フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

次の実験の全体的な目標は、フローサイトメトリーを使用して、新生児マウスの蝸牛から緩いZ陽性細胞を単離することです。これは、まず、比較的短い時間枠で多数のマウス蝸牛を単離して、細胞を生存可能に保ち、適切な開始組織を持つことによって達成されます。第2のステップとして、LAX Z陽性細胞を解離し、次に標識して、組織を選別用に準備します。

次に、細胞をフローサイトメトリーでソートします。得られたLAX Zの高集団と緩い低集団は、その後の実験に使用できます。この方法は、内耳内の遺伝子プロファイルや特定の細胞集団は何かなど、耳の研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

その手順を実演するのは、当研究室のTaha Gen A医学生です。まず、35mmのシャーレにHBSSを入れ、氷の塊の上に置きます。その後、虹彩はさみを使用して12〜15人の首を切り落とした後、出生後、生後0〜3日齢の軸索、2匹の怠惰なレポーターと野生型マウスを安楽死させました。

氷のブロックの上の60ミリメートルのシャーレにヘッドを置きます。次に、5番のデュモン鉗子と虹彩はさみを使用して、頭から下顎骨と舌を切除し、パレットの高さで頭蓋骨の基部を切り取ります。次に、子牛の上にある皮膚を取り除き、大孔の下部から口蓋の中央にハサミを挿入して頭蓋底を横断します。

口蓋の切り口から両側の子牛の上面まで、ハサミでもう一度切開します。耳嚢を傷つけないように注意してください。次に、フレームとマグナムの上面から硬口蓋の冠状切開まで伸びる2つの45度の角度の切開を行うことにより、側頭骨の分離を完了します。

次に、分離された側頭骨を氷ブロック上のHBSSを含む35ミリメートルのペトリ皿に入れ、氷ブロックを滅菌解剖フードに移します。次に、今度は別の35mmシャーレにPBSを入れ、氷のブロックに置きます。55番の鉗子を2本使用。

耳嚢の上にある側頭骨から皮質、脳幹、小脳を穏やかに除去することから、マイクロダイセクションを開始します。次に、耳嚢を取り外さずに、前庭蝸牛神経の入り口から耳嚢に続く蝸牛嚢の一部を削り取ります。蝸牛の基部を露出させた後、皮質の器官と周囲の組織をそっと引き出します。

次に、基部から始めて、残っているらせん状神経節と線条体ssisを取り除き、蝸牛をPBSファーストピペットで満たされたペトリ皿に移します。50マイクロリットルの滅菌PBSを、コーティングされていない6ウェル培養皿の1〜2ウェルの中央に注入します。次に、20個以下のaxin、2つの緩い蝸牛をPBSの各液滴に移します。

次に、摂氏37度の水浴中で約2分間、0.125%トリプシンの50マイクロリットルアリコートを予温します。次に、トリプシンを蝸牛に加えます。皿を振らないように注意してください。

蝸牛を摂氏37度で8分間インキュベートします。各液滴に50マイクロリットルの大豆トリプシン阻害剤を追加してトリプシン化を終了し、次にP 200ピペットマンを125マイクロリットルに設定した後、さらに50マイクロリットルのフルメディアを追加します。300マイクロリットルの鈍いピペットチップを使用して、気泡を作らないように注意しながら細胞を80回穏やかにテートします。

次に、各液滴をトリチュレートした後、それぞれにさらに200マイクロリットルのフルメディアを追加します。さて、細胞を40ミクロンの細胞ストレーナーに通して新しいウェルに入れます。同じ6ウェルプレート内で、各ウェルから個々の標準ファックス管に細胞を移します。

次に、100マイクロリットルの野生型細胞を3つのチューブのそれぞれに加え、続いてCUGのみの300マイクロリットルのフルメディアで希釈します。コントロールは、10マイクロリットルの軸索、2つのLAX Z細胞を390マイクロリットルのフルメディアに希釈します。残りの軸索2つの緩いZ細胞を400マイクロリットルOTのファックスチューブに移します。

