Name: の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶC. elegansを用いた自動化ハイスループットRNAiスクリーニング法で、遺伝子機能を定量的に解析し、抗真菌自然免疫に関与する遺伝子を同定する効率的なプロトコルです。

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我々は彼らの貢献のためにD. Braendle、CLクルツとF.Montañana·サンチスに感謝します。このプロジェクトは、ANRとConseilの地域PACAと、INSERMおよびCNRSからの制度資金からの補助金によってサポートされていました。

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

ユーバンクラボでは、連合BiometricaとMODULバイオと協力しています。

<p class="jove_content"&gt;現在のプロトコルは、大規模なRNAiスクリーニングでできます。<em&gt; C.エレガンス</em&gt;読み出しとして蛍光レポーター遺伝子の発現レベルを使用する固体培地上で。それは、効率的で信頼性と再現可能な方法で、多数のサンプルを簡単かつ高速処理を可能にする、ハイスループットアッセイを容易にする自動化ツールで最適化されています。他の方法は、自動液体試料の取り扱い上のように大きく依存していないことが記載されている<sup&gt; 8</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;プロトコルの1つの重要な組織的な側面は、企業のModulBioと共同でRNAiスクリーニング手順に商用MBioLIMSソフトウェアを適応させることによって、サンプルトラッキングの堅牢な方法の開発がされています。手続きのあらゆる段階で、プレートは今LIMS内で生成されたバーコードによって識別されます。 LIMSまた、各プレートに各ウェルのクローンのIDを記録するように、ウェルから推定される遺伝子に行くのは簡単です。そして、これを越えて、コミュニティデータベースWormBaseへLIMSのリンクは、任意の遺伝子についての分子的および機能的なデータへの直接アクセスを可能にします。 LIMSはまた、プレート、あるいは染色体と全ゲノムレベルで実施する分析を容易にします。これらの分析は、データはそのようなCOPAmulti前述したようにツールと完全に互換性のある方法で格納されている<sup&gt; 16</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;メソッドの1つの重要な実験点は、ワームの数に比例し、食品の量の調整です。多くのアッセイのために、それはワームは実験の最後に餓死しないことが不可欠であるが、それは開始時にあまりにも多くの食べ物を持っていないようにすることも重要です。我々は、食品の高密度は、pを運ぶ虫を用いたプロトコルで蛍光誘導を減少させることを観察した<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFPレポーター。これは、ワームはあまりにも多くの細菌（BS、未発表の結果）で培養され減少した感染効率を反映するかもしれません。これは、dsRNAは最適なレベルで生産されているかどうかを決定するので、同時に、RNAiの細菌の培養条件は、も重要です。大規模なRNAiのためのいくつかのプロトコルは、液体培養物を播種する前に、寒天プレート上でのRNAiクローンの培養を必要とする<sup&gt; 8</sup&gt;。我々はこのステップを省略して堅牢な遺伝子サイレンシングを得た。我々は、同種の結果を確実にするためにそれぞれの文化の過剰成長を選んだ。事実で説明されたプロトコルは、並列に2つまたは3つのスクリーンを行うのに十分な材料を提供する。最も堅牢な結果を得るの利益のために、我々は、ワーム、RNAiの細菌や真菌胞子の独立した培養物を使用して複製の画面を行って、しかし、支持している。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;もう一つの重要なステップは、あまりにも高温多湿でも乾燥しすぎでもない媒体を使用してに関連しています。プレートは十分に乾燥されていない場合は、RNAiの細菌が適切に乾燥させないため、ワームは、アッセイ中に泳ぐことになります。これは問題を引き起こす可能性があります。たとえば、ワームは効率的に感染されていません<em&gt; D. coniospora</em液体中に&gt;（C. Couillault、未発表結果）。一方、乾燥したプレートに、培地の浸透圧が増加する。