Name: マウスにおけるγHV68感染の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学ぶマウスにおけるγHV68感染の測定法。プラークアッセイと感染性中心アッセイを用いて、急性期と潜伏期のウイルス量を定量化する手法を解説。マウスモデルによるγヘルペスウイルス感染のライフサイクル解析に役立つ。

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著者らは、漣サン（カリフォルニア大学、ロサンゼルス）とSeungmin黄（ワシントン大学）から技術的なアドバイスとサポートに感謝します。この作品は、バクスター財団、健康補助金の国立研究所（C.梁にR01 CA140964とR21 AI083841）によって賄われていた。

以下のプロトコルは、理論的にγHV68と同様のライフスタイルを共有する他のウイルスによる感染を評価するために使用できるマウスのγHV68の溶菌と潜伏感染サイクル、のウイルスの力価およびウイルスゲノムの負荷の調査を説明します。 1。 γHV68の増幅<ol><li> 37℃の水浴中でγHV68の凍結バイアルを解凍。 </li><li> 37℃で10cmの皿、培養感染細胞でNIH3T12または3T3細胞培養（〜50％コンフルエント）にウイルスinoculumsを追加° Cで5％CO 2。 </li><li>細胞変性効果（CPE）のための顕微鏡による文化を調べ、細胞の80％以上は、〜5日間感染後にCPE 4を示す時にメディアを収集する。ウイルスの収量を最大にするために、感染した細胞培養はすべての細胞関連γHV68を解放するために二回凍結と融解することができます。 </li><li>細胞破片を除去するために室温（RT）で5分間1000rpmで収集されたメディアを遠心。 </li><li>慎重に下部の細胞の破片に触れることなく、新しいチューブ（高速遠心分離管）に上清を移す。 </li><li> 4℃、12,000 rpmで高速遠心機は、（ソーバルSA - 600用）℃で少なくとも1.5時間のウイルス粒子を集中する。 </li><li> 10γ漂白剤の溶液中に上清を捨て、慎重に1ミリリットルの無血清DMEMでペレットを（ウイルスおよび残存細胞の破片）に再懸濁する。 1.5 mlマイクロ遠心チューブに再懸濁したペレットを移し、ボルテックスでよく混和する。 </li><li>残存細胞破片を除去し、新しいチューブに上清（ウイルスストックを）転送する最高速度で2分間遠心。これは感染の最終的なウイルスストックです。ウイルスストックの力価はプラークアッセイ（下記参照）によって決定されます。 </li></ol> 2。 γHV68とマウスの鼻腔内感染<ol><li> 1,000以上のパーティションを持つ年齢の〜6週間で、マウスに感染〜γHV68あたりのマウスの5,000プラーク形成単位（P​​FU）を。 </li><li>麻酔をかける腹腔内にケタミン/キシラジン（80 mg / mlのケタミンおよび12 ​​mg / mlのキシラジンの混合物の60μlの/マウス）の注入によるマウス。マウスのつま先をつまんで麻酔を監視します。これは通常、5〜10分かかります。マウスが完全に麻酔されていない場合、それらはウイルスをくしゃみをされます。 </li><li>マウスが完全に麻酔のときは、ゆっくりと、しかし着実に、マウスのドロップでドロップするγHV68（各鼻孔に15μl）を含むPBS中〜30μlを接種するピペットを使用してください。マウスは確かに気泡を形成しようとせずに滴を吸入されていることを確認します。 </li><li>マウスは10〜15分で回復してケージに戻す前に、マウス（例えば意識、呼吸、等）の福祉を監視することができます。動物は食物、水、および寝具の条件の病気と妥当性のために毎日チェックされます。病気、痛みや苦痛の臨床症状が進行した場合は、病因を決定するためにルーチンの診断が実施される。自分の体重の20％以上を失う動物は、最大体重減少のために記録されます。と安楽死。安楽死を実行するための最終決定は、臨床獣医師の裁量であり、主任研究者との協議を行っています。 </li></ol> 3。急性感染肺におけるウイルス力価を決定するためにプラークアッセイ<ol><li>ウイルスの感染力価はVero細胞の単層上でプラークの形成によって決定されます。 </li><li> Vero細胞/ウェル、12ウェルプレートに2.5x10 4細胞のプラークアッセイ前日に播種されています。細胞が均等に分配されるべきですし、細胞密度が30に到達する必要があります - 40％のプラークアッセイの日に。 </li><li> 0.5％（w / v）のメチルセルロース（MC）オーバーレイの培地（表1）を準備します。 </li><li>肺に急性期のウイルス力価を決定するために鼻腔感染後5-7日間γHV68感染マウスを生け贄に捧げる。安楽死のためにケタミン塩酸（80-100 mg / kgのSC、IM、IP）は、ペントバルビタールナトリウム（30〜50 mg / kgのIP）の静脈内過剰投与に続いてIM投与されます。このメソッドは、tで承認されています彼のアメリカ獣医師会。 </li><li>肺を回収し、血液細胞を除去する1 × PBSで2回すすいでください。 1mlの氷冷完全DMEM培地で肺の片側を収集し、氷上に置きます。迅速に定量PCR（下記参照）によって肺内にウイルスDNAの負荷を調べるために-80 ° Cで肺や店舗の反対側を凍結する。 </li><li> 1秒、凍結と融解3回最高速度で肺組織を均質化する組織ホモジナイザーを使用してください。サンプルを変更する際に、各ステップで70％エタノールでホモジナイザーを洗ってください。 </li><li>で10分間4℃で3,000 rpmでホモジナイズした組織を遠心上清を収集し、プラークアッセイのために新しいチューブに移す。 </li><li>渦によってプレーンDMEM 1.5 mlマイクロ遠心管に肺ホモジネート試料の希釈系列を（通常は10℃から10 -8まで）の準備。プレフィル540μLDMEMを持つチューブの適切な数と最初のチューブに60μlのホモジネートを希釈する。私は、最初のチューブから60μlをない次のもの、というように。 </li><li> 12ウェルプレートの準備ベロ単層から培地を吸引除去し、逆の順序（10 -8〜10℃から）で感染性ウイルスを含む/ウェル希釈ホモジネート液200μlをロードする。各滴定（重複の）のために2つのウェルを使用してください。 </li><li> 37℃でウイルスinoculums 1時間でVero細胞をインキュベート℃に優しくスワールプレートを15分ごとに均等に単分子層を介してウイルスを配布する。 </li><li> inoculumsを削除し、/ウェルオーバーレイ培地2ml（表1）に交換してください。 37一週間のためのプレートをインキュベート℃に</li><li>オーバーレイのメディアを削除する（完全である必要はありません）と修正/プラークアッセイの染色培地（表1）で置き換えると、室温で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li>プレートを乾燥している場合、各希釈でよく分離したプラークの数を数えます。エラーを最小限に抑えるために、10から100プラークの間に含まれている唯一の井戸がカウントされます。 </li><li> folloを使用してウイルス力価を計算する翼式：タイター（pfu / ml）を= [（プラーク/ウェルの数）/（inoculums /ウェルの量）] ×希釈率。 </li></ol> 4。潜在的に感染した脾細胞でのウイルス負荷を測定するために感染症センターのアッセイ<ol><li>ウイルス潜伏の負荷は、Vero細胞の単層上で感染症センター（IC）アッセイによって決定されます。 ICアッセイ前日に、6ウェルプレート（1シードのベロ細胞- 。我々は通常、脾臓のサンプルあたり11ウェルを使用する2.5 × 10 5細胞/ウェル、10ウェルを希釈脾細胞の懸濁液およびテストのためにもいずれかに使用されます。凍結融解後のウイルスの自発的な再活性化。 </li><li> （ - 感染後14日間12）の待ち時間が確立された後に感染したマウスを生け贄に捧げる。マウスの脾臓とプール、それらDMEMを冷やして1mlにして回収する。 </li><li>マウスの脾臓の機械的解離。 10cmのプレートに、新たに分離したマウスの脾臓を移し、2％FBS含有DMEMなどの目的の培地10mlを加える。ウェットtwoすりガラスエンドガラスmicrosc氷冷培地とオペコードのスライド。あるスライドとニック他のスライドの曇らされた最後のエッジとカプセルのフロスト側の脾臓を置きます。すべての赤い塊が粉砕されるまで、機械的に（存在する場合も、脂肪粒子を除去）は、2つのスライドの間に脾臓を解離する。 </li><li>両方のスライド上で残りの細胞を回収するDMEMでスライドを洗浄します。 </li><li> 50 mlコニカルスクリューキャップチューブにセルストレーナー（40μmのナイロンメッシュ）を通して穏やかに全体組織懸濁液を移す。フィルタリングながら10 mlのPBSと転送と脾臓のホモジネートを含む10 cmの皿を洗ってください。 </li><li> 375 × gで、単一の細胞懸濁液を10分を遠心し、上清を捨てる。既存の細胞塊を分割するために細胞ペレットをはじく。赤血球を溶解するために5ミリリットルACKバッファー（表1）を追加します。 5分間インキュベートし、375 xgで再び遠心</li><li>上清を捨て、PBSで穏やかにまだ徹底的に再サスペンドペレット、、、2％FBSを持つ。 4℃の細胞℃を保つにピペットを使用して、もしあれば、破片を取り除く。自動セルカウンター（Bio - Rad）を用いて生細胞を数える。 </li><li> 4分間375 × gでPBS -再懸濁された脾細胞をスピンダウン。上清を捨て、4 mlの完全DMEM（2 × 1 mlを、元の懸濁液のIC分析に使用される細胞を再懸濁、0.6ミリリットルのICアッセイでシリアル5倍希釈で使用される、ウイルスDNAの調製と定量PCRは0.4 mlのと1 mlの懸濁液）を3回の凍結融解サイクル後の潜伏ウイルスの自然再活性化を評価するために使用されます。 </li><li>重複の脾細胞懸濁液のシリアルを5倍希釈（すなわち1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250）を準備する。 2.4ミリリットルDMEMとプレフィル15 mlコニカルチューブを、最初のチューブに600μlの脾細胞懸濁液を希釈し、よく混ぜる。次管に前のチューブから600μlのを転送する、などはボルテックスしないでください！ </li><li> Vero細胞の準備を6ウェル単層から培地を吸引除去する。