Name: 2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ2光子顕微鏡を用いたマウス胸腺の生体内イメージング手法。T細胞発生におけるタイムサイトの動態と相互作用を観察し、免疫学研究に有用なプロトコルを確立する方法です。

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我々は、Foxp3 - KI GFP / GFPの親切な寄付のために我々の動物ホルダーと加熱パッドと博士ビジェイK. Kuchrooを構築するためにロジスティックのヘルプはこの原稿の批判的検討、博士ヌーノモレノのためにデビッドオリビエリに感謝しますマウス。この作品は、&quot;FundaçãoパラCiênciaのe Tecnologia&quot;（FCT、ポルトガル）、助成金＃PTDC/EBB-BIO/115514/2009によってサポートされています。

1。動物の準備重要な注意事項：BM細胞懸濁液および胸腺移植は無菌条件下で行った。胸腺移植が私たちの動物施設内にある手術室で行われている間BM懸濁液は、私たちの細胞培養室のフードの内側を調製した。これらの無菌状態を維持し、保証するために、我々はこれらの場所で私たちのビデオを記録することはできませんでした。しかし、全ての手術材料はオートクレーブと外科ベンチは、以前はVirkon（Pharmacal研究所（株））および70％エタノールで洗浄した。すべての手順は、動物実験によって承認され、委員会（IACUC）を使用して、彼らはヨーロッパの実験動物学協会（FELASA）ディレクティブの連盟との合意にであった。承認ID番号がAO10/2010です。すべての画像実験では、ターミナルの手順だったと動物は、画像の終わりの直後に安楽死させ、買収。 詳細な手順は次の通りです： <ol><li>照射（γ-照射装置付き）骨髄（BM）の内部に内因性造血前駆細胞を破壊するために900ラドを8週齢のヌードマウス。あなたが静脈内注射、さらにBM再構築のためにドナー骨髄細胞を調製するまで照射した後、それらのケージに動物を返します。このBMの転送は、照射1時間後に実施した。 </li><li> BMドナー動物を区切ります。つの動物の後肢の脛骨と大腿骨は、一般的に最大3レシピエント動物に再構成するのに十分です。 CO 2で安楽死した後、後肢を削除してから、骨から皮膚と筋肉を取り除く。 </li><li>各骨の閉鎖端をカットし、PBSでそれをフラッシュ（またはRPMI）またはBMを削除するにはPBSを2ml（またはRPMI）で、乳棒を用いて、すり鉢ですべてを押しつぶす。 </li><li>活発な吸引USIの繰り返しによる単一細胞懸濁液中にBM構造を混乱させるP1000ピペットNG。別の方法としては、21G注射針を通して何度もBMを渡すことができます。遠心（400グラム、5分、RT）は、PBSで細胞を再サスペンドし、ヌード照射レシピエントに静脈内注入する。我々の実験で我々はすべての制御性T細胞（Treg）はGFP 1を発現するFoxp3を- KI GFP / GFPマウス由来の BM使用。 </li><li>非BM -再構成された動物は14日以上生き残ることができないので、ドナーBMの受け入れは、転送後の最初の日で発生します。しかし、1つはすべてBMコンパートメントの完全な回復を可能にするために4〜6週間待つ必要があります。 Bactrim（ロシュ）は、細菌感染症のリスクを減少させるために照射後の最初の週の間に水（2 mg / mlの）に追加されました。 </li><li>胚性胸腺移植は、既に2を説明されました。簡単に言えば、同質遺伝子マウスの繁殖ペアを起動し、プラグ（性交の証拠）毎日チェックしてください。 pregnの15日目の別のプラグインの女性とCO 2安楽死、それらアンシー（プラグの観察は、妊娠の1日目です）。胚および胸腺を削除します。転送されるまで冷PBSで胚性胸腺を置きます。 </li><li>胸腺移植を実行するには、ケタミン（マウスの体重の120μg/ gの）/キシラジンで麻酔BM -受信者ヌードマウス（マウスの体重の16μg/ gの）と37℃で加熱パッドの上にそれらを保つ° Cが得られるまで意識不明。 </li><li>外科的に胸腺の移植を実行するために腎臓を公開。最初ChloraPrep（Carefusion社）および70％エタノールで肌をスクラブ。その後、動物の背側体の部分の皮膚をカット1 cmの2ミリメートル怒鳴る最後の胸部肋骨を行います。 </li><li>腹腔をカットし、この空洞の腎臓を引き出します。手術用メスの刃と腎被膜の小さな表面的なカットを行います。非常に薄いチップで鉗子を使用すると、レシピエントマウスの腎被膜下に袋を作り、このポーチに4胸腺葉まで追加。 </li><li>腎臓bを置くその代わりにACK、1つまたは2つのステッチで腹腔を縫合し、次に同じ縫合法を使用してマウスの皮膚を閉じます。また、縫合糸は、外科的接着剤を使用して行うことができます。 </li><li>皮下右動物の苦痛を避けるために、彼らは麻酔から回復し始めるまで加熱パッドで動物を維持するために手術を終えて（5 mg / kgでブトルファノール）鎮痛剤注入。マウスは、糸を除去するから、ケージメイトを防ぐために、移植後最初の3日間は個別にケージに入れています。 1週間後に抜糸する。 </li><li>ヌードマウスはT細胞を持っていない。したがって、血中のCD4 +またはCD8 + T細胞の割合を監視することにより、胸腺移植の受け入れを評価することができます。週一回、胸腺移植後2週間、動物の出血、抗CD4、抗CD8モノクローナル抗体（MAb）と血に染まる。 CD4する場合：CD8比は約2:1である、移植胸腺は（図1）完全に機能します。 </li></ol>"&gt; 2。生体内画像取得あなたが事前に必要とそれらを脇に置くすべての材料を準備します。 <ol><li>ケタミン/キシラジン（項目1.5で説明したのと同じ用量）と37℃の加熱パッドの上にそれらを配置℃で動物を麻酔血流の未来の可視化を可能にするために静脈内ローダミンBイソチオシアネート - デキストラン（PBS中20 mg / mlの）の100μlを注入する。 </li><li>以前の項目1.6に記載されたプロトコールにしたがって移植胸腺を含む腎臓を公開。 </li><li>元の位置に戻ってから腎臓を防止するために、針で皮膚の切開の側面を閉じます。 </li><li>それは湿った保つために臓器の上にPBSに浸した綿のピースを置きます。 </li><li>動物ホルダーの段階（図2A）の上に加温パッドを置く。 </li><li>動物の所有者、オルガンの上（図2B）に加熱パッドの上に動物を置く。 </li><li>クランプmで、両側で臓器をつまんで薄いアルミ箔のADE（図2C）。 </li><li>動物のホルダーを閉じて、できるだけ近いあなたの組織（図2D）にトップヒータープローブを置きます。このヒータープローブは常に臓器の温度を測定し、37℃でそれを維持し、電流を調整するヒーターには、この情報を送信します</li><li> PBSに浸した綿を取り出して、℃のあなたの準備の上に30℃の低融点アガロースを（PBS中2％）に追加します。 </li><li>上部ヒーター（図2E）と製剤全体をカバーしています。このヒーターの絞りで客観的な（図2F）からアガロースを隔離カバーガラスがあります。マウスの麻酔を監視し、すべての40分をブーストハーフ用量を注入する。画像取得後、CO 2で動物を安楽死させる。 </li></ol> 注：アルミホイルのクリップと上部ヒーターの写真を図3に示されている。 3。二光子イメージング買収私たちは、直立"プレーリーアルティマXY"二光子顕微鏡を使用。我々のシステムは、Tiが搭載されています：サファイアレーザー、同時最大4チャンネルの買収のための4つの最上位光電子増倍管と20倍の水浸対物レンズを。 <ol><li>チタンをオンにする：サファイアレーザーと全体の顕微鏡システムを。 </li><li>所望の波長に応じてダイクロイックミラーとフィルターセットを追加。我々のケースでは565 nmのダイクロイックミラーを含むオリンパス- BX2クロマホルダー、一50分の525 nmフィルター（Foxp3を- GFPの信号用）、および1 50分の595 nmフィルターを（血管の内側デキストラン-ローダミン- B信号の使用）。使用するレーザーの波長範囲は880から900nmの間であった。 </li><li>顕微鏡に動物のホルダーを追加し、接続して、すべてのヒーターをオンに、慎重に水の中に目標を下げて、容器または一部GFP - Tregsのに焦点を当て、上部ヒーター開口部に水を加える。 </li><li>顕微鏡でのx、y、zの外部コントロールは、迅速に領域を見つけるために組織を調査興味のある。 </li><li>色分解を最適化し、背景の上に十分な信号を達成するために必要なレーザーの量を最小限に抑えるために光電子増倍管のゲインを調整します。あなたの組織の光損傷を避けるために、レーザーの最小量を使用するようにしてください。 </li><li>興味の領域が特定されると、タイムラプスイメージングを開始する。私たちのケースでは、典型的な5D（X、Y、Z、T、および色）買収のプロトコルは4.0μm、Z -手順、xと140μmのyの長さに分け、50μmの深さの組織ボリュームの連続した​​画像を取得で構成されていますそれぞれ。各ボリュームには、取得するのに30秒かかります。したがって、60の買収は、画像取得の約30分を実行します。 </li><li>機関のサーバーにデータを転送し、多次元のレンダリングとセルのトラッキングを実行するにはImageJの、Imaris、またはVolocityソフトウェアを使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果 g1.jpg"/&gt; 図1。 。胚の胸腺の受け入れと機能は、BM回復した後、胚の胸腺は、BM再構成された動物に移植し、2週間胸腺移植後に、これらのマウスは、抗CD4または抗- CD8を染色することによってT細胞のサブタイプの割合を監視するために、週に一度採血したモノクローナル抗体。我々は、胸腺が正常CD4を持つ動物に受け入れられたとみなさ：1.5-2.0:1周りCD8比（）。その機能を確認するために、我々はいくつかの胸腺移植動物を屠殺し、WTマウス（B）と異なる胸腺細胞亜集団の割合を比較した。ダブルネガティブ（DN; - CD8 - CD4胸腺細胞）の割合サブポピュレーション（抗CD25および抗CD44モノクローナル抗体で染色することによって）、ダブルポジティブ（DP、CD4 +がCD8 +胸腺細胞）と、シングルポジティブ（SP）CD4 +またはCD8 +胸腺細胞、これらの動物間で類似していた。 ig2.jpg"/&gt; 図2。アニマルホルダアセンブリ。深く麻酔した後、動物は、以前は動物ホルダーのステージ（）の上部に取り付けられた、加熱パッドの上に置かれます。移植胸腺を含む腎臓は、（B）上を向いている。アルミ箔のクランプは、繊細にその場所で保つために全体の腎臓（C）をつまみ。図。 1Cの挿入は、詳細にクランプを示しています。動物のホルダーの上部は場所（D）に置かれます。 PBSに浸した綿は暖かい低融点アガロースで置き換えオルガンの上、から削除され、上部ヒーターは（E）が追加されます。最後に、全体のアセンブリは、ここでの目的（F）で表される、顕微鏡に転送されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。ホルダー部分の詳細。これらの写真は、腎臓を保持しているアルミ箔のクランプを（）（B）を示す。移植胸腺が配置されている地域にも注意してください。これは、約領域を示しています胸腺カプセルをカットし、胚の胸腺を入れるポケットを作るために。トップヒーターのカバーガラス（C）はその底の部分（D）へのシリコーン接着剤で固定した。 ムービー1。酸素と温度の生理的なレベル（37℃）が全体のプロセス中に保持された胸腺内のFoxp3を- GFP +胸腺細胞の生体内イメージング。血流とTregsのの動きに注意してください。これらの速度を測定し、公表データと比較することができます。 <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">ムービーを表示するにはここをクリック。</a> 映画（2）の画像を30で取得された胸腺内部の制御性Tの生体内イメージング℃に血流の維持にもかかわらず、動きと細胞の丸い形がないことに注意してください。 <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">ムービーを表示するにはここをクリック。</a>

