の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス

この手順の全体的な目標は、遺伝子機能を定量的にアッセイし、ゲノムワイドスケールで優雅さを見ることです。これは、まず各遺伝子の発現をRNAの目でノックダウンすることで達成されます。96ウェルプレート。

次に、遺伝子機能に関する関連検査を行います。この例では、シーエレガンスが真菌感染に正常に反応する能力を、誘導性蛍光レポーターの発現を分析することによって評価します。次に、Coss bio sorttを使用して自動定量分析が行われ、最終的には、蛍光レポーター遺伝子の発現などの定量化可能な形質の分析は、特定の経路の調節、発生、行動、または生理学の制御に必要な遺伝子のサブセットを示しています。

この方法は、発生、神経生物学、宿主病原体の相互作用など、優雅に見えるさまざまな分野での主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Oranger研究室から最初の大規模なRNAアイスクリーンが発表されたときでした。必要なツールを開発し、自動化を完成させるには、かなりの努力が必要でした。

私は、スタッフサイエンティストであり、ジョナサンユーバンクス研究室の研究助手であるオリビアティと一緒に手順をデモンストレーションします 10から1296を作るために。ウェルプレートは、脱イオン水中で100ミリリットルの線虫増殖、培地またはNGMを調製することから始まります。手順については、書面によるプロトコルを参照してください。

培地がまだ温かい間に、アンピシリン1ミリリットルあたり100マイクログラム、テトラサイクリン1ミリリットルあたり12.5マイクログラム、4ミリモルのIPTGを加え、96ウェルフラットボトムプレートの各ウェルに75マイクロリットルをすばやく分配します。ウェルに存在する気泡をすぐに確認して取り除きます。プレートは摂氏4度の湿度の高いチャンバーに保管します。

次に、アンピシリンとテトラサイクリンを含むLB1.5ミリリットルを加えて、96枚のディープウェルプレートを調製します。各ウェルに一意のラベルまたはバーコードを追加します。各プレートを覆い、事前に準備した場合は摂氏4度で保存し、RNAIを含む96ウェルLBストックプレートを攪拌します。

アンピシリン、テトラサイクリン、およびグリセロールを含む細菌クローン、および各細菌クローンの3マイクロリットルを、事前に調製した96ディープウェルプレートの対応するウェルに分配します。コントロール用の空のウェルを使用し、96のディープウェルプレートを接着フィルムで覆い、攪拌しながら摂氏37度で一晩インキュベートします。使用済みの96ウェルレプリケートプレートを、一晩培養した翌朝にマイナス80°Cに置きます。

96ウェルNGMプレートを摂氏4度から滅菌層流キャビネットに移し、5〜15分間温めて乾燥させます。次に、各プレートに適切なラベルまたはバーコードを追加します。インキュベーターから96枚のディープウェルオーバーナイト培養プレートを取り出します。

成功した成長細菌培養物の遠心分離を観察します。96 ディープウェルプレートを 4, 000 RPM で 5 分間。プレートを急激に逆さまにして上澄みを排出し、急速に乾かします。

ペーパータオルの上のプレートの端は、ボルテックスによってバクテリアペレットを残留液体に再懸濁します。理想的には、専用の攪拌機を使用して、各プレートが正確に同じ処理を受けるようにします。5マイクロリットルのResus懸濁細菌を、8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを使用して96ウェルNGMプレートに移します。

NGMには触れないでください。バクテリアを滅菌された層流キャビネットの下で約2時間乾燥させます。NGMが2つのドライインキュベートにならないように定期的にチェックし、96ウェルR-N-A-I-N-G-Mプレートを摂氏37度の湿度の高いチャンバーで一晩放置します。

96ウェルR-N-A-I-N-G-Mプレートを室温で冷却した後、ワームの同期集団を調製するための書面によるプロトコルを参照してください。それぞれに2マイクロリットルのMナインに約100〜200匹のワームを追加します。各井戸にワームがいることをよく確認してください。

