった。喫煙中にそれぞれのシガレットを通過する空気の量は約350 mlとするので、これは〜7.1X10 -9 MのMCSの気相におけるフリーラジカル濃度の推定値を与え、気相から捕捉されたラジカルの合計数〜1.5 × 15の全体のタバコの。ガスおよび粒子相の両方を含む全体のタバコの煙のフリーラジカルの総量の推定値は、、〜10 16フリーラジカルは9だった。 メインストリームのタバコの煙のガス相フリーラジカルの植物の酸化防止剤の清掃効果の異なるレベルが観察された。彼らの掃気率を図に発表されました。 4。低いながら、リコピンとブドウ種子抽出物は最も高い率を示したER率は、ピクノジェノール（図4）のために観察された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。スピントラップを使用して、たばこの主流煙（MCS）で気相フリーラジカルを収集するための改良された喫煙シミュレーション設計のダイアグラム。 MCSは、ケンブリッジフィルター（イエローフィルター）、CAフィルターを通して水アスピレーターによって描画され、H 2 Oを除去するために液体窒素のトラップを通過させた気相の製品が最終的にトラップをスピンに行き、スピントラップ溶液を通してバブリング。植物の抗酸化物質がMCSにフリーラジカルを捕捉するためにタバコに接続されている（丸で拡大）従来のアセテートフィルターの2枚の間に配置されました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2ベンゼンのスピントラッピング付加物濃度の定量的な見積もりは、最初のインテグラから幅広いバックグラウンドシグナルを差し引くことが必要ですlのスペクトル。スピントラッピング付加のための超微細分裂のパラメータは、H = 1.95 G、N = 13.7Gです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。LN2トラップを介して渡すことは、実質的MCSのスピントラップによって得られたESR信号の品質を向上させます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。 MCSにおけるフリーラジカルの濃度で自然な酸化防止剤の効果。相対的シグナル強度は、次のとおりです。コントロール - 100％、ピクノジェノール - 55％、ブドウ種子エキス - 12％、リコピン - 10％。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

タバコの煙の異なるフリーラジカルスカベンジャーの効果の信頼できる推​​定値は、フリーラジカルの定量的検出のための再現可能なテクニックを必要とします。以前に1、それは非極性溶媒に高濃度のスピントラップ溶液の少量がタバコの煙からフリーラジカルをトラップで最も効果的であることが示されている。タバコの煙は、常に有機化合物の燃焼とトラッピング溶媒中で終わってしまうタバコの残留水分から水蒸気が含まれています。 PBNスピントラップ溶液中の水のこの混合物は、実質的スピントラップ付加体の寿命とそのESR信号の強度を減少させる。液体窒素で冷却したU字管を介して簡単に通過するのMCSによってこの水分を削除すると、劇的に気相ラジカルのある部分も凍結面上に捕捉されていても、我々の実験でESRスペクトルの質を改善。 tを使用する彼の手法は、我々は、タバコのフィルターに導入された天然化合物を別のラジカル捕捉の相対効率を比較した。我々はすぐにタバコのフィルターに組み込む後のリコピンとブドウ種子エキスは、気相のMSCからのフリーラジカルの90％まで捕捉できることがわかった。このような高い清掃能力は、ヘモグロビンとshikonine 8,14のような最も効率的な報告フリーラジカルのプロテクタの間でこれらの安価な容易に入手できる天然化合物をランク付けする。まだ、我々の実験に学んだ自然な酸化防止剤をロードしたたばこフィルターは、室温で貯蔵の週後に清掃能力の顕著な部分を失った。この問題を解決することは、商業的なたばこフィルターにリコピンとブドウ種子抽出物の将来のアプリケーションを刺激することができる。

たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

喫煙は、ヒトの癌に関連付けられています。それは、肺がんによる死亡のほとんどは喫煙5,6,7,12によって引き起こされることが報告されている。タバコの煙の粒子相のタバコのタールおよび関連製品は、発がん性と変異原性関連疾患の主要な原因ですが、タバコの煙には、9,10の発ガン性物質の重要なグループとみなされているフリーラジカルを大量に含まれています。フリーラジカルは、有害なタンパク質の構造、脂質およびDNA配列により細胞成分を攻撃し、癌の様々なタイプを開発のリスクを増加させる。吸入ラジカルが肺3のタバコの煙の健康への悪影響の多くに寄与する付加体を生成する。研究は、喫煙によって誘発される損傷のリスクを減少させるためにタバコの煙のフリーラジカルを減らすために行われている。それは、ヘモグロビンとヘム含有化合物が部分的に、反応性窒素酸化物を捕捉できることが報告されている酸化剤とタバコの煙4の発がん性nitrosocompounds。 &quot;バイオフィルター&quot;は、ヘモグロビンで構成され、活性炭はフリーラジカルを捕捉すると、タバコの煙14からのフリーラジカルの90％まで除去するために使用されていました。しかし、費用対効果がないため、それが正常に実用化されていません。別の研究では、シコニン、漢方薬8の構成要素の良好な掃気効率を示した。本研究では、我々はスピントラップを使用してたばこの主流煙（MCS）におけるガス相フリーラジカルのスカベンジ効果のたばこの煙のガス相フリーラジカルを捕捉するためのフィルタシガレットに一般的な天然の抗酸化エキスを導入するためのプロトコルと測定を報告する電子スピン共鳴（ESR）分光法1,2,14。我々は、リコピンとたばこフィルターで、将来のアプリケーションを指すようにブドウ種子抽出物の高い清掃能力を示した。これらのプロの重要な利点pectiveスカベンジャーは、それらがそれぞれトマトやワイン産業の副産物11,13から大量に得ることができることです。

