監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

この手順により、オリゴDDRグリア細胞死をリアルタイムで監視できます。これは、最初に細胞を培養し、次に細胞を生細胞イメージング用に準備することによって達成されます。次のステップは、細胞に治療を提供し、蛍光顕微鏡を使用してその影響を監視することです。

最後のステップは、データ分析を実行することです。最終的に、結果は、カスパーゼ活性化フルーロ色素からの核蛍光をモニタリングすることにより、治療または刺激後の細胞集団における細胞死率を示しています。免疫染色などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、複数の時点を同時に収集できることです。

この方法は、薬理学的、試薬、およびさまざまな治療に対する応答など、細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。現在、この方法は細胞培養内の死についての洞察を提供することができます。また、ex vivo、器官型組織、脳スライスなどの他のシステムにも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、固定組織ではなく生体組織での作業に慣れるのに苦労します。固定組織と比較して、生細胞サンプルを調製するための多くのステップがあるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。まず、凍結した不死化N 19オリゴドルーググリア細胞を摂氏37度の水浴中で解凍し、細胞が解凍します。

10cmの培養皿に10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した7ミリリットルの高グルコースDMEMを加えます。次に、細胞懸濁液をプレートに滴下し、ペトリ皿を穏やかに攪拌して細胞を均一に分散させます。細胞を摂氏34度で5セントの二酸化炭素インキュベーターで4時間培養し、4時間後に培養します。

プレートからメディアを吸引して、残っているDMSOを取り除きます。凍結保護剤。成長後4〜7日後に7ミリリットルの新鮮なメディアと交換します。細胞が70〜80%に達したら、培地を吸引し、1ミリリットルの滴下を細胞シートにピペットで入れ、室温で5分間インキュベートします。

次いで、次の種子の細胞を採取し、採取した細胞を10ミリリットルあたり6細胞の0.1倍の密度で採取した10cmの組織培養皿に入れ、この皿を組織培養インキュベーターに入れる。さらに1回のマッサージの後、細胞をライブセルイメージング実験用にプレーティングできます。これを行うには、以前と同様に細胞を採取し、次に細胞懸濁液を30マイクロリットル取り出し、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。

次に、滅菌鉗子を使用して、コーティングされていないガラスカバースリップを配置します。6ウェルプレートのウェルに、1ミリリットルあたり6個の細胞の0.1倍の密度でウェルに細胞を追加します。フェノールフリーのDMEM高グルコース培地に10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した2ミリリットルで、トランスフェクション前に細胞を摂氏34度と二酸化炭素5%で一晩増殖させます。

翌日、100マイクロリットルの無血清培地0.5〜4マイクログラムの精製プラスミド、DNAおよび4マイクロリットルのFU遺伝子HDを組み合わせます。混合物を2回穏やかにボルテックスし、次にDNAを室温で5分間複合体化させます。インキュベーション時間が経過したら、FU gene HD DNA混合物を培養細胞に直接加えます。

プレートを軽く傾けて混ぜます。次に、処理または実験の前に、細胞を摂氏34度と二酸化炭素5%でさらに48時間培養します。まず、LCI Chamライトライブセル装置コントロールボックスをオンにします。

これは、ステージの徹底的な加温を確保するために、実験開始の3時間前に行う必要があります。少なくとも、実験開始の1時間前にコントロールボックスをオンにする必要があります。次に、フローフードで作業し、LCI Cham光磁気式培養チャンバーと鉗子に70%エタノールを噴霧し、5分間乾燥させます。

インキュベーターから細胞を取り出し、顕微鏡で調べて健康であることを確認します。細胞はデュラント状に見え、多数の膜プロセスでガラスカバースリップ上によく広がるはずです。プロセス延長の数が減少している細胞や、不規則な形状の核を持つ細胞は、トランスフェクションによってストレスを受けている可能性が高く、フローフードでのさらなる実験には適していません。

6ウェルプレートを傾け、鉗子でカバースリップを取り外します。カバースリップセル側を上にして、チャンバーの底板にすばやく配置します。カバースリップを乾かさないでください。

