Name: 監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶカスパーゼ-3活性化を用いたN19オリゴデンドログリア細胞のライブイメージング法。NucView 488基質でリアルタイムにアポトーシスを可視化し、細胞死メカニズムの理解を深めます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この研究室は、保健研究、カナダ自然科学工学研究評議会、およびカナダの多発性硬化症協会（MSSC）のカナダの協会によって支えられてきた。 GSTSはMSSCから博士課程学生の身分の受け手だった。我々は、この原稿で多くの有用な議論とコメントの博士ジョアンボッグス（小児病院、トロント）に感謝しています。我々は、追加のNucView 488カスパーゼ3の彼らの寛大な贈り物用Biotiumに感謝しています。

1。解凍と培養細胞<ol><li>長期的な液体窒素の店から冷凍不死N19 -オリゴデンドログリア細胞の株式を取得する。 </li><li>細胞懸濁液が完全に融解するまで37℃のウォーターバスを細胞を含む浸しバイアル。 </li><li> 10cmの培養皿に10％FBS（ウシ胎児血清）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEM中の7 mLの（ダルベッコ変法イーグル培地）を追加します。 </li><li>細胞懸濁液をプレートに滴下し、穏やかに攪拌し、均一に細胞を分散させるためにペトリ皿を揺するを追加。 </li><li> 34 ° C / 5％CO 2インキュベーターで培養細胞。 </li><li> 4時間後、プレートから吸引メディアは、凍結保護剤として使用されていた残りのDMSO（ジメチルスルホキシド）を削除する、および（10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足した7 mLのDMEM高グルコース培地）を新鮮な培地と交換してください。 </li></ol> 2。継代細胞<ol><li> 70から80パーセントで合流点は、（4-7日間の成長）、細胞から培地を吸引除去する。 </li><li>プレートに0.25％トリプシン液1mLを追加。細胞を（約5分）デタッチするピペットトリプシン。 </li><li>実験条件と通過するための適切な希釈細胞密度劣らずその0.1 × 10 6細胞/ mLで、将来の実験のための追加の10cmのプレートを作る。 </li></ol> 注：この実験のためにそれらを使用する前に、融解後の少なくとも二回通過して細胞をしてください。 3。細胞をカウントし、めっき<ol><li>生細胞イメージングのためのプレートの細胞に、前述のようにトリプシン処理。 </li><li>細胞の約30μLを削除し、haemocytometerを使用して数える。 </li><li> 6ウェルプレートにコーティングされていないガラスのカバースリップを置きます。 34で10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン、° C / 5％CO 2を添加した2 mLのフェノールを含まないDMEM高グルコース培地で0.1 × 10 6細胞/ mLの密度、にウェルにセルを追加。 </li><li>許可34で（16〜20時間）一晩増殖する細胞° C / 5％トランスフェクションの前にCO 2。 </li></ol> 4。トランスフェクション<ol><li> 100μLの無血清培地、プラスミドDNAを精製0.5から4μgの、および4μLトランスフェHD（Roche）を組み合わせる。渦は、静かに混和する。 </li><li>簡潔に再びボルテックスし、室温で5分間複合体にDNAを可能にし、培養細胞に直接トランスフェHDのDNAの混合物を追加。穏やかに混合するためにプレートを傾けて。 </li><li> 34 ° C / 5％、治療前や実験へのCO 2でさらに48時間培養では細胞。 </li></ol> 5。ライブセルイメージングのための準備細胞（LCI） <ol><li>あなたが実験を開始する前に、LCI Chamlide生細胞計測器制御ボックスに少なくとも1時間を切ります。コントロールボックスには、LCI Chamlide内の温度と湿度を調節し、プレミックス、5％CO 2の流れを調整する。 </li></ol> 注：これは、にお勧めですステージ全体が34に達することを保証するために実験を開始する前に、最大3時間までコントロールボックスをオンに℃をこのステップは、撮像中に、それは温めとしてfluxulationと金属のステージの熱膨張によって引き起こされる焦点ドリフトを、減らすことができます。 <ol start="2"><li>フローフードでの作業、70％エタノールで、Chamlide磁気型培養チャンバー、およびピンセットをスプレーし、それらを5分間乾燥させます。 </li><li>インキュベーターから細胞を取り出して、それらが健康であることを確認してください。彼らは、接着表示され、多数の膜プロセスとカバーガラスでよく広げてください。トランスフェクションから強調している細胞は、実験には適していない、およびプロセスの拡張子の数を減らす必要があります、としばしば不規則な形状の核を持っている。 </li><li> 6 - ウェルプレートを傾けて、ピンセットでカバーを取り外します。迅速に培養チャンバーの底板にカバーガラスの細胞の側を上に置きます。カバースリップを乾燥させないでください。 </li><li>磁気メインを取り付けます培養チャンバーの本体とカバースリップの上にオリジナルの6ウェルプレートから培地を500μLを加える。再使用してこのメ​​ディアは、環境の変化によって引き起こされる細胞にかかる負荷の量を減少し、また、細胞外分泌因子を評価するのに役立ちます。 </li><li>培養チャンバーのガラスカバーを置きます。 </li><li>顕微鏡と干渉するカバーの底からの残留物質を除去するために70％エタノールでスプレーキムワイプを、使用してください。 </li><li> 34に培養チャンバーを配置° C / 5％CO 2インキュベーターで30分間。このステップでは、チャンバー自体が金属のウォームアップとして° Cはカバースリップのシフト減らすために34に温まることが保証されます。 </li></ol> 6。顕微鏡の設定画像は複数の車輪のカートリッジのロードのためにカスタムのリレーレンズと発光フィルターホイールハウジングとライカDMIRE2倒立顕微鏡を使用して、ここで取得しました（クォーラムTechnologies社、Guelph、ON）。 <ol><li>明視野 - 240ミリ秒〜2.5 Vと露光時間のランプのセット。 </li><li>赤色蛍光タンパク質（RFP） - 200ミリ秒140で設定されたゲイン。 </li><li>緑色蛍光タンパク質（GFP） - ゲインは500 ms、140に設定。 </li><li>当社の顕微鏡は、調光可能なランプではなく、細胞に利用できる光の量を制御するための回転ディスクを持っています。我々は、ランプの最大強度の90％の光を私たちの実験を実行する。 </li></ol> 7。アポトーシス誘導因子とNucView 488カスパーゼ3基質と細胞の治療<ol><li>濃度は、実験間の一貫になるように、前もって時間のアポトーシス誘導剤の大規模な在庫を準備し、アリコートでそれらを凍結することが重要です。 </li><li> NucView 488基板は、光に敏感です。アルミ箔で覆われ、-20℃で凍結/解凍、およびストアチューブを減らすために15μLのアリコートを準備します。 NucVの露出を減らすために可能な限り低い周囲の部屋の照明で働くiew 488基板は、その使用前に、点灯する。 </li><li>細胞が温度の減少にさらされないようにすぐにインキュベーターから培養チャンバーを取得します。顕微鏡の環境室に培養チャンバーを配置し、移動から培養チャンバーを維持するためにクランプを使用してください。この時点で、部屋の照明を落とすこともすべき。 </li><li>デュアルレギュレータ、5％混合CO 2タンクをオンにします。 </li><li> 10倍対物レンズを用いて、明視野顕微鏡を使用してコンピュータのモニタ上で細胞を見つけるために焦点を当てる。 メモ ：露光時間を減らすために所望の倍率で客観的で最大の開口数を使用するとよいでしょう。 </li><li>細胞（私たちのケース80mMのカリウム、または100 mMのグルタミン酸で）にアポトーシスの誘導を実現する、次のいずれかの方法を使用することができます。私たちは、典型的な培養培地で10倍濃縮液として溶存KClを用いて、例として、80mMのカリウムの配信を使用します。 <ol><li> メディア交換BYが遅いとローカル潅流： - 80 mMリン酸カリウムを含む新しい培地で培養チャンバーにメディアを交換する蠕動ポンプを使用してください。 - チューブの一端には、フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの株式を10 mLをお届けします、、チューブのもう一方の端は、チャンバーからメディアを削除します。 - あなたは、チャンバー内に残っているメディアは、カリウムの正しい濃度を持っていることを保証するためにメディアの少なくとも10倍の交換をしたい。 -メディアが交換された後、チャンバー内のメディアにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。 </li><li> 80mMのK +および培養チャンバー内のメディアへNucView 488基板の直接添加する 。 - フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの10倍のストック溶液を調製する。 - 10倍の80mMのカリウムの50μLにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。培養チャンバーに500μLのフェノールを含まないDMEMに追加します。 注：この方法はあなたが成長または元のメディアに存在するかもしれない他の分泌因子を維持したり、評価する上で興味があれば望ましい。我々はNucView 488基板は限り36時間を持続させる実験のために細胞培養で安定していることを発見した</li></ol></li></ol> 8。ライブセルイメージング<ol><li>トランスフェクションされた細胞を表示するには、赤チャンネルをクリックしてください。 </li><li>選択して、いくつかのトランスフェクションされた細胞が存在するダースのフレームの周りに保存し、これらの"XYステージのポイントを"保存。コンピュータのメモリの量によっては、あなたが取得できるようになるステージのポイントの数に制限される場合があります。 </li><li>これらの保存された段階で、顕微鏡のキャプチャ画像（明視野、赤チャンネル、緑チャンネルに）持っていることは、すべての6分を指しています。 </li><li>実験の初期段階で表示されている緑色の染色は、おそらくすでに通常トランスフェクションおよび/または環境ストレスによるアポトーシスを、受けている細胞を示す。 Apopt実験的な治療に起因するOSISは実験の後のタイムポイントで検出されます。 </li></ol> 9。統計的分析<ol><li>各実験では、我々は効率的に大きなデータセットを収集するために複数のXYポイントを獲得するために顕微鏡をプログラムする。各実験は、重複または三重に実行され、データが異なる日に行わ別々の実験からコンパイルされます。各データセットから、我々は、ビューの15のフィールドまで分析して、カスパーゼ陽性細胞（ビュー/カスパーゼ陽性細胞の総数のフィールド内のセルの合計数）にカスパーゼ陰性細胞の比率を比較する。 </li><li>各データセットから記録された測定は、より大きなサンプルのセットにグループ化され、そして、1つANOVA表（P = 0.05）を使って他と比較されます。我々は、各実験の平均値（SEM）の標準誤差を示し、次にWHを決定するためにテューキーの方法の比較試験（P = 0.05）を実行することで、平均の差を比較するICHの治療法は、互いに大きく異なっている。 </li></ol> 10。代表的な結果我々はNucView 488基板は高い細胞外カリウム濃度と治療後のN19 - OLG細胞培養のアポトーシスの増加率を示すことができる方法を示すために実験を記載している。 N19 -細胞はRFPでトランスフェクトした、とのどちらか3μLNucView 488基板（コントロール）、または3μLNucView 488基板と80mMの[K +]（治療）で処理した。細胞は、モニターし、画像は神経傷害（ 図1A）を対象とした研究に適している12時間の時間経過、以上を取得した。コントロール条件では、80 mMのと比較してアポトーシスを大量に観察されなかった[K +] 12時間（ 図1B）の後に約45％の細胞死を示した処理培養物（ハッシュ化されたボックス）、。背景の緑色の信号が観察制御条件のdは、細胞外カリウムを添加することなくアポトーシスを受けている細胞を示す。他の状況での実験が長く実行するために必要なことかもしれないが、12時間の時点で対照実験の展示アポトーシスにおける細胞の事実上どれも、。画像は10倍対物レンズを用いて取得しました。バー= 100μmの。 <img alt="図1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="図1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> 図1。 （A）N19 OLGの文化の12時間のタイムコース実験を48時間トランスフェクション後NucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLと一緒にRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現する。培養物は、いずれの80mMの[K +]（左パネル）、またはコントロール（右パネル）などの無治療の最終濃度で処理した。画像は6分間隔で取得され、そして切断されたカスパーゼ-3（緑信号）の有意な活性化は観察することができますD 80 mmに処理した培養物の[K +]対照実験と比較して細胞核（ハッシュ化されたボックス）内で。によって、ビューのフィールド内のセルの合計数を割ることによって計算された、切断されたカスパーゼ-3の細胞（の（B）の割合カスパーゼ陽性細胞の合計数）。条件を制御するための比較では、我々はKで12時間で+ -治療後の約45％の細胞死を観察 Sビデオ（1）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野像と三方と一緒に、NucView 488基板の3μL（グリーンチャンネル）でRFP - MBP（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後マージされた画像、80mMのでは、次の治療[K +]。 Sビデオ（2）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野IMAGとともにNucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLとRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後、ESとスリーウェイマージされた画像。何の治療は、文化に適用されていないとN19 - OLGsは、80mMの[K +]（Sビデオ1と比較）で処理した細胞培養とは対照的に顕微鏡のフィールドを介しての移行を見ることができます。

