の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス

本手順の全体的な目的は、遺伝子機能を定量的に解析し、ゲノムワイドなスケールでその機序を明らかにすることです。これは、まず96ウェルプレートを用いて、RNAiにより各遺伝子の発現をノックダウンさせることで達成されます。

次に、遺伝子機能に関する適切な試験を実施します。本例では、誘導性蛍光レポーターの発現を解析することで、真菌感染に対して正常に反応する海辺の優雅さ（sea elegance）の能力を評価します。その後、Coss bio sorttを用いて自動定量解析を行います。最終的に、蛍光レポーター遺伝子の発現などの定量可能な形質の解析により、特定の経路の調節、あるいは発生、行動、生理機能を制御するために必要な遺伝子のサブセットが明らかになります。

この手法は、発生学や神経生物学、宿主と病原体の相互作用など、洗練されたアプローチが求められるさまざまな分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちがこの手法を考案したのは、Oranger研究室から最初の大規模なRNAiスクリーンが発表されたときでした。必要なツールの開発とオートメーションの完成には、かなりの努力を要しました。

スタッフサイエンティストであり、Jonathan Eubanks研究室のリサーチアシスタントであるOlivia tiと共に、手順を実演します。10枚から12枚の96ウェルプレートを作製するために、まず脱イオン水を用いて100 mLの線虫増殖培地（NGM）を準備します。手順の詳細については、記述プロトコルをご参照ください。

培地がまだ温かいうちに、100 µg/mL のアンピシリン、12.5 µg/mL のテトラサイクリン、および 4 mM の IPTG を添加し、96ウェル平底プレートの各ウェルに 75 µL ずつ速やかに分注します。ウェル内に気泡がある場合は、直ちに確認して除去してください。プレートは加湿チャンバー内で 4 °C で保存します。

次に、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含むLB培地を1.5 millilitersずつ加え、96深孔プレートを用意します。各ウェルに固有のラベルまたはバーコードを付与します。事前に準備した場合は、各プレートに蓋をして4 °Cで保存し、RNAIを含む96ウェルLBストックプレートを振盪させます。

アンピシリン、テトラサイクリン、およびグリセロールを含む細菌クローンを調製し、あらかじめ準備した96深穴プレートの対応するウェルに、各細菌クローンを3 µLずつ分注します。コントロールには空のウェルを使用してください。96深穴プレートを粘着フィルムで密閉し、37 °Cで振盪しながら一晩培養します。一晩培養した翌朝、使用した96ウェル複製プレートを-80 °Cで保存します。

4°Cに保存していた96ウェルNGMプレートを滅菌済みラミナーフローキャビネットに移し、5〜15分間置いて温度を戻し、乾燥させます。その後、各プレートに適切なラベルまたはバーコードを貼付します。インキュベーターから一晩培養した96ディープウェル培養プレートを取り出します。

正常に生育した細菌培養液の遠心分離を確認します。96深孔プレートを4,000 RPMで5分間遠心分離します。プレートを急激に逆さまにして上清を捨て、速やかに乾燥させます。

ペーパータオルの上でプレートの端を使い、ボルテックスミキサーで攪拌して細菌ペレットを残留液中に再懸濁させます。理想的には、各プレートに正確に同一の処理が行われるよう、専用の攪拌機を使用してください。8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを用いて、再懸濁した細菌5 µLを96ウェルNGMプレートに分注します。

NGMに触れないようにしてください。滅菌済みのラミナーフローキャビネット内で、細菌を約2時間乾燥させます。NGMが乾燥しすぎないよう定期的に確認しながら、96ウェルRNAi NGMプレートを湿室にて37°Cで一晩インキュベートします。

96ウェルR-N-A-I-N-G-Mプレートを室温で冷却した後、同期させた線虫集団を調製するための記述プロトコルを参照してください。各ウェルに、2 µLのM9緩衝液に懸濁させた約100から200匹の線虫を添加します。各ウェルに線虫が入っていることを確認してください。

線虫が泳いでいることを確認してください。プレートを滅菌済みラミナーフローキャビネット内で、最大1時間乾燥させます。定期的にプレートの状態を確認してください。

線虫は泳ぐのではなく、這っている状態でなければなりません。プレートを25 °Cの加湿チャンバーに入れ、一晩放置します。その後、感染力の高いJudge Miria sporaのバッチを選択します。