各希釈duplとVero細胞上に連続的に希釈した脾細胞の種子1ミリリットルicated（10ウェルを0、1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250希釈のために使用されます）。 </li><li> 37プレートを℃、5％CO 2を 8から12時間インキュベートする。 24時間を超えないようにしてください。シードされた脾細胞懸濁液を吸引除去し、各ウェルに4ミリリットルオーバーレイメディア（表1）をロードする。さらに6日間インキュベートする。 </li><li>プラークアッセイに示すように、クリスタルバイオレット0.2％（w / v）のとプレートを染色することによって脾臓感染センターのレベルを決定する。 </li></ol> 5。ウイルスゲノムの定量化<ol><li>この実験ではそのような肺と脾臓のサンプルとしてγHV68感染組織からの全ゲノムDNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってDNeasy血液および組織キット（Qiagen）を、使用してください。 </li><li>定量PCRアッセイに使用されているDNAの同じ量を確保するために各サンプルのDNA濃度を決定する。ウイルス特異的プライマーを設計する（〜200 bpのアンプリコンは、定量PCRアッセイのために好まれる）。 5＆PR：私達は（フォワードプライマーγHV68ORF56 -特異的プライマーを用いIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3'、リバースプライマー：5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3'）このアッセイおよびβ-アクチンのプライマー用（フォワードプライマー：5' - cacccacactgtggcccatcat - 3'リバースプライマー：5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3'）のような定量PCR反応の制御。 </li><li> （ - 500 ngの良い100）と2 × SYBRマスターミックス（Bio - Rad社iQはSYBRグリーンスーパーミックス）と適切なプライマーDNAサンプルを混ぜる。感染組織内のウイルス量を定量化するためのBio - Rad社製リアルタイムPCRシステムを使用してください。以下の条件でPCRを行います：15分、95の45サイクル95℃℃で30分間、60℃で30分間、および72℃のウイルスとの両方のために、曲線解析を溶融し、次いで30分、用アクチンのアンプリコン。 </li><li>ウイルスゲノムの定量化のための標準曲線を作成するには、連続して非感染細胞から単離したゲノムDNAをγHV68バクミドDNAの既知量を希釈する。感染から取り出されたDNAと並​​行して定量PCRを実行するウイルス特異的プライマーの同じセットを使用して、TEDの組織。 </li><li>アクチンの正規化後のゲノムDNAの単位当たりのウイルスDNAのコピー数（例えば100 ngのまたは500ngの）などの組織におけるウイルスゲノムの負荷を提示。 </li></ol> 6。代表的な結果： 図1は、in vivoでのマウスのγHV68感染の測定のための実験の全体的なスキームを示しています。としてプラークアッセイによって決定さγHV68、の急性感染時の肺におけるウイルス力価の代表的な結果は、図2Aで示されていた。含むγHV68の変異株、非機能的なウイルス性Bcl - 2の7日間BALB / cマウス（6 - グループあたり7匹）の鼻腔内感染後の肺の中に野生型γHV68に匹敵するレベルでの複製（VBCL - 2）。ウイルスの肺の力価には統計的に有意な差は両群間で検出されなかった。このデータは、VBCL - 2でγHV68の急性感染症のための重要な要素ではないことを示してマウス。しかし、28日間の感染後で、脾臓のVBCL - 2変異ウイルスの力価は6ドロップ - 10に - 倍などの感染中心アッセイ（図2B）によって測定されたWTに比べて、示唆しているVBCL - 2変異体γHV68ウイルス感染後の脾臓の待ち時間の維持に障害があります。削減感染中心の力価との合意では、VBCL - 2変異ウイルスのウイルスゲノムの負荷が著しく、図2Cに示すように、繰り返し実験で28日目WTウイルス、のそれに比べて減少した。感染症の潜在的な段階で潜像HV68vBcl - 2変異ウイルスの再活性化のex vivoでのウイルスゲノムの負荷と周波数の間に密接な相関関係は、この変異ウイルスの感染の待ち時間の欠陥を強調しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。プラーク形成、感染症センター、および定量PCRアッセイによるマウスのγHV68感染の測定のための模式図S. <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2 in vivoでの WTと変異γHV68ウイルスの溶菌と潜伏感染。 7解像度（日、感染後）で、BALB / cマウスの肺でWTと変異VBCL - 2γHV68ウイルスの急性複製は、（）プラークアッセイによって決定した。 （BおよびC）脾臓の感染症センター（B）及び感染マウスの脾臓におけるウイルスゲノムの負荷は、（C）はそれぞれ、感染症センターのアッセイおよび定量PCRは28 dpiで測定した。赤い線、指示値の平均。 NS、有意ではない。

