Name: 複合ゲノミクス、メタボロミクスと情報を介した植物遺伝子の機能注釈 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ、植物における複合ゲノミクスとメタボロミクスを統合した遺伝子機能注釈法。HPLCによる代謝物プロファイリングと共発現解析を組み合わせ、新規遺伝子機能を効率的に同定する手法を解説します。

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我々は、有用な議論のためのMPIMPに理研PSC博士とビョルンUsadelの教授斉藤和季に感謝します。 TTは、アレクサンダー·フォン·フンボルト財団から奨学金によってサポートされています。

<ol><li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li>
<li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMe%3A+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Silico+Biol%22%5BJournal%5D)">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li>
<li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li>
<li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li>
<li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li>
<li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlaNet%3A+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li>
<li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li>
<li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATTED-II%3A+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li>
<li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoP%3A+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li>
<li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li>
<li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana%3A+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics%3A+A+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genetic+diversity%2C+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li>
<li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, Forthcoming (2011).</li>
<li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+storage+metabolome%3A+profiling+the+barley+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li>
<li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

トランスクリプトミクスとメタボロミクス技術は数年前から使用されていることを考えると、遺伝子アノテーションを支援メタボロミクスのためのデータ統合のプロセスは、一般的に未知の代謝産物を表す新たなピークの同定から始まる。この事実は、代謝物ピークの定量的な分散、またはそれらの生合成に関与すると考え、新規の候補遺伝子を評価することで次のステージへ導く。このプロトコルで説明されて戦略は、しかし、3つの主要な問題i）のピークアノテーションの難しさ、ⅱ）経路予測の複雑性、iii）の遺伝子発現データの遺伝子情報と品質の解像度を持っています。最初の問題に対処するために、ピークの注釈は、MS n分析、参照エキス、変異体の解析、代謝物データベース検索と文献調査からの情報を活用した標準化合物又はコンビナトリアルアプローチの共溶出（ 図2、12）で行われるべきである。 sのecond問題、経路の予測は、正しいピークアノテーションによって得ることができます。代謝産物の蓄積が関連遺伝子の遺伝子発現と相関する必要があるためしかし、組織特異性の代謝物プロファイリングにも、サポートのピーク注釈することができます。したがって、異なる組織や成長条件の組み合わせのプロファイルは、この第二の問題のために役立ちます。遺伝子情報の解決に関する第三の問題は、配列データの進行状況に依存します。ゲノムシーケンスの完了せずにモデル植物の場合には、他のモデル植物でオーソログ遺伝子を用いた共発現解析に便利です。アミノ酸配列の詳細なアラインメントを比較し、系統樹解析では、他の種にモデル生物を接続するためにサポートすることができます。 このプロトコルはすべての代謝に適しています。それも強力な転写Cの対象になる特徴は、中間および二次代謝の解析における最も効率的です。ontrol 1,5,11,16。いくつかの例では、共発現解析は、硫黄同化、β-酸化のための遺伝子、分岐鎖アミノ酸の分解、クロロフィルの破壊、およびリジン異化3、細胞壁代謝10,7とカスケード14に信号を送る光の中で実行することに成功しました。複合ゲノミクス、メタボロミクスと情報を介した遺伝子機能のアノテーションは転写因子の生合成遺伝子と直接レギュレータのためだけでなく、生理的なプロセスや応答を理解するためだけではありません（例えば図3 14を参照）。 モデル植物から作物種にこのアプローチを開発するために、植物種間での代謝の比較はいくつかの一般的な代謝の強力なアプローチです。たとえば、同じ化合物は、異なる植物種で検出された場合、いくつかのオーソログ遺伝子がこれらの植物種で発見され、オーソログ遺伝子を用いてクロス種の共発現解析は、STRONを提供することができますあなたの予測のgをサポートしています。 ：このアプローチは、植物種との共発現解析（6、プラネットでは、このような大麦、米、小麦、大豆などのほか重要な作物で、ポプラ、ウマゴヤシ、シロイヌナズナで行うことができ<a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg 。/ DE</a> 、、9、COP： <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> 。の例を参照してください、15）。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>蒸留水ULC / MS卒業生</td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td>アセトニトリル（ACN）ULC / MSグレード</td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td>メタノール（MeOH）ULC / MSグレード</td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィー用ギ酸（HCOOH）ULC / MSグレード</td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td>標準化合物</td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td>リニアイオントラップ（IT）ESI-MSシステムフィニガン-LTQ </td><td>サーモフィニガン</td><td></td></tr><tr><td> HPLCシステムのサーベイ</td><td>サーモフィニガン</td><td></td></tr><tr><td> C18分析カラムのルナ（2）、2.0ミリメートルの直径150ミリメートルの長さは、100Åの細孔サイズと3mmの球状粒子</td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcaliburソフトウェア</td><td>サーモフィニガン</td><td></td></tr></tbody></table>