次に、37°Cの加湿インキュベーターでチューブを10分間インキュベートした後、200マイクロリットルの希釈CUGを適切な各ファックスチューブに加えます。次に、すべてのチューブを光から保護し、摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞を25分間インキュベートします。細胞のインキュベーション中に染色するには、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルの新しく調製したヒープとFBSを入れ、チューブを氷の上に置きます。

次に、ライトをオフにして、光への露出を最小限に抑えるために、滅菌フードの下の各ファックスチューブに1.8ミリリットルの氷冷ヒープ溶液を追加します。次に、細胞を1200 RPMで室温で5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、ペレットを300マイクロリットルのフルメディアに再懸濁します。

選別サンプル用のすべてのアリコートをプールし、次にヨウ化プロピジウムを各適切なチューブに添加して、最終濃度が1ミリリットルあたり1マイクログラムになるようにします。最後に、細胞を覆った後、もう一度、それらを氷の上に置きます。まず、未染色の野生型細胞の1000イベントを収集してソーティングゲートを設定し、前方散布図とサイド散布図上の細胞分布を決定します。

必要に応じて、前方散乱と側面散乱のパラメータを調整します。次に、未染色の野生型PI染色野生型とCUG染色軸索で補います。2 つの LAX Z セル。

2 本のファックス管に 500 マイクロリットルのフル メディアを充填します。次に、野生型PI染色細胞ゲートと軸索2Lae CUG染色細胞ゲートで解析を開始し、前方散布図と側方散布図に基づいてデブリを除外します。前方散布図の高さと前方散布図面積のプロットを使用して、ダブレットと塊を除外します。

次に、前方散乱領域とPE sci 5面プロットに基づいてPI陽性死細胞を除外します。歩行配置ごとに、前方散布図領域とカスケードまたは太平洋青色領域のプロットを設定します。軸索を含むソートサンプルチューブからの10, 000のイベントを、野生型細胞のプロットを使用して野生型細胞に設定されたすべてのゲートを使用して、2つの緩いPIおよびCUG染色細胞を使用して分析します。

イベントの総数の 1% 未満のカスケード ブルーのハイ セルのゲートを作成します。カスケードBlue High Gatesには、Axon 2の緩いサンプルの細胞の約15〜20%が含まれているはずです。Axon 2 laxy cell analysis plotを使用してこれらの軸索を2つの高細胞にすると、前述のゲーティング戦略を使用して、最もインフルエンザの少ない細胞の15〜20%のゲートが作成されます。

細胞を完全なメディアを含むファックスチューブに選別し、ソーティング中はチャンバー内の収集チューブを摂氏4度に冷却します。フローサイトメーターでカウントした各集団の細胞数をこれら2つの図に記録します。左側が解離野生型の側散乱領域と前方散乱領域、右側が軸索2 LA Zです。

蝸牛細胞が示されています。デブリの負の母集団として指定された Y 軸に近いイベントよりもはるかに大きいサイズのイベントの異なるグループのゲーティングに注意してください。通常、40〜45%の破片を含まない細胞は、これら2つのパネルで野生型とaxin two LAX Z蝸牛の両方から回収されます。

前方散乱高さと前方散乱領域は、以前にゲートされた破片からダブレットを除外するために使用されます。プロットの予想される線形性から逸脱する負の母集団イベントは除外されます。この準備により、通常、指定されたゲート内で71.1%のイベントが生成されます。ここは。

PE SCI 5チャネルによって検出されるヨウ化プロピジウムは、これらの散布図で観察されるように、死細胞を除外するために使用されます。選別された細胞の約95%は生存可能であり、これらのパネルではPI PIを取りませんでした。カスケードブルーチャンネルは、右の図に示すように、蛍光基質CUGを検出するために使用されました。

平均して、上位の約20%CUG陽性細胞は、約15, 000軸索、10〜12匹の動物あたり2つの高細胞と相関する高細胞です。このビデオを見れば、細胞チューリング実験と遺伝子プロファイリングなどの実験の両方で、内耳組織からのフローサイトメトリーを使用して緩い高細胞を調製および単離する方法を十分に理解できるはずです。