複合ゲノミクス、メタボロミクスと情報を介した植物遺伝子の機能注釈

本実験の全般的な目的は、代謝物プロファイリングと共発現解析の統合解析による遺伝子アノテーションを用いて、新規の遺伝子機能を探索し、その特性を明らかにすることです。これは、特定の代謝経路と植物種に焦点を当てた実験デザインを検討することで達成されます。第二のステップとして、検出された化合物の化学構造に基づき、代謝経路全体を構築するための解析手法を用います。

次に、予測されたパスウェイの構造を共発現解析と統合することで候補遺伝子を絞り込み、代謝の鍵となる遺伝子を推定します。最終的に、いくつかのバイオリソースを効率的に活用した最小限の実験セットを実施し、遺伝子の機能同定を行います。我々は、共発現データベース「ate」においてAbosi OIDバイオシスティック遺伝子の非常に高い相関を確認した際に、この手法を着想しました。

この戦略は、公開データベースにあるデータとバイオリソースを効率的に活用することで、新規遺伝子の機能を迅速に発見するための最も有効な方法の一つであると考えました。抽出を開始するには、植物材料を採取し、直ちに液体窒素で凍結させます。ミキサーミルを用いて植物材料を凍結粉末状にし、凍結させた植物材料を2 mLのEORチューブに分注し、チューブにメタルボールを加えます。

サンプル50 mgあたり250 µLの抽出バッファーを加えます。抽出バッファーには、標準化のための内部標準物質が含まれています。その後、ミキサーミルを用いて、凍結粉末を2分間均質化します。

25の周波数で、試料を12,000 RPMで10分間遠心分離します。次に、上清を遠心フィルターに移します。2回目の遠心分離を行った後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移します。

次に、まずカラムオーブンの温度が35 °C、サンプルトレーの温度が10 °Cであることを確認し、HPLCをセットアップします。質量分析条件を設定し、真空状態と加熱キャピラリーの状態を確認します。校正液混合物をインフュージョン注入し、MS検出器のマスオーバーチャージ校正を行います。

ソフトウェアの自動キャリブレーションアプリケーションを使用します。次に、50 µLの抽出液をガラスバイアルに移します。HPLCの場合、記述された手順に従い、最初のサンプルの分析を行う前に、抽出バッファーを少なくとも5回注入してください。

質量分析ツールの設定後、処理するデータを選択します。書面によるプロトコルに示されている化合物クラスに従って、検出された目的ピークの表を作成してください。このステップで、標準物質との共溶出によりピークを同定し、MS/MS分析、文献、サーベイ、およびメタボライトデータベース検索を用いて、検出されたピークの注釈付けを行います。

パスウェイの予測は、代謝パスウェイにおける酵素機能と関連付けることで、化学構造に基づいて行う必要があります。したがって、これらのステップは、検出された化合物の正確なピーク同定によって実施されるべきです。KEGGデータベースやPlantPACSなどの一般的な代謝パスウェイのデータベースは、目的の代謝パスウェイを予測する上で非常に有効です。

Arabidopsisのオーソログ遺伝子を含む遺伝子リストとIDを準備するために、まずゲノムデータベースから遺伝子IDリストをダウンロードします。標的植物がArabidopsis以外の場合は、オーソログ遺伝子のArabidopsis遺伝子IDを追加します。次に、目的のパスウェイに含まれる遺伝子のリストを準備します。

Arabidopsisのパスウェイデータおよび遺伝子ファミリーデータのアノテーションは、TAARウェブサイトで利用可能です。その後、Arabidopsisのオーソログ遺伝子のリストを統合することができます。準備した遺伝子IDリストを用いて、予測されるパスウェイに最適なデータベースを検索し、共発現ネットワーク解析を行います。

関心のあるパスウェイにおける既知の遺伝子ペアの相関を確認します。共発現データベースまたは遺伝子発現データベースが利用できない場合、関心のある計画において、Arabidopsisのホモログ遺伝子リストを用いてArabidopsis共発現データベースを使用する必要があります。

次に、標的共発現ネットワークの枠組みを構築します。関心のあるパスウェイにおける既知の遺伝子の接続に基づき、相関のある候補遺伝子を追加し、予測されるファミリーにおけるそれらの遺伝子アノテーションを確認して、このネットワークの接続から最適な候補を特定します。

遺伝子の係数値の閾値は、ネットワーク構造および相関遺伝子の密度に応じて調整されるべきです。次に、標的パスウェイに特異的であると絞り込める遺伝子のリストを作成します。このリストを用いて、候補遺伝子の器官特異性およびストレス応答における遺伝子発現を確認してください。

共発現解析のクエリに使用された、十分に特性解析済みの遺伝子を予測代謝経路に追加し、情報の統合を開始します。この経路の未解析部分（未解析の酵素ステップ、輸送タンパク質、転写因子を含む）が新規であるかどうかを確認するために、文献調査を行います。この時点で、これらの欠落している未解析ステップに対して、最も適切な遺伝子アノテーションを予測します。

予測されたパスウェイに基づき、メタボライトプロファイリングの結果とin silico遺伝子発現の候補遺伝子を組み合わせます。次に、遺伝子機能に従って、候補遺伝子を予測パスウェイ上に配置します。例えば、アセチル化された代謝物にはアセチルトランスフェラーゼを、配糖体にはグリコシルトランスフェラーゼを、酸化化合物にはP450を配置します。

候補遺伝子の遺伝子発現レベルと代謝物の蓄積との間で、組織特異性またはストレス応答の一貫性を確認します。また、基質の供給やストレス応答遺伝子に関わる他の代謝経路との関連性についても確認してください。最終ステップとして、ノックアウト変異体ライブラリーやフルレングス cDNA ライブラリーなどのバイオリソースを用いて、遺伝子機能を同定するための実験を行います。

以下は、アントシアニン経路の共調節ネットワーク解析の例です。共発現解析は、PXプログラムで表示されるバージョン3の追加データセットに基づいたPRAM共発現インデックスを用いて行われました。候補遺伝子の探索には、赤色のノードとして示されている12個のアントシアニン合成酵素遺伝子と2つの転写因子が使用されました。PRAMデータベースを用いたセット検索の相互接続により、68個の相関候補遺伝子と14個のクエリ遺伝子を含む共発現ネットワークが再構築され、その結果として得られたT-net出力ファイルがPXソフトウェアを用いて描画されました。

青色のノードは、アントシアニン合成遺伝子の発現後に関連性が認められた候補遺伝子を示しています。この戦略は、植物の代謝における新規の遺伝子機能を予測するための有用な手がかりとなります。