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

著者らは開示する利害の衝突を持ちません。

これはアポトーシスの検出に使用できる唯一の蛍光製品ではありませんが、NucView 488基板を使用するいくつかの重要な利点があります。主な利点のひとつは、大部分の代替製品はどちらの細胞溶解を必要とするか、悪い細胞の透過性を持っているのに対し、リアルタイムで生きた細胞のアポトーシスをフォローする機能です。他の利点は、カスパーゼ-3の認識、高い細胞透過性、低細胞毒性、およびアポトーシスの進行との干渉のための高感度が含まれています。それが切断されるとバックグラウンドの蛍光を除去する核を、入るまで、基板はまた、低バックグラウンドの蛍光を持っています。カスパーゼ-3認識配列は、3つの負電荷とDNA結合色素が含まれていますつの正電荷2を持っています。 DEVD - NucView 488分子は、このようにカスパーゼがアクティブでない細胞のDNAに色素の活性化との結合を防止する正味の負電荷を持っています。 MA実験間のintaining一貫性が複製の間に意味のある比較を描画できるようにするためです。それがトランスフェクションの速度に影響を与えるとしての一貫性を保つために主なパラメータの一つは、細胞密度です。不死N19 - OLG細胞培養で高いトランスフェクション率を得ることが我々の経験12、13に、このようなHeLa細胞またはHEK293など、他の一般的な細胞株と比べてより困難である、と密度に大きく依存している。これらの細胞のための私達の最高のトランスフェクション効率は、トランスフェHD（ロシュ）で取得し、通常は約15％ですが、構造に応じて、30％以上に到達することができますされています。慎重な細胞計数は、一貫性のあるトランスフェクション率を得ることに役立ちます。アポトーシスのレートを測定する場合は特に、さまざまな治療法から環境ストレスの同程度に細胞を公開することも重要です。特に、細胞をトランスフェクション試薬にさらされている時間の長さ、または光暴露量は、重要な環境変数です。ablesは考慮して、実験に渡って一定に保持する必要があります。私たちのアプリケーションの場合、我々はフィールドオブビューの多数を収集する統計的に有意な比較を行うために十分に大きなサンプルサイズを提供することを発見した[ 同上 ]。

特定の試薬と機器の表<table border="1"><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>生細胞用NucView 488カスパーゼ-3アッセイキット</td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td>トランスフェHDトランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地</td><td> GIBCO </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン</td><td> GIBCO </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> GIBCO </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> ＃1.5〜25ミリメートルのガラスカバースリップ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0715 </td></tr><tr><td>磁気Chamlide CMB さ25mm培養チャンバーカバースリップ</td&gt; <td>クォーラムテクノロジーズ</td><td> CM - B - 40 </td></tr><tr><td> Cellstart組織培養10cmの皿</td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BDファルコン6ウェル組織培養皿</td><td> VWR </td><td> CA62406 - 161 </td></tr></table>

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとcleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