これは、ワームの生理に直接影響を持っている<sup&gt; 17</sup&gt;など、いくつかの抗菌ペプチド遺伝子の誘導など、<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;。ワームや胞子を分配するために使用されるボリュームは、効果的かつ迅速な乾燥を可能にすることが重要です。液体以上の10μLを新鮮プレートに添加されている場合は、井戸が乾燥するために多くの時間を取ることができます。これは、プレートにワームを追加するには、ロボットのメソッドを使用することは困難であることを意味します。たとえば、各ワームは、液体の約1μLでBiosortによって分配される。それはまた、私たちは堆積物の溶液中でのワームの傾向を克服することができますように我々は現在、手動でワームを配布しています。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々は以前に1つの96ウェルプレートを36分で分析することが許可されてBiosortの調整を報告<sup&gt; 19</sup&gt;。マシンのメーカーUBIは現在さらに分析時間を短縮するBiosortの修正を提供しています。 &quot;FastReFlex&quot;で、試料を直接、バブルトラップフィルタをバイパスして、分析用フローセルを介してルーティングされます。データ収集のための時間の大幅な削減この結果、全体のプレートは、1日あたり処理すべき20枚の周りにできるように22分で解析することができます。プレートは凍結されていない場合は、しかし、最初と最後のものの間で8時間の間隔があるでしょう。わずか18時間持続感染実験の比較的短い期間、与えられた、これは板を越えて受け入れられない変数を導入する。分析前に凍結プレートは、この問題を解決するが、2人は簡単に50プレート週まで処理することができ、現在のプロトコルおよび標準液体ハンドリングロボットとして、それはまた、ハイスループット分析のコンテキストで不可欠であるだけでなく。現在、我々は定期的に全ゲノムの画面を可能にする30枚の週を、画面未満の2ヶ月に一度実施することができます。</p&gt;<p class="jove_content"このプロトコルの&gt;一つの興味深い機能は、液体培養では実行できませんアッセイを可能にする、固形寒天を使用している事実である。ワームの生理学では、培養条件に応じて異なりますので<sup&gt; 20,21</sup&gt;、固体培地上でアッセイを行うことができることは、またいつもの液体ベースの画面を補完することができます。特定の表現型（例えば運動）の場合、解析は96ウェル固体培地プレートで直接行うことができます。現在の画面は、しかし、Biosortのような固体培地プレートからのサンプルができない、ワームが最初に凍結する前に、液体に転送されます。一方、COPAS Biosortは多くの異なった表現型の測定との互換性multiparametric定量分析を可能にします。それは、任意の画面にすべての測定パラメータは、プライマリ読み出しされる可能性がある。それにもかかわらず、これらの測定は、いくつかの理由で役立ちます。彼らは1つがアッセイが正しく実行されたかどうかを判断することができます。例えば、一つは、各ウェル中のワームの数とサイズを確認することができます。 RNAiのクローンは、成長や繁殖を阻止すべき唯一の場所が期待値からの偏差である必要があります。 20未満のワームおよび/または30％小型動物（TOF）とウェルズは、標準に比べて成長に影響はありません標準コントロール（<em&gt;例えば、GFP（RNAi実験</em&gt;））は、以降の分析から除外することができます。それらの開発がうまく進んでいる後にこれらのクローンの機能は、ワームがRNAiの細菌にさらされている請求項代替プロトコルを使用して対処することができます<sup&gt; 15</sup&gt;。別のパラメータはまた、唯一の緑色蛍光が赤色ではなく影響を及ぼしているものにヒットを制限するたとえば、候補遺伝子（ヒット）選択を絞り込むために使用することができます。ヒットを選択するために選ばれた正確な方法は、画面の種類とその正確な読み出しに依存します。定量的なゲノムワイドな画面から生成されたデータの複雑さを考えると、統計学者とのコラボレーションが必要な場合があります。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々が記述するプロトコルは、容易にアッセイの他のタイプに適合させることができます。たとえば、感染段階で<em&gt; D. coniospora</em&gt;固体培地に感染することができ、他の病原体によって置き換えることができます。