神経変性疾患におけるハイコンテントスクリーニング

本実験の全体的な目的は、細胞疾患モデルにおけるハイコンテンツアッセイを利用して、神経変性疾患で影響を受けるパスウェイを定量化することです。これを達成するために、疾患表現型の細胞モデルを自動細胞培養システムに投入し、必要な細胞数に達するまで培養します。その後、細胞を継代・計数し、さまざまなshRNAを発現するレンチウイルスを含む96ウェルプレートに分注します。

6日間の細胞分化後、細胞をシステムから回収し、免疫染色およびハイコンテンツイメージングを行います。最終的に、さまざまな解析アルゴリズムを用いて画像を解析し、細胞の健康状態、神経突起の伸長、およびミトコンドリア機能に関連する特徴を定量化します。

また、有意な相互作用効果を特定するために、Novasを用いて二元配置分散分析による解析も行います。この手法により、疾患関連遺伝子の機能や、それらが全体的に関与するパスウェイに関する重要な疑問への回答を迅速化できます。これにより、神経変性疾患に関与する病原性メカニズムのより深い理解につながります。

細胞培養プロセスを開始するために、細胞培養プレートの投入に向けて自動細胞培養システムを準備します。ピペットチップ、細胞培養プレート、アッセイプレートなどの消耗品をシステムにロードします。また、細胞培養培地、PBS、およびトリプシンがシステム内に十分にあることを手動で確認してください。

SH SY five Y 神経芽腫細胞株を、1プレートあたり2 × 10⁶ cellsとして、2枚のオムニトレイプレートに播種します。10% fetal bovine serum (FBS) を含む最適培地で細胞を維持し、プレートを細胞培養ロボットのインプット棚に設置します。グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を使用して、A adherent cell culture プロトコルを選択し、コンフルエンスの閾値が70%に設定されるよう、adherent cell line 専用のパラメータファイルを調整します。

合計イオン化時間を2分に設定します。システムに、1プレートあたり2×10⁶個の細胞を播種した新しいOmniTrayプレートを準備するよう指示します。システムに、1つのOmniTrayプレートにつき4枚のアッセイプレートを準備し、1ウェルあたり合計5,000個の細胞を播種するよう指示します。細胞を37°C、5% CO2でインキュベートします。

この接着細胞培養プロトコルでは、以下の手順に従います。細胞が定義済みのコンフルエンス閾値に達するまで、プレートのインキュベートとイメージングを繰り返します。5回の読み取りまでコンフルエンス閾値に達しない場合、プレートをシステムから取り出します。

ユーザーが定義したコンフルエンス閾値に達すると、細胞の洗浄、トリプシン処理、および計数が行われます。あらかじめ設定された数の細胞が新しいomni traitプレートに加えられ、十分な細胞数がある場合は、指定された数のアッセイプレートがデッキに搬送され、各ウェルに規定数の細胞が分注されます。最終的に、アッセイプレートを内蔵顕微鏡で直接イメージングするか、あるいはウイルス産生の手順を開始するためにシステムから取り出してさらなる処理に回すことができます。

HRNAベクターを含む細菌グリセロールストックをアンピシリン含有LB培地に接種して一晩培養し、翌日に細胞を遠心分離して上清を除去します。Wizard Magnus細胞プラスミド精製システムを用いてプラスミドを抽出します。プラスミドDNAを含む最終的な溶出液を96ウェルプレートに回収します。shRNAレンチウイルスは、RNAiコンソーシアムを用いて96ウェルプレート内でレンチウイルス作製を行います。すべての実験はML2またはBSL2安全研究室で実施しなければならず、使用したすべての試薬および消耗品は使用後に30%塩素で除染する必要があります。

レンチウイルスの作製手順はこのビデオでは実演しませんが、4日間を要し、以下のステップで構成されます。まず、0日目の午後にパッケージング細胞を播種します。1日目に、パッケージング細胞に3種類のレンチウイルスプラスミドをトランスフェクションし、その後18時間が経過した時点で次段階へ進みます。

2日目に、培地を高BSA濃度または高血清濃度の新鮮な培地へと交換します。培地交換から24時間後、すなわち3日目にウイルスを回収し、再び培地を高BSA濃度または高血清濃度の新鮮な培地へと交換します。

最後に、最初のウイルス回収から24時間後（4日目）に、再度ウイルスを回収します。パッケージング細胞を廃棄し、レンチウイルスの感染多重度（MOI）を算出します。SHSY5Y細胞にウイルスの連続希釈液を導入し、37 °Cで72時間インキュベートします。顕微鏡下でGFP発現を可視化し、GFP陽性細胞の割合を決定します。MOIを3として、shRNAレンチウイルスをアッセイプレートに播種します。shRNAレンチウイルスをアッセイプレートに播種した後、レンチウイルス導入のため、プレートを自動細胞培養システムにロードします。

24時間後、アッセイプレートの培地を0.5% FBSおよび0.1 $\mu\text{M}$ レチノイン酸を含む最適培地に交換します。分化プロセスを開始するため、アッセイプレートを分化培地で5日間さらにインキュベートし、5日目に標的遺伝子発現の最大ノックダウンを確実にします。6日目にDJ-1タンパク質のミトコンドリアへの移行を促進するため、アッセイプレートの半分に$\text{H}_2\text{O}$を加え、24時間おきます。最終濃度200 $\text{nM}$/ウェルとなるようにMitotrackerを細胞に加え、37 °Cで30分間インキュベートします。