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<li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

γHV68は広くヒトγ-ハイブリッド自動車2,4,5の病因を理解するモデルとして使用されています。このプロトコルでは、我々はマウスの鼻腔内接種後γHV68の急性および潜伏感染を評価するために、感染性ウイルスの力価のためのプラークアッセイ、ウイルスの潜在的な負荷のためのICアッセイ、およびウイルスゲノムの負荷の定量PCRを含む3つの日常的に使用される方法を、説明した。 プラークアッセイは、感染細胞または組織中のウイルス力価を決定するために広く使用されますが、最適な条件で使用されているウイルスによって異なりますされています。細胞単層上プラーク（可算病変）を作るためには、さまざまなウイルスの容量が異なるので、これは主です。感染後7日間 - γHV68は、通常、サルVero細胞またはそのようなNIH3T12や3T3などの培養マウス細胞の単層、6日に明らかなプラークを生成します。特に、細胞単層の年齢のようなウイルス感染の減少に対する感度やはこのように過密になり、我々通常、我々の経験で、γHV68最良の結果を示して、プラークアッセイ、のためのVero細胞のコンフルエント...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 準備の手順 </td></tr><tr><td>ウイルスのプラークアッセイ用のメチルセルロース（MC）オーバーレイ媒体</td><td><ol><li>熱〜TCボトルに蒸留水250ml&gt; 80 ° C（電子レンジで3分間沸騰）へ</li><li>溶けるまで弱火で攪拌し、加熱した水に徐々に2.5グラムMCパウダーを追加。 </li><li>液体サイクルで15分間、直ちにオートクレーブ。 </li><li> 4℃で一晩オートクレーブMCのメディアを攪拌する。 </li><li> 200ミリリットル2で250ミリリットルMCメディアを組み合わせたX MEM（ギブコ- BRL）+ 500mlのオーバーレイのメディアを与えるために50ミリリットルFBS。 </li></ol></td></tr><tr><td>プラークアッセイ用培地を修正/染色</td><td> 0.2％（w / v）の20％エタノールでクリスタルバイオレット。 </td></tr><tr><td> ACK溶解バッファー</td><td> NH 4 Clを 0.15M、KHCO 3 10mMの、EDTA 0.1mmの</td></tr><tr><td>完全DMEM </td><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS; Invitrogen社）を補充し、2mM L -グルタミン、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン（ギブコ- BRL）。 </td></tr></tbody></table> 表1。このプロトコルで使用する特定のメディア<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> K2753 </td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X1251 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M0512 - 250グラム</td></tr><tr><td> 2 × MEM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11935 </td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td>オムニ組織ホモジナイザー</td><td> OMNIインターナショナル</td><td> TH115 </td></tr><tr><td> DNeasy血液および組織キット</td><td> QIAジェン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRHグリーンスーパーミックス</td><td> BioRad社</td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96リアルタイムPCRシステム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td> Bio - Rad社</td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td>ソーバルSA - 600 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> 表2。特異的な試薬と装置