我々は液体培養でセラチア感染の重要な病原因子の多くは、固形培地（E. Pradel、私信）に感染時に役割を果たしていないことを発見したので、これは潜在的に有用である。プロトコルはまた、化学化合物のテストと完全に互換性があります<sup&gt; 22から24</sup&gt;、または細菌の異なるライブラリを使用して生物活性を有する化合物を識別するために<sup&gt; 25</sup&gt;そうでは一般的なユーティリティを見つける必要があります<em&gt; C.エレガンス</em&gt;研究コミュニティ。</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD診断システム</td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td> BD診断システム</td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal接着フィルム</td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4で </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96ディープウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル平板</td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル丸プレート</td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>すべてのサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECANロボット</td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td>レイニン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td>組合Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> MODULバイオ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドrnaiスクリーニング c.エレガンス</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA干渉は、全ゲノム規模でかつ定量的文脈で実施する場合は特に、遺伝子の機能を理解するための強力な方法です。 C.で虫 、遺伝子の機能は、特定の遺伝子の1に対応するdsRNAを発現する細菌で、ワームを供給することにより、簡単かつ効率的にノックダウンすることができます。 RNAiのクローンのライブラリの作成​​は 、Cの大部分をカバーしながら、 elegansのゲノム2,3（例4-7参照）真の機能ゲノム研究のために道を開いた、最も確立された方法は面倒です。モイらは、ゲノムワイドな画面8を容易にする半自動化されたプロトコルを開発しました。アプローチは、顕微鏡イメージングと画像解析に依存しています。 ここでは、細菌のRNAiのクローンのロボットハンドリング、COPAS Biosort（ユニオンBiometrica（UBI））を用いた定量分析などに基づいて、ハイスループットのゲノムワイドな画面の代替プロトコルを記述する統合ソフトウェア：MBioLIMS（MODULバイオからラボ情報管理システム）のデータ管理とサンプルを追跡するための高いスループットを実現する技術。メソッドは、画面が固形培地プレート上で実施することができます。これは、C言語でそれらのアドレッシング宿主-病原体相互作用などいくつかの研究のために特に重要です。 線虫は、特定の微生物を効率的に培養液でワームに感染していないので。 我々は、メソッドがCの抗真菌自然免疫の遺伝子の重要性を定量化するために使用することができる方法を示していますエレガンス 。このケースでは、このアプローチは、抗菌ペプチド遺伝子NLP 29とで構成的に発現される赤色蛍光レポーターのプロモーターの制御下にGFPを、表皮感染誘導蛍光レポーター遺伝子をトランスジェニック株の使用に依存しています表皮。後者は、表皮の機能の整合性が内部統制を提供していますと非特異的な遺伝子サイレンシング9。コントロールワームは真菌に感染しているとき、彼らは緑色蛍光を発する。 RNAiにより感染した後に減少した蛍光のNLP 29式の結果を得るために必要な遺伝子をノックダウン。現在、このプロトコルは、3,000以上のRNAiのクローンは2ヶ月以内にゲノム全体をスクリーニングの可能性を開いて、週ごとにテストし、分析することができます。