その後、プレートをハイコンテンツ（HC）イメージャーに輸送してイメージングを行うことができます。あるいは、免疫染色などのさらなる処理を行うために、プレートをシステムから搬出することも可能です。ハイコンテンツイメージングでは、20x対物レンズを用いて、1ウェルあたり計30視野をイメージングします。具体的には、Trixyフィルターセットでミトコンドリアを、S5フィルターセットでβ3-tubulinを、そしてUVフィルターセットで核を可視化します。

これはハイコンテンツイメージングによって取得された細胞の複合画像の例です。図3のパネルAに未処理の細胞を、パネルBにH2Oで処理した細胞を示しています。DJ oneは緑色、ミトコンドリアは赤色、核は青色で標識されています。DJ oneとミトコンドリアの平均オーバーラップ係数を決定するには、colocalization bioアプリケーションを用いて画像を解析してください。

関心領域（ROI）を設定します。ROIを次のように設定し、ROI Aを核（図4 AおよびE）、ROI Bをミトコンドリア（図4 BおよびF）とし、ROI BからROI Aを除外します。細胞質のみを解析するため、ミトコンドリアをターゲット領域1、DJ 1をターゲット領域2として設定します（図4 CおよびG）。com compartmental analysis bioアプリケーションを用いて画像を解析し、ミトコンドリア内におけるMIT trackerシグナルの平均強度を決定します。

図4 BおよびFを用いて、β3-tubulin染色のニューライトの平均長を追跡します。Opera LX自動共焦点リーダーを用いて、ニューロンプロファイリングバイオアプリケーション（図4 DおよびH）を使用して画像を解析します。

561 nm レーザーでミトコンドリアを、UV励起画像で核を可視化します。水浸60倍対物レンズを用い、1ウェルあたり計30視野を撮影します。最後に、spot edge ridge（SER）テクスチャ特徴アルゴリズムを用いて画像を解析します。

SERリッジフィルターは、リッジ状のパターンを形成するピクセルの強度を透過させます。ミトコンドリアの断片化が進むほど、SERリッジスコアは高くなります。本ビデオでは、その欠損が常染色体劣性パーキンソン病の原因となるDJ-1Aタンパク質のモジュレーターを特定するために、ハイコンテンツ（HC）アッセイが使用されました。

この最初の代表的な結果は、DJ 1とのエピスタシス相互作用を示しています。左側の棒グラフは正規化された蛍光単位を示し、右側の画像は細胞生存率を定量化するためにMitoTrackerで赤色に標識されたSH-SY5Y細胞を示しています。

トキシンに曝露させた細胞において、DJ oneをノックダウンすると、スクランブル lentivirusを感染させた細胞と比較して細胞生存率の大幅な低下が認められました。標的遺伝子Aをノックダウンした場合も、DJ oneをノックダウンした細胞と同様の効果が観察されました。しかし、DJ oneと標的遺伝子Aの両方をノックダウンすると、いずれか一方の遺伝子のみを欠損させた場合よりも細胞生存率が有意に低下したことから、DJ oneと標的遺伝子Aの間に上位性の相互作用があることが示唆されます。次の例は、DJ oneの転位を制御する遺伝子に関するものです。

棒グラフは、DJ oneとミトコンドリアの正規化されたオーバーラップ係数を示しており、これはDJ oneの細胞質からミトコンドリアへの移行を反映しています。パネルAからDは、DJ oneを緑色、ミトコンドリアを赤色、核を青色でラベル化したSHSY 5Y細胞の画像です。細胞が毒素にさらされると、DJ oneは細胞質からミトコンドリアへと移行し、これはDJ oneとミトコンドリアの間のオーバーラップ係数の上昇によって定量化されます。

標的遺伝子Bがサイレンシングされた細胞では、細胞を毒素にさらした際にDJ oneのミトコンドリアへの移行が減少しており、これは標的遺伝子BがDJ oneのミトコンドリア輸送に関与していることを示唆しています。ここでは、神経突起の伸展に関与する遺伝子の例を示します。正規化した神経突起の長さを示す棒グラフとともに、神経突起長の定量に使用した細胞の画像を示しており、緑色でbeta three tubulinを、青色で核を染めています。

野生型SHSY five Y細胞において標的遺伝子Cをノックダウンすると、スクランブルSH RNAを発現するレンチウイルスを感染させた細胞と比較して、神経突起の長さが有意に増加します。この効果は、毒剤とともにインキュベートした細胞では消失します。最終的に、これらの結果はミトコンドリアの形態に関与する遺伝子の例を示しています。

スクランブルHRNAまたは遺伝子Dを標的とするA-S-H-R-N-Aに感染させたSHSY five Y細胞における、ミトコンドリアSERリッジセグメンテーションの平均値をグラフに示す。画像Aおよび画像Cは、それぞれスクランブルHRNAまたは遺伝子Dを標的とするA-H-R-N-Aに感染させたSHSY five Y細胞の合成画像である。ミトコンドリアは赤色、核は青色で色付けされている。

画像BおよびDは、ここで観察されたSERリッジの定量化の可視化結果である。野生型SHSY five Y細胞に遺伝子Dを標的とするHRNAを感染させると、スクランブルレンチウイルスを感染させた細胞と比較して、ミトコンドリアSERリッジのセグメンテーション値が増加する。この手法は、神経変性疾患分野の研究者が、疾患の病態に関与する経路を迅速に探索し、注釈を付けるための道を開くものである。

これにより、治療薬開発に向けたより適切なターゲットの特定につながります。