E13マウスからグリア制限前駆体の導出

この手順の全体的な目標は、胎児の脊髄からグリア制限前駆体またはGRP細胞を導き出すことです。これは、E 13の胎児から脊髄を採取し、GRP選択培地を用いて培養プレートに移すことによって達成されます。次に、イムノパンニングを使用してGRP集団を濃縮し、非GRP系統を排除します。

精製されたGRP細胞は、凍結して長期保存することができます。精製されたGRP細胞は解凍し、移植用GRP細胞が単一細胞の広い継代を通る移動を示すなど、将来の実験に利用することができます。この方法を視覚的に示すことは、特に経験の浅い目には外科的ステップを学ぶのが難しい場合があるため、非常に重要です。

今日は、ロシュ・デ・シルバとジョエル・マルクスが実演します。私たちの研究室の学生は誰ですか 胎児発育の胚の日E12またはE13に妊娠マウスダムを市販のソースから入手するか、社内で準備しました。E 1は、膣内に位置する粘液栓の存在によって定義されます。

フェンドのメスがオスと一緒に収容された翌日、すべての器具と組織培養フードを消毒しました。20ミリリットルの冷たい解剖培地できれいなペトリ皿を準備します。次に、クロラール水和物の麻酔注射でマウスを準備します。

マウスがつま先の挟み込みによる痛みの反射を示さない場合、たとえば、頸椎脱臼や斬首によって安楽死させると、胎児、そして最終的には派生細胞の生存能力に下流の影響を与える可能性があるため、動物を麻酔するためにCO2を使用しないことを好みます。腹部を消毒した後、大きなハサミや鉗子を使って腹部を開き、子宮を摘出します。ひずみに応じて、子宮には8〜14人の胎児が含まれます。

子宮を新鮮な冷解剖に入れ、中程度に清潔なペトリ皿に入れて胎児を隔離します。まず、血液と余分な組織を洗い流します。次に、子宮角から各胎児を取り出し、それらを胚嚢と胎盤から分離します。

小さなハサミを使用して、胎児を新鮮で冷たい解剖の皿に移します。中程度。冷却培地は代謝活性を低下させ、解剖顕微鏡下で派生細胞の生存率を維持します。鉗子とスプリングハサミを使用して、脊髄に沿って皮膚を切り、皮をむいて脊髄を露出させます。

Cの1つあたりと尾の始まりで脊髄を横断します。次に、脊髄を骨と軟骨の移植物をすべて慎重に取り除き、準備した各脊髄を1つの皿に集めます。新鮮な解剖培地を使用して、GRP細胞の集団が多いにもかかわらず、脊髄全体を採取します。

しかし、最終的には、GRP培地はGRP表現型を選択し、その集団はさらに最大化されます H 2 B 5 免疫 髄膜組織の異常増殖を防ぐために。その後の細胞培養では、新生児の突出した末梢神経のために、脊髄からできるだけ多くの髄膜を取り除きます。これは、抽出した大脳から髄膜組織を切除するよりも困難です。

髄膜をできるだけ多く除去したら、脊髄を20ミリメートルのシャーレに移し、解離を進めます。準備中の細胞。トリプシンのアリコートを摂氏37度の水浴中で少なくとも30分間予温します。

以下のステップは、由来する脊髄組織の生存率を高めるために迅速に行う必要があります。トリプシンとDNAを含む50ミリリットルの遠心分離チューブに脊髄を移します。次に、ピペーターで混合物を短時間三量化します。

混合物を摂氏37度で10分間インキュベートします。再度評価し、さらに10分間インキュベーションを続けます。次に、5ミリリットルのGRP培地を遠心分離機に5分間加えます。

1000 RPMで上清を吸引し、蘇生します。DNA1を含む10ミリリットルのGRP培地にペレットを懸濁します。次に、さらに10分間インキュベートし、細胞を1000 RPMで5分間ペレット

上清を吸引し、ペレットを再懸濁します。新鮮なGRP媒体で。細胞を40〜70ミクロンのセルストレーナーに通し、PLLラミニンコーティングされたT 25フラスコにプレートします。

細胞をインキュベートし、翌日、その後は隔日、または栄養素がプリーツされている場合はそれ以上の頻度で培地を100%交換します。この時点で、GRPは付着し、プロセスの拡張を開始しており、イムノパンニングを使用して最適化できます。細胞が85〜90%のコンフルエントになるか、弱くなるまで細胞を成長させ続けます。

次に、ゴム製の警官またはトリプシンを使用して細胞を採取します。Resusは、細胞を新鮮な培地に再懸濁し、3つのT 25フラスコで増殖させ、少なくとも48時間ごとに培地を交換します フラスコがコンフルエンシーに達したら、以前と同じように5ミリリットルのGRP培地に収穫します。細胞懸濁液をトライレートして塊を分解し、それらをA、2、B、5コーティングされた細菌学に移します。

ペトリ皿は、AプレートとBプレート上の細胞を室温で1時間振とうせずにインキュベートします。次に、培地を吸引し、プレートをPBSで4〜8回洗浄して、プレートへの細胞の非特異的結合に対する高い硬化性を維持します。ゴム製の警官を使う。

洗浄した細胞を2ミリリットルのGRP培地に集め、懸濁液をPLLラミナコーティングプレートまたはGRP培地入りフラスコに移します。細胞が85〜90%のコンフルエンスに達したら、黙想トリプシンを収穫し、トリプシンを8ミリリットルのGRPストック、培地で希釈して不活性化し、細胞をペレットとして収集します。T 25フラスコの細胞量を1ミリリットルのGRP凍結培地に再懸濁するか、またはT 75フラスコの細胞を2ミリリットルのGRP凍結培地に再懸濁します。

必要に応じて細胞懸濁液濃度を調整し、細胞を極低温バイアルに移し、翌日、イソプロパノールを含む極低温容器で細胞を一晩ゆっくりと凍結します。細胞を長期保存に移します。細胞は、6か月から1年後に解凍すると60〜80%の生存率になります。

生存率は、PLLラミニンコーティングの品質に大きく依存します。培養に2日後、異なる形態のプレーティング脊髄細胞が最大限に濃縮されることが観察されました。GRP集団細胞は、A、2、B、5の集団に対して選択する免疫汎である。

神経上皮細胞の汚染に問題がある場合は、最初にNCA陽性集団を排除するためのダブルイムノパンニングを行い、続いてA、2、B、5の選択を採用することができます。成熟オリゴデンドロサイトの汚染を減らすために、A T 3遊離B 27サプリメントを添加しました。精製されたGRP細胞は、その小さな体細胞と2つまたは3つの短いプロセスによって識別されました。

多くの場合、神経上皮性でGRPまたはN rpのいずれかになることができるA、B、5陰性細胞の小さな持続性集団も存在していました。幸いなことに、細胞がGRP培地に長く保持されるほど、GRP表現型を採用する可能性が高くなります。この手順の基本的な手法は、他の細胞タイプを導出するために使用でき、どの細胞が細胞補充療法により適しているか、または皮質由来のニューロンがin vitro髄鞘形成の優れたモデルになるかなどの追加の質問に答えることができます。