高速スキャンサイクリックボルタンメトリーによる線条体の脳スライスにおけるシナプス前ドーパミンのダイナミクス

本手順の全体的な目的は、スライス高速スキャンサイクリックVテレメトリの一般的なプロトコルを説明することです。まず、冠状断スライス用に脳組織を調製し、次に、目的とする個別の脳領域に電極を配置することでこれを達成します。

次のステップでは、ドパミンを検出するために、電極を通じて三角波の電圧を印加します。最後に、目的の薬理学的薬剤を脳切片に投与し、シナプス前ドパミンダイナミクスへの影響を観察します。最終的に、このプロトコルでは、高速スキャンサイクリックボルタンメトリーを用いて、刺激によるドパミン放出やドパミン再取り込み速度などのシナプス前ドパミンダイナミクスの変化を示します。

この手法はシナプス前ドパミン動態に関する知見を提供できますが、ラットやショウジョウバエなどの動物、およびセロトニンやノルエピネフリンなどの他の神経伝達物質を含む他の系にも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるFrancis Mena、MEA Khalid、およびErin ooが行います。本手順を開始するために、付属の論文に従って、スクロースACSF、ボルタメトリック記録用ACSF、および電極校正用修正ACSFの3種類の人工脳脊髄液溶液を調製します。次に、10 mLのスクロースACSFを小型ビーカーに移し、アイスバケットに入れます。続いて、瞬間接着剤（Loctite）をアイスバケットに入れます。

その後、カミソリと、ピンセット、スパチュラ、はさみなどの解剖に必要な器具をアルコールパッドで拭いて準備します。次に、マウスを断頭法により安楽死させ、速やかに脳を取り出します。取り出した脳を、氷冷したスクロース（A CSF）が入ったビーカーに約10分間浸します。

その間に、VIBRAMをスライス用に準備します。試料バスに砕氷を入れます。次に、試料チャンバーをVibramにセットし、しっかりと固定します。

試料チャンバーの周囲に氷を追加して隙間を埋め、チャンバー内に氷が入らないようにします。その後、洗浄済みのカミソリ刃をブレードホルダーに装着します。次に、試料チャンバーに氷冷したsucrose A CSFを満たします。

続いて、裏返したペトリ皿の上に置いたペーパータオルの上に、冷やしたsucrose A CSFを少量注ぎます。ピンセットを用いて、摘出したばかりのマウス脳をその上に移します。次に、カミソリで内側外側軸に沿って切断し、小脳を取り除きます。

これにより、バイブラムステージに固定可能な平坦な底面が形成されます。次に、試料ステージにLoctite接着剤を1滴滴下します。準備した脳の平坦な端をすぐにステージに固定し、できるだけ直立した状態に保ちます。

次に、ステージを検体チャンバー内に配置し、ネジを締めます。脳がチャンバー内のsucrose A CSFに完全に浸っていることを確認してください。その後、コントロールを用いてステージを調整し、カミソリの刃が脳の頂点に揃うようにします。

振動装置の最適パラメータは、周波数と速度を低く設定することで得られます。次に、スライス厚を400 micrometersに設定します。通常、最初の数枚のスライスには線条体は含まれません。

線条体を含むスライスが得られるまでスライス操作を繰り返します。stri AAL領域に達したら、絵筆を用いてスライスを持ち上げ、室温で酸素供給したCSFが入ったビーカーに移します。

通常、尾状殻・被蓋および側坐核を含む線条体複合体を含むスライスを3〜4枚得ることができます。実験を開始する前に、室温で95%O2 5%CO2をバブリングした人工脳脊髄液（A CSF）中で、スライスを少なくとも1時間順化させてください。この手順を開始するには、チューブを浸漬記録室に接続します。

その後、酸素化した室温のA CSFを1 mL/minの速度でポンプ注入します。A CSFがカスタムメイドのスライスホルダーを満たした後、温度コントローラーを32 °Cに設定します。針付きシリンジを用いて、メッシュの下にある気泡を除去します。

シリンジを用いて流出チューブ内に陰圧をかけ、緩衝液のオーバーフローを制御しながら流量を開始させます。スライスホルダーの端に、吸い取り材として機能させるためにキムワイプを配置します。その後、室温の酸素飽和A CSFで連続灌流されている記録室内のスライスホルダーに、スライスを転送します。

塩化銀参照電極をスライスホルダーに浸し、アリゲータークリップでヘッドステージに接続します。炭素繊維マイクロ電極をマイクロマニピュレーターに取り付け、アリゲータークリップでヘッドステージに接続します。次に、タングステン刺激電極と炭素繊維マイクロ電極を、塩類溶液中の脳スライス表面まで下げます。

刺激電極を用いて、スライスに単一パルスまたは複数のパルスの電気刺激を与え、神経伝達物質の放出を誘発します。高速走査サイクリックボルタンメトリー（FSCV）を用いて電気的に誘発されたドーパミンを測定するために、電極に三角波電圧を印加します。カーボンファイバーマイクロ電極の電位を-0.4 Vに保持し、そこから+1.2 Vの正の限界値までランプさせます。

その後、走査速度400 V/sで-0.4 Vまで戻します。5分ごとにスライスを刺激し、得られたドーパミンFLXの体積測定を毎回15秒間行います。これは、ピーク高さの差が10%未満と定義される、安定した電気刺激によるドーパミン放出記録を少なくとも3回得た後に行います。

薬理学的剤を含むCSFによるスライスの灌流に切り替え、流量 1 mL/min で 30 分間灌流し、ベースライン記録と同様の最大効果を得ます。薬理学的灌流の間、5 分ごとに電気刺激によるドーパミン放出を測定します。図 A は、尾状核被殻における単一パルス刺激後の FSCV を用いた電気誘発性ドーパミン放出測定の例です。

図Bは、電流-時間トレースとサイクリックボルタモグラムの両方の情報を組み合わせた3次元擬似カラープロットを示しています。同様に、図AおよびCは、それぞれ側坐核コアおよびシェルにおいて単一の電気刺激パルスにより誘発されたドーパミン放出を示しており、側坐核コアおよびシェルの3次元擬似カラープロットは、それぞれ図BおよびDに示されています。ここでは、スライスを薬理学的薬剤で30分間処理した後、単一パルス刺激を用いて尾状 putsmen（尾状線条体）におけるドーパミン放出を誘発した際の代表的なトレースを示しています。

本実験で使用する薬剤は、キノール、メタンフェタミン、および脳由来神経栄養因子です。このビデオを視聴することで、高速光走査線顕微鏡およびテレメトリーを用いて、シナプス前ドーパミンダイナミクスの取得および測定を行うためのマウス脳冠状断スライスの調製方法について十分に理解することができます。