<ol><li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li>
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<li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li>
<li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

本稿では、生きている動物内の胸腺細胞の二光子励起イメージングのための手順を示した。我々はまた、血流の継続と撮像法の間に臓器の温度のメンテナンスとして、1つは注意深く制御する必要のあるいくつかのパラメータを説明した。それにもかかわらず、臓器を安定に保つために慎重な努力にもかかわらず、そのような&quot;臓器漂流&quot;のようなモーションアーチファクトが発生する可能性があります。後部画像補正は、この目的のために特別に設計されたアルゴリズムの開発によって行うことができます。さらに画像解析には、エラーを最小限にしようと新しいプロトコルの開発の源である可能性があります。 胸腺は、すべてのT細胞が産生される器官であると、したがって、その免疫がγδの世代を理解することに興味がある臓器、CD4、またはCD8 T細胞は、彼らの注意を焦点を当てます。 T細胞に関するほとんどの研究は、これらのC言語の数字の違いおよび/または安定性に基づいています。in vitroで/ in vivoでの操作で別の後にells。しかし、唯一のin vivoで可視化した後、我々は、恒常性3-7を維持に伴う免疫系の細胞との相互作用を観察できる。従って、胸腺細胞のin vivoでの観察に優れたT細胞生物学を理解することがおそらく最も重要な情報が欠落しての一つです。生体内TPMは、T細胞の動きとの相互作用の詳細な画像を提供し、我々は、それが詳細な胸腺細胞の研究のために使用する方法をここに示しています。しかし、すべての技法には制限があります。生体内イメージング買収は体内の細胞の振る舞いを反映するための最も正確なシステムですが、それは臓器の植画像取得が少ない労力で、免疫システム8,9に関する重要な情報を収集するために使用されていることも事実である。さらに、1つは、生体内イメージング法は、麻酔動物での組織や血管を露出させる手術を必​​要と否定することはできませんそれ自体はこれは、全臓器生理学10の変化を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、開発されている外科手術11および新しい方法に起因するアーティファクトを廃止し非侵襲的な方法がありますそれより12を使用される動物は、事前に準備する。したがって、新しい外科的処置と通行料が最小化またはバイパス生体内イメージング買収の実際の制限をし、より多くの科学コミュニティにアクセスできるようになります。 我々は我々が説明した方法は実現可能であり、それは我々が使用していることを、in vivoでの全身操作、そのような薬剤投与にすべて報告していることを実証している。従って、我々は、胸腺細胞の開発に関する更なる研究を補完し、強化するためにすでに利用可能なex vivoでのテクニックと一緒に、このメソッドの使用方法を示唆している。

