内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

この手順の全体的な目標は、in vivo でマウス皮質の微小領域組織低酸素症を直接視覚化することです。これは、最初に麻酔をかけたマウスで開いた頭蓋骨の頭蓋窓を準備することによって達成されます。次に、蛍光色素を静脈内注射して脳血管を標識します。

最後に、固有のNADH蛍光と蛍光標識された皮質微小血管系の光子イメージングと同時に実行されます。最終的には、ニコチンアミドの還元型であるアデニンジヌクレオチドの存在を視覚化することにより、脳実質の微小領域で機能的低酸素症を示す結果を得ることができます。クラークスタイルの電極などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、広い視野にわたって高い特殊分解能を提供し、侵襲性も低いことです。

この方法は、2つの蛍光チャンネルを備えた標準適用2枚の写真システムで実施できます。こんにちは、私はスティーブ・ハースト、ロチェスター大学の微生物学および免疫学の教授兼議長で、今日の手順を実証するのは、キシュカ研究所のアニタの息子であり、私の研究室の研究助教授であるオクサナ・ポールカ博士は、NADHイメージング技術の先駆者であり、最近ドイツに移住したため、今日はここにいません。70%エタノールでオートクレーブまたは消毒し、マウスを5%isofフッ素で麻酔した必要な器具で手術部位を準備した後、それを加熱パッドに置き、フェイスマスクを適用して空気中に1.3〜1.5%isofのフッ素を送達します。

尻尾をつまむことで麻酔のレベルを確認します。次に、直腸プローブを挿入し、手順全体を通して動物の体温を継続的に測定します。マウスの目に人工涙液ジェルを塗布して、目が乾燥するのを防ぎます。

その後、頭から髪の毛を取り除き、両太ももに毛髪除去剤を2分間塗って残りの髪の毛を取り除き、太ももを酸素濃度測定に使用します。最後に、10%ポビドンヨード溶液と70%エタノールを使用して頭皮を消毒します。頭蓋骨の窓を作るには、はさみで頭蓋骨に甘やかされた5ミリメートルから始まります。

頭皮を切開し、1センチ進めます。皮膚を横に動かして頭蓋骨を露出させます頭蓋骨上部の膜を取り除きます。10%塩化第二鉄溶液を塗布します。

余分な溶液を拭き取り、メンブレンを45度の角度でこすり落とします。その5、ピンセット 解剖顕微鏡を使用して、関心のある領域を特定します。ヘッドプレートの窓の端の周りに急速接着剤の薄い層を塗ります。

関心領域がウィンドウに露出するようにヘッドプレートを配置し、ヘッドプレートに軽い圧力を加えます。接着剤を急速に重合するために少量の歯科用セメントを塗布します。接着剤が重合している間、10秒間保持します。

窓の端に少量のラピッドグルーを塗布して、ヘッドプレートと頭蓋骨をシールします。次に、ヘッドプレートを解剖スコープの下の動物ホルダーにねじ込みます。マイクロトルク 6 、 000 RPM のドリルセットと IRF 0 0 5 ドリルビットを使用します。

頭蓋骨とヘッドプレートから余分な接着剤をすべて取り除きます。次に、ドリルを1000RPMに設定し、ヘッドプレートの窓の内側に直径約5ミリメートルの円を描いて頭蓋骨の穴あけを開始します。非常に柔らかい鉛筆で描くように、軽いスイープ動作を使用します。

20〜30秒ごとに穴あけを停止し、圧縮空気を使用して骨粉塵を除去します。穴あけが進むと、中央の無傷の頭蓋骨の周りに巣穴が形成されます。薄い頭蓋骨を突き抜けないように注意してくださいが、この巣穴の厚さが均一であることを確認してください。

さらに、大きな血管の周りには特に注意してください。彼らは妥協すべきではなく、可能であれば、触れることさえしないでください ピンセットの片方の突起で、窓の中央にある骨を持ち上げ、窓に人工脳脊髄液を一滴垂らします。キムワイプの角を使って、人工脳脊髄液を45度の角度で優しく拭き取ります。

その5、ピンセット。窓の端に沿って損傷した硬膜の領域を見つけ、持ち上げて取り除きます。出血が発生した場合は、人工CSFを一滴垂らし、軽度の出血が止まるまで2〜3分待ちます。