複合ゲノミクス、メタボロミクスと情報を介した植物遺伝子の機能注釈

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

完全なゲノム配列が利用可能であり、このようなノックアウト変異体、野生のアクセッションおよび高度な繁殖個体群として生物資源の豊富されるモデル植物種の拡大を続ける数を考えると、遺伝子機能アノテーションのための上昇の負担があります。このプロトコルでは、結合された共発現遺伝子解析、メタボロミクスと情報を用いた植物遺伝子の機能注釈が（ 図1）提供されています。このアプローチは、メタボロミクスを介してターゲット化合物の同定と、特定の代謝過程に関与する非注釈付き遺伝子の同定可能性が高い可能にするために既知の関数のターゲット遺伝子を用いての理論に基づいています。戦略が楽であるこれらのどれにもかかわらず、順方向と逆遺伝学のアプローチによって生成された集団では、この情報を適用するための前方に置かれます。当然の結果では、このアプローチは、新しいまたは特定のSEを表す未知のピークを特徴付けるためのアプローチとして使用することができます現在植物の代謝を理解する上で重要な試験である限られた組織、植物種やストレス治療のcondary代謝物。

代謝を介したゲノム、共発現遺伝子の解析と標的化合物の同定の組み合わせは、遺伝子の機能アノテーションを付与します。

完全なゲノム配列が利用可能なモデル植物種の数が絶えず増加し、...などのバイオリソースが豊富に存在する状況において、

本実験の全般的な目的は、代謝物プロファイリングと共発現解析の統合解析による遺伝子アノテーションを用いて、新規の遺伝子機能を探索し、その特性を明らかにすることです。これは、特定の代謝経路と植物種に焦点を当てた実験デザインを検討することで達成されます。第二のステップとして、検出された化合物の化学構造に基づき、代謝経路全体を構築するための解析手法を用います。次に、予測されたパスウェイの構造を共発現解析と統合することで候補遺伝子を絞り込み、代謝の鍵となる遺伝子を推定します。最終的に、いくつかのバイオリソースを効率的に活用した最小限の実験セットを実施し、遺伝子の機能同定を行います。我々は、共発現データベース「ate」においてAbosi OIDバイオシスティック遺伝子の非常に高い相関を確認した際に、この手法を着想しました。この戦略は、公開データベースにあるデータとバイオリソースを効率的に活用することで、新規遺伝子の機能を迅速に発見するための最も有効な方法の一つであると考えました。抽出を開始するには、植物材料を採取し、直ちに液体窒素で凍結させます。ミキサーミルを用いて植物材料を凍結粉末状にし、凍結させた植物材料を2 mLのEORチューブに分注し、チューブにメタルボールを加えます。サンプル50 mgあたり250 µLの抽出バッファーを加えます。抽出バッファーには、標準化のための内部標準物質が含まれています。その後、ミキサーミルを用いて、凍結粉末を2分間均質化します。25の周波数で、試料を12,000 RPMで10分間遠心分離します。次に、上清を遠心フィルターに移します。2回目の遠心分離を行った後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移します。次に、まずカラムオーブンの温度が35 °C、サンプルトレーの温度が10 °Cであることを確認し、HPLCをセットアップします。質量分析条件を設定し、真空状態と加熱キャピラリーの状態を確認します。校正液混合物をインフュージョン注入し、MS検出器のマスオーバーチャージ校正を行います。ソフトウェアの自動キャリブレーションアプリケーションを使用します。次に、50 µLの抽出液をガラスバイアルに移します。HPLCの場合、記述された手順に従い、最初のサンプルの分析を行う前に、抽出バッファーを少なくとも5回注入してください。質量分析ツールの設定後、処理するデータを選択します。書面によるプロトコルに示されている化合物クラスに従って、検出された目的ピークの表を作成してください。このステップで、標準物質との共溶出によりピークを同定し、MS/MS分析、文献、サーベイ、およびメタボライトデータベース検索を用いて、検出されたピークの注釈付けを行います。パスウェイの予測は、代謝パスウェイにおける酵素機能と関連付けることで、化学構造に基づいて行う必要があります。したがって、これらのステップは、検出された化合物の正確なピーク同定によって実施されるべきです。