マウスにおけるγhv68感染の測定

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

γ-ヘルペスウイルスは、（γ- HVS）リンパ系細胞1の潜伏感染を確立する能力が特徴です。このようなEBVとKSHVとしてヒトγ-ハイブリッド自動車、の狭い宿主範囲は、深刻な詳細な病原性の研究を妨げている。マウスγ-ヘルペスウイルス68（γHV68）株のヒトγ-ハイブリッド自動車との広範な遺伝学的および生物学的な類似点とネズミ科齧歯類2の自然病原体です。このように、ウイルス感染のさまざまな段階でマウスのγHV68感染近交系の評価は、γ-ハイブリッド自動車の感染時にウイルスのライフサイクルと病因を理解するための重要なモデルが用意されています。 鼻腔内接種すると、肺の急性ウイルス血症のγHV68感染の結果は、後に脾細胞とホスト3,4のライフサイクル全体で再活性化することができる他の細胞、の潜伏感染に解決されている。このプロトコルでは、私たちはロバにプラークアッセイを使用する方法について説明します後鼻腔内感染（解像度）の - 早期（7日間5）でのベロ細胞単層上肺ホモジネート中の感染性ウイルスの力価。急性感染症は、主に2クリアされている間 - 3週間の感染後、γHV68の潜伏感染を14解像度の周りに確立され、後にマウスの脾臓の上に維持される。潜伏感染は通常、ウイルスが休眠状態にとどまり、その遺伝子発現のほとんどを遮断することにより、感染組織中の細胞の非常に小さな人口に影響を与えます。潜伏感染した脾細胞は、自発的にウイルスの潜在的な負荷を決定するために感染症センター（IC）アッセイによりrecapitulatedできる組織培養、にexplantingによってウイルスを再アクティブ化します。さらに急性および/または潜在的に感染した組織を、定量的リアルタイムPCRでウイルスゲノムのコピーの量を推定する（定量PCR）、その最大の感度と精度のために使用されます。定量PCRおよびプラークアッセイ、および/またはICアッセイの結果を組み合わせた解析は、ウイルス性の時空間プロファイルを明らかにする生体内での複製と感染。

γ-ヘルペスウイルス（γ- HVS）生涯その宿主に持続性を確立する。 γ- HV68とマウスの感染症は、遺伝的に扱いやすいが用意されています<em&gt; in vivoで</emγHVsのライフサイクル/病因の特性評価のための&gt;モデル。このプロトコルは、プラーク形成、感染症センター、およびqPCRアッセイによる感染後の急性および潜在的な段階でγHV68感染の検出および定量を説明します。

マウスにおけるγHV68感染の測定

$\gamma$-ヘルペスウイルス（$\gamma$-HVs）は、リンパ系細胞に潜伏感染を成立させる能力を持つことで知られている1。ヒトの...の狭い宿主範囲は...