スピントラッピングESR分光法は、植物抗酸化物質リコピン、タバコの煙のガス相フリーラジカルを捕捉に関するピクノジェノールとブドウ種子抽出物の効果を研究するために使用されていました。

喫煙はヒトの癌に関連しています。肺癌による死亡の大部分は喫煙が原因であることが報告されています 5,6,7,12。...

本手順の全体的な目的は、主流煙中のフリーラジカル量を測定し、いくつかの抗酸化剤のスカベンジング能力を評価することである。まず、複数の異なるスカベンジャー化合物を含むフィルターと、スカベンジャーを含まないコントロールフィルターを準備する。続いて、研究用タバコの煙をスピントラッピング溶液に通すことで、喫煙シミュレーションを行う。次に、電子スピン共鳴（ESRと略記）を用いて、トラップされたラジカルおよび参照試料のスペクトルを記録します。得られたESRスペクトルに対してルーチン解析を行い、トラップされた気相ラジカルの信号をバックグラウンドから分離し、参照試料を用いてラジカル濃度を定量します。最終的に、スピン trapping ESR分光法を通じて、主流タバコ煙中のフリーラジカル含量に関する定量的な情報と、天然抗酸化物質の消去能の推定結果が得られます。ガスクロマトグラフィーのような既存のタバコ煙分析法に対する本手法の主な利点は、ESRが遊離基（フリーラジカル）に対して特異的に感度を持つことです。遊離基は主要な発がん性物質群であるため、この手法の活用はタバコ煙による有害な影響を軽減することに寄与し得ます。本法はタバコ煙中の遊離基の研究に知見を提供できるだけでなく、工業排煙などの他のシステムにも適用可能です。電子スピン共鳴技術に関する国立生物医学研究センター（certとしても知られる）は、最新のESR技術開発における当センターの広範な経験に基づいて設立されました。電子スピン共鳴に従事している研究者の皆様、およびバイオメディカルコミュニティの皆様に向けて、多種多様なサービスを提供しています。当施設の設備は、タバコフィルターへの抗酸化剤の導入などの用途に定期的に利用可能です。まず、ピクノゲノールおよびグレープ種子エキスなどの抗酸化剤を95%ethanolに溶解し、リコピンをacetoneに溶解します。抗酸化剤の溶解度に応じて溶媒量を調整します。次に、溶解させた抗酸化剤と活性炭を混合し、嫌気条件下で約12時間撹拌します。嫌気条件は、撹拌しながら混合液中にアルゴンをバブリングすることで達成します。インキュベーション後、溶液をろ過し、真空下で乾燥させます。次に、従来の酢酸フィルターを2つに切り、抗酸化剤とカーボンを導入します。コートされた植物性抗酸化剤をフィルターの2片の間に挿入して抗酸化剤フィルターサンドイッチを形成し、それを再びシガレットペーパーシリンダーに戻します。コントロールフィルターは、実験セットアップの前に抗酸化剤を添加しない点を除き、抗酸化剤フィルターと同様の方法で準備します。研究用タバコは開封し、飽和臭化ナトリウム溶液を用いて、最低2日間、一定の湿度環境で保存してください。タバコ葉を含むタバコロッドを取り出し、結合フィルターに取り付けます。シングルポート喫煙装置を用い、室温で日常分析のための喫煙シミュレーションを行います。この装置は、一端が開いたT字接合部を介してスピン trapping アセンブリに接続された、ウォーターアスピレーターまたは真空ポンプ兼エアコンプレッサーで構成されています。流量計を使用してガス流量を確認し、ポンプとベントの間に設置されたバルブを調整して、約2.2 standard cubic feet per hourに設定します。研究用タバコを、35 millilitersの強いパフ量で2秒間吸引し、これを60秒ごとに繰り返します。パフを行う際は喫煙デバイスの開口部を塞ぎ、パフの間は開いたままにしておきます。開口部が開いている間は、タバコを通過する気流がほとんどなく、これがパフ間の条件に相当します。各タバコについて10回の強いパフを行い、メインストリームのタバコ煙をケンブリッジフィルターパッドに通過させて気相フリーラジカルを回収し、その後、スピン trapping 液に導入します。液体窒素トラップは主流煙から水蒸気を取り除きますが、気相ラジカルには実質的な影響を与えません。最後のパフの後、バブリングさせたトラッピング溶液の一分量を、長さ約10インチ、内径3mmのガラス試料チューブに移します。酸素はESRスペクトルを広げ、手法の感度を低下させるため、まずチューブを液体窒素に浸し、次にオイルポンプで溶液を排気し、その後アルゴン雰囲気下で溶液を融解させるフリーズポンプソウ法を用いて、溶液を脱酸素化します。この凍結ポンプ融解法を数回繰り返します。次に、チューブを真空状態で封印します。これでチューブの準備が完了しました。さらなるESR測定のため、Bruker EMX分光計を用いて9.34 gigahertzの周波数でXバンドESRスペクトルを記録します。標準条件については、使用される典型的な分光計の設定に関する書面プロトコルを参照してください。これらの実験では25回のESR蓄積を行い、通常は約20分かかります。スピン trapping agent は、12時間後の実験条件下で比較的安定していますが、ベンゼン溶液中の ESR シグナルの強度は5分の1に減少しました。trapping agent の濃度を定量するために、初期の ESR 一次微分スペクトルを積分します。得られた吸収スペクトルは幅広なシングレットのバックグラウンドを示しており、これはおそらく煙に含まれるすすやタール生成物に起因するものと考えられます。このバックグラウンドを差し引いた後、トラップされた付加体の分離された三重項を積分します。フリーラジカル濃度を求めるため、もう一度積分を行います。スピン trapping 溶液の二重積分の値は、本実験で実証した既知濃度のニトロキシラジカル TEMPO 溶液の値、および記述プロトコルにある追加の計算結果と比較します。主流煙の気相におけるフリーラジカル濃度は約7.1 × 10⁻⁹ Mであった。これにより、タバコ1本全体の気相からトラップされたラジカルの総数は約1.5 × 10¹⁵個であると決定された。本実験において、初期の測定では煙流中の水分によりESR信号が弱く、再現性が低かった。この問題を解決するため、ケンブリッジフィルターとスピン捕捉溶液の間に液体窒素トラップを喫煙シミュレーション装置に追加しました。液体窒素トラップは、主流のタバコ煙の流れから水を急速凍結させ、ガラス管の内壁に捕捉して除去します。これによりESR信号が大幅に改善され、高い再現性のある結果を得ることが可能になりました。主流煙中の気相フリーラジカルに対する植物性抗酸化物質の異なる消去効果が観察され、その消去率が示されました。リコピンとブドウ種子エキスが最も高い率を示した一方、ピクノゲノールではより低い率が観察されました。一度習得すれば、適切に実施することでこの手法は1時間以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、煙を液体窒素トラップに通すことが重要です。これにより、SRスペクトルの品質が向上し、確立後の再現性が高まります。この手法は、健康および環境分野の研究者が、さまざまな揮発性化合物に含まれる健康に有害なフリーラジカルの存在を探索し、その検出感度を高めるのに役立ちました。ビデオを視聴することで、喫煙による有害な影響を軽減させるため、主流煙中のフリーラジカルを定量化する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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この研究の目的は、インピーダンスベースのリアルタイム細胞分析装置とin...