KEGGデータベースやPlantPACSなどの一般的な代謝パスウェイのデータベースは、目的の代謝パスウェイを予測する上で非常に有効です。Arabidopsisのオーソログ遺伝子を含む遺伝子リストとIDを準備するために、まずゲノムデータベースから遺伝子IDリストをダウンロードします。標的植物がArabidopsis以外の場合は、オーソログ遺伝子のArabidopsis遺伝子IDを追加します。次に、目的のパスウェイに含まれる遺伝子のリストを準備します。Arabidopsisのパスウェイデータおよび遺伝子ファミリーデータのアノテーションは、TAARウェブサイトで利用可能です。その後、Arabidopsisのオーソログ遺伝子のリストを統合することができます。準備した遺伝子IDリストを用いて、予測されるパスウェイに最適なデータベースを検索し、共発現ネットワーク解析を行います。関心のあるパスウェイにおける既知の遺伝子ペアの相関を確認します。共発現データベースまたは遺伝子発現データベースが利用できない場合、関心のある計画において、Arabidopsisのホモログ遺伝子リストを用いてArabidopsis共発現データベースを使用する必要があります。次に、標的共発現ネットワークの枠組みを構築します。関心のあるパスウェイにおける既知の遺伝子の接続に基づき、相関のある候補遺伝子を追加し、予測されるファミリーにおけるそれらの遺伝子アノテーションを確認して、このネットワークの接続から最適な候補を特定します。遺伝子の係数値の閾値は、ネットワーク構造および相関遺伝子の密度に応じて調整されるべきです。次に、標的パスウェイに特異的であると絞り込める遺伝子のリストを作成します。このリストを用いて、候補遺伝子の器官特異性およびストレス応答における遺伝子発現を確認してください。共発現解析のクエリに使用された、十分に特性解析済みの遺伝子を予測代謝経路に追加し、情報の統合を開始します。この経路の未解析部分（未解析の酵素ステップ、輸送タンパク質、転写因子を含む）が新規であるかどうかを確認するために、文献調査を行います。この時点で、これらの欠落している未解析ステップに対して、最も適切な遺伝子アノテーションを予測します。予測されたパスウェイに基づき、メタボライトプロファイリングの結果とin silico遺伝子発現の候補遺伝子を組み合わせます。次に、遺伝子機能に従って、候補遺伝子を予測パスウェイ上に配置します。例えば、アセチル化された代謝物にはアセチルトランスフェラーゼを、配糖体にはグリコシルトランスフェラーゼを、酸化化合物にはP450を配置します。候補遺伝子の遺伝子発現レベルと代謝物の蓄積との間で、組織特異性またはストレス応答の一貫性を確認します。また、基質の供給やストレス応答遺伝子に関わる他の代謝経路との関連性についても確認してください。最終ステップとして、ノックアウト変異体ライブラリーやフルレングス cDNA ライブラリーなどのバイオリソースを用いて、遺伝子機能を同定するための実験を行います。以下は、アントシアニン経路の共調節ネットワーク解析の例です。共発現解析は、PXプログラムで表示されるバージョン3の追加データセットに基づいたPRAM共発現インデックスを用いて行われました。候補遺伝子の探索には、赤色のノードとして示されている12個のアントシアニン合成酵素遺伝子と2つの転写因子が使用されました。PRAMデータベースを用いたセット検索の相互接続により、68個の相関候補遺伝子と14個のクエリ遺伝子を含む共発現ネットワークが再構築され、その結果として得られたT-net出力ファイルがPXソフトウェアを用いて描画されました。青色のノードは、アントシアニン合成遺伝子の発現後に関連性が認められた候補遺伝子を示しています。この戦略は、植物の代謝における新規の遺伝子機能を予測するための有用な手がかりとなります。

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JoVE Journal

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生物学

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グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

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