このビデオでは、マウスへの経鼻感染後におけるヘルペスウイルスの急性感染および潜伏感染を、プラークアッセイおよび感染中心アッセイを用いて評価します。まず、生理的な曝露を模倣するため、マウスにneuron gamma herpes virus 68を経鼻投与して感染させます。5〜7日後、肺組織を採取してホモジナイズします。次に、急性期のウイルス量を測定するためにプラークアッセイを行います。潜伏期のウイルス量を測定するためには、マウスから脾臓を採取します。感染から12〜14日後に、感染したSPOC細胞の単一細胞懸濁液を作成し、感染中心アッセイを実施します。これらのアッセイの結果から、生体内におけるウイルス複製と感染性の時空間的プロファイルが明らかになります。ウイルス感染の研究に組織培養システムを用いるなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、マウスへの海洋性ガンマヘルペスウイルス感染を利用して、ガンマヘルペスウイルスのライフサイクルや病原性をin vivoで特性解析できる点にあります。まず、生後6週齢のマウスにガンマヘルペスウイルス68（gamma HV 68）を感染させます。麻酔投与から5〜10分後に、足指をつまんで反応を確認してください。マウスが完全に麻酔状態にあることを確認することが重要です。鼻腔内投与でない場合、ウイルスの投与によってマウスがくしゃみをし、正しい用量が投与されない可能性があります。次に、ピペットのチップをマウスの鼻孔に差し込み、500～2,500 plaque forming unitsのgamma HV 68を含むPBS 15 µLを、一滴ずつゆっくりと投与します。マウスに液滴を吸入させ、気泡が生じないように注意しながら、もう一方の鼻孔でも同様に繰り返します。マウスをヒーティングパッドの上に置き、10〜15分間回復させます。マウスが意識を取り戻したら、急性感染肺におけるウイルス価を測定するため、ケージに戻します。プラークアッセイは、経鼻感染から5〜7日後に行います。安楽死させたマウスから採取した肺を、冷たいPBSを入れたチューブに入れ、軽く攪拌して洗浄します。その後、PBSを除去し、この洗浄工程をもう一度繰り返します。残存する血球を除去するため、肺の一方を、1 mLの氷冷した完全DMEMを含む5 mLラウンドボトムチューブに入れます。このチューブを氷上に置き、肺のもう一方を別のチューブに入れてドライアイスとエタノールのスラリーに浸漬させます。急速冷凍します。その後、qPCRを用いて肺中のウイルスDNA量を検討するため、チューブを-80°Cで保存します。次に、氷上に置いていた組織を取り出し、最大速度で1秒間ホモジナイズします。次に、チューブをドライアイス上に10分間置いて凍結させ、その後37 °Cのウォーターバスに2分間移して融解させ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス -...

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

出典:セマン、B. G.ら グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル。J. Vis.

新生マウスの感染を被覆した発光細菌を用いたモデル化

宿主免疫応答を評価するためのマウスへのマウスヘルペスウイルス経鼻感染法

このビデオでは、マウスの百日咳菌感染に対する無細胞性百日咳ワクチンの有効性をテストするためのプロトコルについて説明します。ワクチン接種後、マウスを感染させ、その組織ホモジネートを培養して、ワクチン誘発性防御免疫の読み出しとして細菌コロニーを分析しました。...

マウスモデルにおける細菌感染に対するワクチン誘導性免疫の評価

我々は、ヒトのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、およびエプスタイン-バーウイルス（EBV）に密接に関連しているモデルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス68（γHV68）に感染したマウスにおける抗ウイルスサイトカイン産生を測定するためのプロトコルを記載している。遺伝的に改変されたマウス系統およびマウス胚線維芽細胞（MEF）を利用して、我々は、in vivoおよびex vivoの両方の抗ウイルス性サイトカイン産生を評価した。レンチウイルス形質導入によるノックアウト胚性線維芽細胞における自然免疫成分の発現を「再構成」、我々はさらに、特定の自然免疫の分子を特定し、差別的な抗ウイルスサイトカイン産生を調節する重要なシグナル伝達事象を分析。...

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV...

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。...

インティリカレルナルデリバリーによるマウスにおける髄膜炎球炎血清群Cの誘導

ここでは、ヒト化マウスにおけるHIV感染のダイナミクスを研究するための3つの実験的アプローチについて説明する。最初は慢性感染イベントの研究を許可し、後者の2つは一次感染またはウイルス再活性化後の急性イベントの研究を可能にする。...

ヒト化免疫不全マウスモデルにおける慢性、急性、再活性化HIV感染

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC...

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

幹細胞移植、膣内ヒト免疫不全ウイルス暴露、液滴デジタルPCR...

膣内HIV曝露とHIV感染治療に対するヒト化NOGマウス

学ぶマウスにおけるγHV68感染の測定法。プラークアッセイと感染性中心アッセイを用いて、急性期と潜伏期のウイルス量を定量化する手法を解説。マウスモデルによるγヘルペスウイルス感染のライフサイクル解析に役立つ。

マウスにおけるγHV68感染の測定

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