次に、培養室の磁気本体を取り付け、元の6ウェルプレートから500マイクロリットルの培地をカバースリップの上部に加えます。培地を再利用することで、環境の変化によって細胞にかかるストレスが軽減され、細胞外分泌因子の評価にも役立ちます。培地を追加した後、ガラスカバーを培養チャンバーに置き、70%のKimワイプブレードを使用して、カバースリップの底から顕微鏡検査を妨げる可能性のある残留物を取り除きます。

培養室を摂氏34度、二酸化炭素5%のインキュベーターに30分間置きます。このステップにより、チャンバー自体が34度を温め、カバースリップのずれを減らすことができます。金属が温まると、次の手順では、周囲の部屋の照明をできるだけ低くして作業する必要があります。

まず、ソーラは以前に室温で核ビューのelequaを準備しました。次に、インキュベーターから培養チャンバーを取り出し、顕微鏡の環境チャンバーにすばやく配置します。デュアルレギュレーター付きの5%予混合二酸化炭素タンクをオンにします。

次に、顕微鏡ランプを約2.5ボルト、露光時間を240ミリ秒に設定して、10倍対物レンズを使用します。明視野顕微鏡を使用して焦点を合わせ、コンピューターモニター上の細胞を視覚化します。次に、蠕動ポンプを使用した低速および局所的な灌流による培地交換により、80ミリモル濃度のカリウムイオンまたは他のアポトーシス誘導剤を細胞に加えます。

Nuke View 4 88基質は、細胞培養で安定しており、36時間もの実験が可能です。したがって、この期間にわたって実験を行うことが可能です。まず、赤と緑の蛍光タンパク質からの蛍光を視覚化するように顕微鏡をセットアップします。

次に、赤チャンネルをクリックして、トランスフェクションされた細胞を表示します。トランスフェクションされた細胞が複数存在する約12フレームを選択して保存し、これらのXYステージポイントを保存します。顕微鏡で、これらの保存されたステージポイントの明視野赤チャンネルと緑チャンネルで画像を6分ごとにキャプチャします。

重複または三重の実験から複数のXYポイントを収集した後、異なる日に実施された別々の実験からのデータをまとめ、文書化されたプロトコルに記載されているようにデータ分析と統計テストを実行して、CASPベイの陰性細胞とCASPベイの陽性細胞の比率を比較します。Nuke view 4 88 基質は、N 19 オリゴ DDR グリア細胞培養のアポトーシス速度の増加を示すことができます。細胞外カリウム濃度を高くした処理後、これらのベースライン画像は 10 倍の対物レンズを使用して取得されました。

N 19細胞にRFPをトランスフェクションし、3マイクロリットルの核ビュー、コントロール細胞用の4 88基質、または3マイクロリットルの核ビュー、4 88基質および80ミリモルカリウムのいずれかで処理した。これらの画像は、アポトーシス細胞の数が、制御条件下で80ミリモルカリウムで処理した後、3時間後、6時間後、9時間後に時間とともに増加することを示しています。80ミリモルカリウムで処理した培養物と比較して、有意な量のアポトーシスは観察されませんでした。対照条件で観察された背景の緑色の信号は、細胞外カリウムを添加せずにアポトーシスを受けている細胞を示しています。

12時間の時間経過は、神経学的傷害を含む研究には適切です 12時間後、カリウム処理された培養物は約45%の細胞死を示しました。対照実験では、12時間の時点でアポトーシスを示す細胞は事実上ありません。ただし、他の状況では、実験をより長く実行する必要があるかもしれません。

このグラフは、12時間の実験の経時的なカスパーゼ3陽性細胞の増加を示しています。この手法は、一度取り組めば1時間で完了し、適切に行えば一晩でデータを収集できます。この手順を試行する際は、この手順に従って治療間で一貫性を保つことを覚えておくことが重要です。

免疫染色などの他の方法を使用して、研究対象の経路に関与する他の下流タンパク質を調べることができます。このビデオを見れば、イメージング用のサンプルの準備方法について十分に理解できるはずです。データセットを集録し、データを解析します。