次に、人工脳脊髄液に溶解した0.07%低融点エアロを10ミリリットル調製します。溶けたエアロを体温まで下げます。脳の表面から余分な人工脳脊髄液を拭き取ります。

窓にエアロを注ぎ、スライドガラスで覆います。次に、ガラスを軽く押してガラスとヘッドプレートを接触させ、エアロが固まるまで10〜20秒待ちます。ピンセットと柔らかいティッシュペーパーを使用して、ガラスカバーから余分な空気を取り除きます。

グラスの周りに少量の急速接着剤を敷き、ヘッドプレートに接着します。次に、少量の歯科用セメントを塗布して接着剤を固め、大腿静脈に注入します。動物を部分的に裏返して、左大腿部の内側を露出させます。

テープを使用して動物を固定します。この位置で、消毒用スクラブを塗布し、次に100パーセントエタノールを皮膚に塗布します。次に、膝から恥骨合成まで大腿部の内側に沿って切開します。

必要に応じて、鈍的解剖によって軟組織を分離します。.1ミリリットルの注射器に130マイクロリットルのテキサスレッドを入れます。新しい30ゲージの針を取り付け、斜めを上に保ったまま、30度の角度で慎重に曲げます。

解剖顕微鏡で針にテキサスレッド溶液を充填し、大腿静脈に針を挿入し、100マイクロリットルのテキサスレッドを注入します。針を取り外し、ガーゼで静脈を軽く押して出血を止めます。4つのOH縫合糸を使用して皮膚を閉じ、血中酸素飽和度を継続的に監視します。

以前に髪の毛を取り除いた右大腿部に酸素濃度計プローブを置きます。イメージングを開始するには、外科的に調製したマウスを顕微鏡ステージに移します。4 倍の倍率で明視野照明を使用して頭蓋窓部位の初期写真を撮り、光子アニエスへの高倍率レジストレーションの参照マップとして使用します。

10 倍の倍率を使用して、関心のある領域を拡大します。皮質層で関心のある領域を選択します。1 つまたは 2 つが時系列の記録を開始します。

画像の品質を向上させるために、平均 3 から 5 フレームを使用することをお勧めします。次に、動物が呼吸している空気に50%の窒素を追加して低酸素血症を誘発します。これにより、酸素レベルが10%になります酸素濃度計のデータを監視することにより、低酸素血症を確認します。

低酸素血症による時系列を約30秒間記録し続け、正常な酸素レベルが回復した後も記録します。血管の周りの低酸素症および酸素化された組織シリンダーの領域を検出、測定、定量化することにより、酸素分布を計算するためのデータを収集します。しわがれた組織シリンダー半径Rを決定するには、血管の中心と高NADH蛍光が検出される境界との間の距離を測定します。

データ処理方法については、書かれたプロトコルを参照してください。この図は、一過性低酸素血症の間に記録されたビデオからの同時NADHと地理画像を示しており、吸気酸素濃度が3分間で21%から10%に低下しました。実験的に誘発されたこのレベルの低酸素血症は、大脳皮質に重度の低酸素症を誘発するのに十分です。.

低酸素症は、動脈血供給から最も遠い領域で最初に緑色で示されたNADH蛍光の増加につながりました。赤で示されている皮質微小循環からの酸素拡散の観察可能な組織境界を表す、鋭いNADH組織境界に注意してください。これは、皮質の蛍光標識された微小血管を赤で、皮質の灰白質からの内部NADH蛍光を緑色で同時に示す画像で、NADH蛍光強度分布はバイナリです。

NADH蛍光が一様に低い領域と、NADH蛍光が一様に高い領域があります。黄色の線は、NADH蛍光が低い領域と高い領域の間の組織境界を表しています。これらの組織境界は、近くの微小血管と空間的な関係を示しています。

この関係は、微小血管から組織への酸素拡散によって決定されます。場合によっては、これらの組織境界の円筒形の性質またはCRO組織円柱は、青い線で示されるように直接認識できます。ここで、組織境界は、同心円状の中央血管をマスターすると円形になります。

この手法は、適切に実行すれば1.5時間で実行できます。この手順を試みるときは、浮腫による皮質表面の垂直方向の動きを防ぐために、カバーガラスを金属板に接着することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、組織の低酸素症と脳血管結合との関係などの追加の問題に対処することを目的とした機能性充血の測定などの追加の分析を実行できます。

このビデオを見れば、マウス皮質の微小な組織低酸素症を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。