中枢神経系は、最終的にニューロンの人口や機能の低下につながる数多くの副作用を持つことがストレスと神経学的侮辱の数を、体験することができます。損傷した軸索は、順番に、アストロサイトやオリゴデンドロサイト、8,16などのサポートグリア細胞への更なる侮辱と怪我を作り出すことができる細胞外マトリックス、にカリウムやグルタミン酸を含む興奮性分子を解放することができます。侮辱が続く場合は、細胞が十分に確立されたシグナル伝達カスケード14の数によって調節し、活性化されるプログラム細胞死（アポトーシス）を、受けることになる。アポトーシスと組織の壊死は、外傷性脳損傷、脳虚血、および発作の後に発生する可能性があります。アポトーシス調節の古典的な例としては、システインに依存するアスパラギン酸特異的プロテアーゼ、またはカスパーゼの家族です。カスパーゼを含む活性化プロテアーゼは、慢性的な神経に応答して細胞死に関与しているアルツハイマー病、ハンチントン病、および多発性硬化症4、14、3、11、7を含む変性疾患。 このプロトコルでは、このような高濃度のような別の細胞外ストレスへの暴露後に、不死化N19 -オリゴデンドロサイト（OLG）細胞培養15、5におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの割合を測定するためにNucView 488カスパーゼ3基質の使用を記載しカリウムやグルタミン酸。条件付きで不死化N19 - OLGの細胞株は、（O2Aの前駆細胞を表す）博士はアンソニーCampagnoni（神経科学のためのUCLAセメル研究所）15、5から得られた、と以前にミエリンの遺伝子発現とつながるシグナル伝達の分子メカニズムを研究するために使用されていますOLG分化（例えば、6、10）。我々は、外因性のミエリン塩基性タンパク質（MBP）とトランスフェクションを基準にして堅牢なものになるようにこの細胞株を発見したRFPまたはGFP（赤色または緑色蛍光タンパク質）13、のどちらかに融合構築12。ここで、N19 - OLG細胞培養は、80 mMの塩化カリウムまたは9アポトーシス誘導する細胞外マトリックスへの軸索漏れを模倣する100mMのグルタミン酸ナトリウムのいずれかで処理した。我々は、DEVD（ASP -グルタミン酸- VAL - ASP）カスパーゼ-3認識サブユニットとDNA結合色素2を含む二官能性カスパーゼ-3基質を使用。基板は、すぐにそれが細胞内のカスパーゼ3により切断される細胞質に入ります。染料、NucView 488が解放され、それがアポトーシスをシグナル伝達、488nmでDNAと蛍光グリーンを結合する細胞核に入る。 NucView 488カスパーゼ3基質を使用すると、リアルタイムの1、10の生細胞イメージングを可能にする。このビデオでは、我々はまた、不死化N19 - OLGの細胞だけでなく、ライブセルイメージング技術の培養とトランスフェクションについて説明します。

使用して不死化N19 -オリゴデンドロサイトの培養細胞におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの生細胞イメージング<em&gt; NucView</em&gt; 488カスパーゼ3基質。この手法は、細胞の種類や組織の様々なリアルタイムでのプログラム細胞死のアッセイに適用可能です。