ワームは泳いでいるはずです。プレートを滅菌層流キャビネットの下で最大1時間乾燥させます。プレートは定期的にチェックしてください。

ワームは泳ぐのではなく、這う必要があります。プレートを摂氏25度の湿ったチャンバーに一晩置きます。ジャッジ・ミリアスポラの感染力の高いバッチを選択した後。

M nine Bufferを使用して、9センチメートルのプレートから胞子を収集します。各ウェルに4マイクロリットルの胞子を分配し、各ウェルに胞子がないか確認します。ワームは泳いでいるはずです。

プレートを滅菌層流キャビネットの下で約1時間乾燥させます。ワームが這い始めるまで、プレートを定期的にチェックしてください。次に、感染したプレートを摂氏25度の湿ったチャンバーに一晩置きます。

分析前に蛍光顕微鏡で迅速に観察して線虫をチェックし、ネガティブコントロールで良好なGFP誘導を行い、ポジティブコントロールウェルでGFP蛍光を減少させるための開発に成功します。誘導が良好な場合は、8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを使用して、100マイクロリットルの50ミリモルNACLと0.05%トリトンを含む線虫を新しいラベルまたはバーコードに移します。96ウェルラウンドボトムプレート。

分析当日に凍結したプレートを室温で解凍するまで、プレートをマイナス80°Cで凍結します。プレートが解凍されたら。COPAのBIOSを使用した自動解析に進みます。

機械はプレートをウェルバイウェルで処理し、各ワームのパラメータ(蛍光など)を分析します。COPAのbiosソートから取得した情報をExcelファイルに書き起こし、データ品質を確認します。次に、光学密度、軸長、蛍光発光などの生データをリムパッケージに保存し、その後の詳細な定量分析を行います。

この実験では、トランスジェニック線虫は、P call 12 ds red reporterおよび誘導性PNLP 29 GFPを構成的に発現した。レポーターワームをコントロールまたはA-G-F-P-R-N-Aアイクローンに48時間ばく露しました。左側のパネルは感染していない線虫で、右側のパネルはDスポラに感染してから18時間後の線虫です。

目的の表現型がA GFPレポーターの発現である場合、GFP RNAiクローンを持つ遺伝子ウェルズは、頑健なコントロールを提供します。COPA bios SORTTは、分析された各ワームの数値データを生成します。これらのグラフは、トランスジェニックワームの各ウェルの平均と標準偏差を示しています。

RNAIおよびディアスポラ感染後のpコール12 DSレッドレポーターおよび誘導性PNLP 29 GFPレポーターを構成的に発現する。ソーターは、ワームのサイズ、赤色の蛍光、および緑色の蛍光とTOFの比率に対応する飛行時間またはTOFを分析します。特定のクローンは、成長欠陥を引き起こしたり、P 12 DSレッドの発現に影響を与え

その他は、特にFP表現に影響を与えます。例えば、この特定のクローンは、NLP 29の調節に重要であることが以前に示された遺伝子NS Yを標的としています。緑と赤の蛍光とTOFは、任意ですが一定の単位で測定されます。

このプロトコルの革新の1つは、凍結プレートを使用して分析を延期することです。凍結により、ここに示すように、結果を大幅に変更することなく、プレートを最大2週間保存できます。測定された蛍光の絶対値は変更される可能性がありますが、それらの相対的な比率は類似したままです。

PNLP 29 GFPおよびP call 12 dsの赤色導入遺伝子を保有する4本の線虫は、ディアスポラに感染していたか、感染していないかのどちらかであった。18時間後、各プレートを大まかに2つに分けて、半分をすぐに分析し、半分をマイナス80°Cで24時間冷凍してから解凍しました。各サンプルについて、平均サイズ、不透明度、および緑と赤の蛍光の分析値を計算しました。

グラフは、ここに示されている凍結サンプルと生サンプルについて、感染者の平均を非感染サンプルで割った比率を示しています。代表的なプレートの重複分析から、各ウェルの正規化された蛍光比が、ウェルの蛍光平均をプレートのトリミング平均で割ったものです。このプロトコルを習得すると、2〜3人のグループが2〜3か月でゲノムワイドスクリーニングを実行できるようになります。

このプロトコルを成功裏に実行するには、多くの優れたチームワークが必要です。私のグループのメンバーは、効率的で比較的簡単に実行できるプロトコルを作成するために多大な努力を注ぎました。