<table border="1"><thead><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr></thead><tbody><tr><td>ローダミンB ishothiocyanate -デキストラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R9379 </td><td> 20 mg / mlのに在庫を準備</td></tr><tr><td>二光子顕微鏡</td><td>プレーリーテクノロジーズ株式会社</td><td>プレーリーウルティマXY </td><td></td></tr><tr><td>チタン：サファイアレーザー</td><td>コヒーレント社</td><td>カメレオンウルトラファミリー</td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA液浸対物レンズ</td><td>オリンパス（株） </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td>ホルダー（フィルター/ダイクロイック） </td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 91018 BX2（U - MF2） </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50フィルター</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50フィルター</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nmのダイクロイック</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imarisソフトウェア</td><td>ビットプレーンAG社</td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td>パーキンエルマー社</td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJの</td><td> NIH、米国</td><td> ImageJの</td><td></td></tr></tbody></table>

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

二光子顕微鏡（TPM）は、組織や器官の奥深くの領域での画像取り込みを提供します。新しい定位ツールや外科的手技の開発と組み合わせることで、TPMは、臓器内部の&quot;ニッチ&quot;を特定し、生きた動物で細胞の&quot;振る舞い&quot;を文書化する強力なテクニックになります。生体内イメージングが最高の臓器内に実際の細胞挙動のような情報を提供していますが、それは多くの手間と技術的に代替のex vivoイメージングの買収よりも、必要な機器/手続きの面で厳しいの両方です。従って、我々は外科手術と私たちは胸腺内でのFoxp3 +細胞の移動を追跡することができる小説&quot;定位&quot;オルガンホルダーを説明します。 Foxp3は制御性T細胞（Treg）の世代のためのマスターレギュレータです。すなわち：また、これらの細胞は、その起源に応じて分類することができます。胸腺分化制御性T Oとして、（nTregs）&quot;天然に存在する制御性T&quot;と呼ばれています末梢変換Tregsの（pTregs）にpposed。研究のかなりの量がこれらのT細胞の表現型と生理学に関する文献で ​​報告されているが、ほとんどは他の細胞とのin vivo相互作用について知られている。この欠陥は、そのような観測を可能にする技法の欠如に起因する可能性があります。このホワイトペーパーで説明されているプロトコルは、このような状況のための救済策を提供します。 我々のプロトコルは、胸腺上皮細胞を含むいくつかの上皮細胞の分化を損なうDNA配列の厳守変異を持っているので、内因性の胸腺を欠くヌードマウスを用いて構成されています。ヌードマウスは、ガンマ線照射されたとFoxp3 - KI GFP / GFPマウスから骨の髄（BM）で再構成。 BMの回復（6週間）の後、各動物は、腎被膜の内部に胚性胸腺移植を受けた。胸腺受け入れ（6週間）の後、動物を麻酔し、腎臓が含む移植胸腺は、露出して私たちの臓器のホルダーで固定されており、TPMによるin vivoイメージングのための生理的条件下で維持した。我々は、制御性T細胞の発生における薬物の影響を研究するためにこのアプローチを使用している。

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で&quot;ニッチ&quot;の同定に役立つはずです。

2光子顕微鏡法（TPM）は、組織や臓器の深部における画像取得を可能にします。新しい定位固定装置の開発と組み合わせることで...