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

中枢神経系は数多くのストレスや神経学的損傷を受ける可能性があり、それらは最終的に...に至る多くの悪影響を及ぼすことがあります。

本手順では、オリゴ DDR グリア細胞の死をリアルタイムでモニタリングすることができます。まず細胞を培養し、次にライブセルイメージングのための準備を行います。その後、細胞に処理を施し、蛍光顕微鏡を用いてその影響をモニタリングします。最終ステップはデータ解析の実施です。最終的に、カスパーゼ活性化蛍光染料による核の蛍光をモニタリングすることで、処置または刺激後の細胞集団における細胞死率が示されます。免疫染色などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、複数のタイムポイントを同時に収集できることです。この手法は、薬理学的処置、試薬、およびさまざまな処理に対する応答など、細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法を用いることで、細胞培養内における細胞死に関する知見を得ることが可能です。さらに、ex vivoや脳スライスを含む器官培養組織などの他の系にも適用できます。一般的に、この手法に慣れていない方は、固定組織ではなく生体組織を扱う操作に慣れるまで苦労することがあります。固定組織に比べて生細胞サンプルの調製ステップは多いため、この技術を視覚的に実演することが重要です。まず、凍結保存された不死化 N 19 oligo droog グリア細胞を 37 °C の恒温水槽で融解させます。細胞が融解するまで待ちます。10% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEMを7 mL、10 cmカルチャーディッシュに加えます。次に、細胞懸濁液をプレートに滴下し、ペトリ皿を静かに揺らして細胞を均一に分散させます。その後、5%二酸化炭素インキュベーターにて34 °Cで4時間培養します。プレートから培地を吸引し、残存するDMSO（凍結保存剤）を除去します。4〜7日間の培養後、7 mLの新鮮な培地と交換します。細胞が70〜80%のコンフルエンスに達したら、培地を吸引し、1 mLのドリップを細胞シート上にピペットで滴下し、室温で5分間インキュベートします。次に細胞を回収し、回収した細胞を0.1 × 10⁶ cells/mLの密度で10 cm組織培養ディッシュに播種し、このディッシュを組織培養インキュベーターに入れます。さらに1回継代した後、細胞をライブセルイメージング実験用に播種できます。そのためには、前述と同様に細胞を回収し、細胞懸濁液を30 µL分取してヘモサイトメーターで細胞数をカウントします。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、未コーティングのガラスカバースリップを配置します。6ウェルプレートの各ウェルに、0.1×10⁶ cells/mLの密度で細胞を播種します。10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したフェノールフリーのDMEM high glucose培地 2 mL中で、トランスフェクション前に34 °C、5% CO₂条件下で一晩細胞を培養します。翌日、100 µLの無血清培地、0.5～4 µgの精製プラスミドDNA、および4 µLのFUgene HDを混合します。混合液を軽く2回ボルテックスし、室温で5分間静置してDNA複合体を形成させます。インキュベーション時間が経過した後、FUgene HD-DNA混合液を培養細胞に直接添加します。プレートをゆっくりと傾けて混ぜ合わせます。その後、処理または実験を行う前に、34 °C、5% carbon dioxideの条件下でさらに48時間、細胞を培養します。まず、LCI Cham light live cell instrumentのコントロールボックスの電源を入れます。ステージを十分に加温させるため、この操作は実験開始の3時間前に行う必要があります。最低限、コントロールボックスは実験開始の1時間前に電源を入れてください。次に、フローフード内で、LCI Cham light磁気型培養チャンバーとピンセットに70%ethanolをスプレーし、5分間乾燥させます。インキュベーターから細胞を取り出し、顕微鏡下で観察して細胞が健全であることを確認します。細胞はガラスカバースリップ上で、多数の膜突起を持ち、健康的で十分に伸展している必要があります。突起の数が減少していたり、核の形状が不規則であったりする細胞は、トランスフェクションによるストレスを受けている可能性が高いため、クリーンベンチ内での以降の実験には不適切です。6ウェルプレートを傾け、ピンセットでカバーガラスを取り出します。カバーガラスの細胞側を上にして、速やかにチャンバーのボトムプレートに配置します。カバーガラスを乾燥させないように注意してください。次に、培養チャンバーの磁気本体を取り付け、元の6ウェルプレートから500 µLの培地をカバースリップの上に加えます。培地を再利用することで、環境変化によって細胞にかかるストレスを軽減でき、また細胞外分泌因子の評価にも有用です。培地を加えた後、培養チャンバーにガラスカバーを被せ、70%エタノールを浸したキムワイプを使用して、顕微鏡観察の妨げとなるカバースリップ底面の残留物を除去します。