我々は、使用してプロトコルを記述する<em&gt; C.エレガンス</em&gt;とRNAiはそのような集団内の個々のワームの蛍光、サイズや不透明度などの複数のパラメータの自動測定を可能にするライブラリを供給する。私達は中の抗真菌自然免疫に関与する遺伝子を識別するために画面の一例を与える<em&gt; C.エレガンス</em&gt;。

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA干渉は、特に全ゲノムスケールかつ定量的な文脈で実施される場合、遺伝子機能を理解するための強力な手法となります。C. ...

本手順の全体的な目的は、遺伝子機能を定量的に解析し、ゲノムワイドなスケールでその機序を明らかにすることです。これは、まず96ウェルプレートを用いて、RNAiにより各遺伝子の発現をノックダウンさせることで達成されます。次に、遺伝子機能に関する適切な試験を実施します。本例では、誘導性蛍光レポーターの発現を解析することで、真菌感染に対して正常に反応する海辺の優雅さ（sea elegance）の能力を評価します。その後、Coss bio sorttを用いて自動定量解析を行います。最終的に、蛍光レポーター遺伝子の発現などの定量可能な形質の解析により、特定の経路の調節、あるいは発生、行動、生理機能を制御するために必要な遺伝子のサブセットが明らかになります。この手法は、発生学や神経生物学、宿主と病原体の相互作用など、洗練されたアプローチが求められるさまざまな分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちがこの手法を考案したのは、Oranger研究室から最初の大規模なRNAiスクリーンが発表されたときでした。必要なツールの開発とオートメーションの完成には、かなりの努力を要しました。スタッフサイエンティストであり、Jonathan Eubanks研究室のリサーチアシスタントであるOlivia tiと共に、手順を実演します。10枚から12枚の96ウェルプレートを作製するために、まず脱イオン水を用いて100 mLの線虫増殖培地（NGM）を準備します。手順の詳細については、記述プロトコルをご参照ください。培地がまだ温かいうちに、100 µg/mL のアンピシリン、12.5 µg/mL のテトラサイクリン、および 4 mM の IPTG を添加し、96ウェル平底プレートの各ウェルに 75 µL ずつ速やかに分注します。ウェル内に気泡がある場合は、直ちに確認して除去してください。プレートは加湿チャンバー内で 4 °C で保存します。次に、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含むLB培地を1.5 millilitersずつ加え、96深孔プレートを用意します。各ウェルに固有のラベルまたはバーコードを付与します。事前に準備した場合は、各プレートに蓋をして4 °Cで保存し、RNAIを含む96ウェルLBストックプレートを振盪させます。アンピシリン、テトラサイクリン、およびグリセロールを含む細菌クローンを調製し、あらかじめ準備した96深穴プレートの対応するウェルに、各細菌クローンを3 µLずつ分注します。コントロールには空のウェルを使用してください。96深穴プレートを粘着フィルムで密閉し、37 °Cで振盪しながら一晩培養します。一晩培養した翌朝、使用した96ウェル複製プレートを-80 °Cで保存します。4°Cに保存していた96ウェルNGMプレートを滅菌済みラミナーフローキャビネットに移し、5〜15分間置いて温度を戻し、乾燥させます。その後、各プレートに適切なラベルまたはバーコードを貼付します。インキュベーターから一晩培養した96ディープウェル培養プレートを取り出します。正常に生育した細菌培養液の遠心分離を確認します。96深孔プレートを4,000 RPMで5分間遠心分離します。プレートを急激に逆さまにして上清を捨て、速やかに乾燥させます。ペーパータオルの上でプレートの端を使い、ボルテックスミキサーで攪拌して細菌ペレットを残留液中に再懸濁させます。理想的には、各プレートに正確に同一の処理が行われるよう、専用の攪拌機を使用してください。8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを用いて、再懸濁した細菌5 µLを96ウェルNGMプレートに分注します。NGMに触れないようにしてください。滅菌済みのラミナーフローキャビネット内で、細菌を約2時間乾燥させます。NGMが乾燥しすぎないよう定期的に確認しながら、96ウェルRNAi NGMプレートを湿室にて37°Cで一晩インキュベートします。96ウェルR-N-A-I-N-G-Mプレートを室温で冷却した後、同期させた線虫集団を調製するための記述プロトコルを参照してください。各ウェルに、2 µLのM9緩衝液に懸濁させた約100から200匹の線虫を添加します。各ウェルに線虫が入っていることを確認してください。線虫が泳いでいることを確認してください。プレートを滅菌済みラミナーフローキャビネット内で、最大1時間乾燥させます。定期的にプレートの状態を確認してください。