M9バッファーを用いて、9 cmプレートから胞子を回収します。各ウェルに4 µLの胞子を分注し、各ウェルに胞子が存在することを確認します。線虫が泳いでいる必要があります。

プレートを滅菌済みの層流キャビネット内で約1時間乾燥させます。線虫が這い出し始めるまで、定期的にプレートを確認してください。その後、感染させたプレートを25 °Cの加湿チャンバーに入れ、一晩静置します。

解析前に、蛍光顕微鏡下で迅速に観察し、虫が正常に成長していること、陰性対照ウェルで良好なGFP誘導が認められること、および陽性対照ウェルでGFP蛍光が減少していることを確認します。誘導が良好である場合は、8チャンネルまたは12チャンネルのマルチピペットを用い、100 µLの50 mM NaClおよび0.05% Tritonで虫を新しいラベル付きまたはバーコード付きの96ウェル丸底プレートに転移させます。

プレートを-80°Cで凍結保存し、解析日まで保持します。解析当日は、凍結したプレートを室温で解凍します。プレートの解凍後、COPA biosを用いて自動解析を行います。

Sorttマシンでプレートをウェルごとに処理し、各個体の蛍光などのパラメータを解析します。COPA bios sorttから得られた情報をExcelファイルに転記し、データの質を確認します。その後、吸光度、軸長、蛍光放出などの生データをlimbsパッケージに保存し、後で詳細な定量解析を行います。

本実験では、P call 12 ds redレポーターおよび誘導性PNLP 29 GFPを恒常的に発現する形質転換線虫を用いました。レポーター線虫を、コントロールまたはA-G-F-P-R-N-A eyeクローンに48時間さらしました。左側のパネルは非感染線虫であり、右側のパネルはD spora感染から18時間後の線虫を示しています。

注目する表現型がGFPレポーターの発現である場合、GFP RNAiクローンを含む遺伝子ウェルが強力なコントロールとなります。COPA bios SORTTは、解析した個々の虫について数値データを生成します。これらのグラフは、形質転換虫の各ウェルにおける平均値と標準偏差を示しています。

RNAiおよびdiasporaの感染後、p call 12 DS redリポーターを恒常的に発現させ、PNLP 29 GFPリポーターを誘導的に発現させます。ソーターを用いて、線虫のサイズに相当する飛行時間（TOF）、赤色蛍光、および緑色蛍光とTOFの比率を分析します。特定のクローンでは、成長不全が誘発されるか、またはP 12 DS redの発現に影響が及びます。

他には、特にFPの発現に影響を与えるものがあります。例えば、この特定のクローンは、NLP 29の調節に重要であることが以前に示された遺伝子NS Yを標的としています。緑色および赤色の蛍光とTOFは、任意ではあるが一定の単位で測定されます。

本プロトコルの革新的な点の一つは、凍結プレートを用いることで解析を後日に延期できることです。ここで示すように、凍結させることで、結果を大幅に変化させることなく、プレートを最大2週間保存することが可能です。測定される蛍光の絶対値は変動する可能性がありますが、相対的な比率は同様に維持されます。

PNLP 29 GFPおよびP call 12 ds redトランスジェニックを保持するL4期の虫を、diasporaに感染させた群とさせない群に分けた。18時間後、各プレートを大まかに2等分し、半分は直ちに解析し、もう半分は-80 °Cで24時間冷凍した後に解凍した。各サンプルについて、平均サイズ、不透明度、および緑色および赤色の蛍光の解析値を算出した。

グラフは、ここに示される凍結サンプルおよび生サンプルにおける、非感染サンプルに対する感染サンプルの平均値の比率を示しています。代表的なプレートの重複解析から得られた各ウェルの正規化蛍光比は、ウェルの蛍光平均値をプレートのトリム平均値で除したものです。このプロトコルに習熟すれば、2〜3人のグループで2〜3ヶ月以内にゲノムワイドスクリーンを実施することが可能です。

このプロトコルを正常に遂行するには、優れたチームワークが不可欠です。私のグループのメンバーは、効率的かつ比較的容易に実施できるプロトコルを作成するために多大な努力を傾けました。