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

このプロトコルは、げっ歯類を電子タバコ蒸気（E蒸気）およびタバコ煙にさらす方法を記載している。暴露チャンバは、E蒸気またはタバコの煙を齧歯類に送達する自動ポンピングシステムで麻酔チャンバを改変することによって構築される。このシステムは、多くの実験的エンドポイントに対応するように簡単に変更することができます。...

電子たばこの蒸気とたばこの煙が小説に与える影響の比較<em&gt;インビボ</em&gt;露光システム

ここでは、従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾルの抽出物を作成するためのプログラマブル試験装置について述べる。このメソッドは、従来のタバコと電子タバコの間の直接比較を行うための便利なツールを提供し、電子タバコ研究へアクセスできるエントリ...

マイクロ コント ローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

電子タバコ (電子セエグ) ユーザーが世界的に増加しています。少し、しかし、電子セエグ吸入エアロゾルによる健康への影響について知られています。動物の暴露とその後の毒性学的研究に適した電子セエグ エアロゾル生成手法について説明します。そのようなプロトコルは、実験的再現性と標準化された電子 cig...

第三世代機 Vaping デバイスによる電子タバコ エアロゾルの生成: 毒性学的研究への応用

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

学ぶスピントラップESR分光法を用いて、たばこ主流煙中の気相フリーラジカルを検出し、リコピンやピクノジェノールなどの植物性抗酸化剤のラジカル消去能力を評価する方法です。

たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

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