線虫は泳ぐのではなく、這っている状態でなければなりません。プレートを25 °Cの加湿チャンバーに入れ、一晩放置します。その後、感染力の高いJudge Miria sporaのバッチを選択します。M9バッファーを用いて、9 cmプレートから胞子を回収します。各ウェルに4 µLの胞子を分注し、各ウェルに胞子が存在することを確認します。線虫が泳いでいる必要があります。プレートを滅菌済みの層流キャビネット内で約1時間乾燥させます。線虫が這い出し始めるまで、定期的にプレートを確認してください。その後、感染させたプレートを25 °Cの加湿チャンバーに入れ、一晩静置します。解析前に、蛍光顕微鏡下で迅速に観察し、虫が正常に成長していること、陰性対照ウェルで良好なGFP誘導が認められること、および陽性対照ウェルでGFP蛍光が減少していることを確認します。誘導が良好である場合は、8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを用い、100 µLの50 mM NaClおよび0.05% Tritonで虫を新しいラベル付きまたはバーコード付きの96ウェル丸底プレートに転移させます。プレートを-80°Cで凍結保存し、解析日まで保持します。解析当日は、凍結したプレートを室温で解凍します。プレートの解凍後、COPA biosを用いて自動解析を行います。Sorttマシンでプレートをウェルごとに処理し、各個体の蛍光などのパラメータを解析します。COPA bios sorttから得られた情報をExcelファイルに転記し、データの質を確認します。その後、吸光度、軸長、蛍光放出などの生データをlimbsパッケージに保存し、後で詳細な定量解析を行います。本実験では、P call 12 ds redレポーターおよび誘導性PNLP 29 GFPを恒常的に発現する形質転換線虫を用いました。レポーター線虫を、コントロールまたはA-G-F-P-R-N-A eyeクローンに48時間さらしました。左側のパネルは非感染線虫であり、右側のパネルはD spora感染から18時間後の線虫を示しています。注目する表現型がGFPレポーターの発現である場合、GFP RNAiクローンを含む遺伝子ウェルが強力なコントロールとなります。COPA bios SORTTは、解析した個々の虫について数値データを生成します。これらのグラフは、形質転換虫の各ウェルにおける平均値と標準偏差を示しています。RNAiおよびdiasporaの感染後、p call 12 DS redリポーターを恒常的に発現させ、PNLP 29 GFPリポーターを誘導的に発現させます。ソーターを用いて、線虫のサイズに相当する飛行時間（TOF）、赤色蛍光、および緑色蛍光とTOFの比率を分析します。特定のクローンでは、成長不全が誘発されるか、またはP 12 DS redの発現に影響が及びます。他には、特にFPの発現に影響を与えるものがあります。例えば、この特定のクローンは、NLP 29の調節に重要であることが以前に示された遺伝子NS Yを標的としています。緑色および赤色の蛍光とTOFは、任意ではあるが一定の単位で測定されます。本プロトコルの革新的な点の一つは、凍結プレートを用いることで解析を後日に延期できることです。ここで示すように、凍結させることで、結果を大幅に変化させることなく、プレートを最大2週間保存することが可能です。測定される蛍光の絶対値は変動する可能性がありますが、相対的な比率は同様に維持されます。PNLP 29 GFPおよびP call 12 ds redトランスジェニックを保持するL4期の虫を、diasporaに感染させた群とさせない群に分けた。18時間後、各プレートを大まかに2等分し、半分は直ちに解析し、もう半分は-80 °Cで24時間冷凍した後に解凍した。各サンプルについて、平均サイズ、不透明度、および緑色および赤色の蛍光の解析値を算出した。グラフは、ここに示される凍結サンプルおよび生サンプルにおける、非感染サンプルに対する感染サンプルの平均値の比率を示しています。代表的なプレートの重複解析から得られた各ウェルの正規化蛍光比は、ウェルの蛍光平均値をプレートのトリム平均値で除したものです。このプロトコルに習熟すれば、2〜3人のグループで2〜3ヶ月以内にゲノムワイドスクリーンを実施することが可能です。このプロトコルを正常に遂行するには、優れたチームワークが不可欠です。私のグループのメンバーは、効率的かつ比較的容易に実施できるプロトコルを作成するために多大な努力を傾けました。

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Biology

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学ぶC. elegansを用いた自動化ハイスループットRNAiスクリーニング法で、遺伝子機能を定量的に解析し、抗真菌自然免疫に関与する遺伝子を同定する効率的なプロトコルです。

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス

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