培養チャンバーを34 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターに30分間置きます。この手順により、チャンバー自体が34 °Cまで温まり、カバーガラスのずれを軽減させることができます。金属が温まる間、以降のステップでは室内の照明を可能な限り低くして作業する必要があります。まず、Thoraによって事前に室温で調製されたnuke viewのelequaを用意します。次に、インキュベーターから培養チャンバーを取り出し、速やかに顕微鏡の環境チャンバー内に設置します。デュアルレギュレーターを備えた5%混合二酸化炭素タンクのバルブを開きます。次に、顕微鏡ランプを約2.5 Vに設定し、露光時間を240 msとして、10倍対物レンズを使用します。明視野顕微鏡を用いてピントを合わせ、コンピュータモニター上で細胞を可視化します。その後、ペリスタルティックポンプを用いた低速かつ局所的な灌流による培地交換を行い、80 mM濃度のカリウムイオンまたはその他のアポトーシス誘導剤を細胞に添加します。nuke view 4 88基質は細胞培養において安定しており、最大36時間の実験に使用可能です。したがって、この期間にわたる実験を行うことができます。まず、赤色および緑色蛍光タンパク質からの蛍光を可視化するように顕微鏡を設定してください。次に、レッドチャンネルをクリックして、形質導入された細胞を表示させます。形質導入細胞が複数確認できるフレームを約12枚選択して保存し、これらのXYステージ座標を保存します。顕微鏡を用いて、保存したステージ座標において、明視野、レッドチャンネル、およびグリーンチャンネルの画像を6分ごとにキャプチャするように設定します。重複または三重の実験から複数のXYポイントを収集した後、異なる日に実施された個別の実験データをまとめ、記述プロトコルに従ってデータ分析および統計検定を行い、CASPベイ陰性細胞とCASPベイ陽性細胞の比率を比較します。Nuke view 4 88基質は、N 19オリゴDDRグリア細胞培養におけるアポトーシス率の上昇を示すことがあります。高細胞外カリウム濃度での処理後、これらのベースライン画像は10倍対物レンズを用いて取得されました。N 19細胞にRFPをトランスフェクションし、コントロール細胞にはNukeView 488基質を3 µL添加し、処置群の細胞にはNukeView 488基質3 µLと80 mMカリウムを添加した。これらの画像は、80 mMカリウムでの処置後3時間、6時間、9時間と経過するにつれてアポトーシス細胞数が増加することを示している。コントロール条件下では、80 mMカリウム処置群と比較して有意な量のアポトーシスは見られなかった。コントロール条件下で観察される背景の緑色信号は、細胞外カリウムの添加なしにアポトーシスを起こしている細胞を示している。神経学的損傷に関する研究には、12時間のタイムコースで十分です。12時間後、カリウム処理した培養細胞では約45%の細胞死が認められました。対照実験の細胞では、12時間の時点でアポトーシスを示す細胞はほとんどありませんでした。ただし、状況によっては、より長時間の実験が必要となる場合があります。このグラフは、12時間の実験期間におけるcaspase three陽性細胞の増加を示しています。習熟すれば、この手法は1時間で完了でき、適切に行えば一晩でデータを収集することが可能です。この手順を試みる際は、手順に沿って各処理間で一貫性を保つことが重要です。免疫染色などの他の手法を用いて、研究対象となるパスウェイに関与する他の下流タンパク質を観察することができます。このビデオを視聴することで、イメージング用サンプルの調製方法について十分に理解できたはずです。データセットを取得し、データを解析してください。

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、細胞死またはアポトーシスを定量するためのin vitro...

Caspase-3/7 Assay:カエルの皮膚外植片におけるCaspase-3/7活性を測定することによりアポトーシスを定量化する発光ベースのアッセイ

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。...

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

炎症性脱髄障害の皮質病変における脱髄とニューロンのアポトーシスのメカニズムに対処するために、異なる動物モデルが使用されます。ここでは、オリゴデンドロサイト特異的なCD8+ T細胞を脳切片に使用して、オリゴデンドログリアとニューロンの死をもたらすex...

アンエクスビボモデル

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。...

ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング

学ぶカスパーゼ-3活性化を用いたN19オリゴデンドログリア細胞のライブイメージング法。NucView 488基質でリアルタイムにアポトーシスを可視化し、細胞死メカニズムの理解を深めます。

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

さらに動画を探す