2光子顕微鏡を用いることで、器官の深部における画像取得が可能になります。2光子顕微鏡における蛍光タンパク質の励起は、ほぼ等しいエネルギーを持つ2つの光子が分子と相互作用した際に、2倍のエネルギーを持つ単一の光子を吸収したのと同等の励起が起こることで達成されます。そのため、2光子顕微鏡では赤外線レーザーが使用され、厚い組織での画像取得が可能となり、光退色や光損傷を最小限に抑えることができます。また、励起が焦点面に限定されるため、焦点外の蛍光が発生しません。新しい定位手術ツールおよび手術手順と組み合わせることで、生体動物内の細胞挙動を記録するための強力な手法となります。本論文では、2光子顕微鏡を用いて胸腺の生体内画像を取得しました。この器官ではT細胞の成熟が行われるため、本手法は胸腺細胞の発達に関する研究に有用です。それでは、プロトコルを開始します。まず、動物の準備として、8週齢のヌードマウスに900 radsを照射します。照射後、骨髄移植を行うまで動物をケージに戻します。骨髄懸濁液を調製するため、ドナーマウスを二酸化炭素で安楽死させ、後肢を摘出した後、骨から皮膚と筋肉を取り除き、PBS中で保持します。骨をPBSを含む新しいペトリ皿に移します。骨の両端を切断します。シリンジにPBSを満たし、25ゲージの針を用いて骨を洗浄します。あるいは、骨を乳鉢に移して乳棒で砕き、激しいピペッティングで骨髄を均質化した後、400 Gで5分間遠心分離し、再懸濁します。細胞をPBSに懸濁し、放射線を照射したマウスに静脈内注射します。移植後数日で、ある種の軟骨髄が生じます。10 plまで再構成されない場合、マウスは放射線照射の10日後に死亡し始めます。しかしながら、動物が完全に再構成されたとみなすには、6〜8週間待ちます。動物の調製を継続するため、骨髄移植から4〜6週間後に胚性胸腺移植を行い、生体内で胸腺細胞を観察できるようにします。まず、二酸化炭素で妊娠15日の雌マウスを安楽死させ、胚を採取した後、各胚から胸腺を取り出し、使用時まで冷PBSを入れたプレートに保存します。次に、受容動物をケタミンとキシラジンで麻酔し、ヒーティングパッドの上に保持します。動物が深く麻酔されたら、患部をエタノールで洗浄します。皮膚を切開し、腹膜を切断して、腎臓を特定し露出させます。腎臓を露出させたら、腎被膜に小さな切開を加え、その下にポケットを作成します。このポケットの中に胚性胸腺を挿入します。最後に、腎臓を元の位置に戻し、腹腔と皮膚を閉鎖します。縫合後、動物に鎮痛剤を投与し、麻酔から回復し始めるまでヒートパッドの上に置きます。CD4陽性細胞とCD8陽性細胞の比率は、毎週の血液サンプル分析によって追跡できます。比率が1.5付近の動物は、胸腺を拒絶せず受け入れたことが認められました。移植された胸腺における胸腺細胞集団の割合は、対照群の動物の内在性胸腺に見られる割合と同等です。移植胸腺の生体内イメージングには、新たな動物手術と当研究室の動物ホルダーデバイスの使用が必要となります。まず、ケタミン、キシラジン、および麻酔剤を投与します。動物が意識を失った後、加熱パッドの上に置き、静脈内に Rodin b isothiocyanate dextran を注入して、後で組織内の血流を観察できるようにします。皮膚と腹腔を開き、移植された胸腺を含む腎臓を露出させ、腎臓が元の位置に戻るのを防ぎます。皮膚切開部の外側を縫合して閉じます。動物を動物ホルダーステージ上のヒートパッドに移動させます。腎臓の両端をつまみます。アルミホイル製のクランプを使用します。アニマルホルダーを閉じ、上部ヒーターを設置します。プローブを組織にできるだけ近づけてください。準備した試料の上に低融点アガロースを添加します。試料全体をトップヒーターで覆います。麻酔状態をモニタリングし、40分ごとに麻酔剤を追加投与してください。手術終了後、セットアップ全体を2光子顕微鏡に移し、さらなる画像取得を行います。本研究では、サファイアレーザー、4つのトップPMT、および20 x水浸対物レンズを備えたPrairie Ultima 2光子顕微鏡を使用しました。まず、レーザーと顕微鏡の電源を入れます。次に、目的の波長に合わせてRICミラーとフィルターセットを取り付けます。動物を顕微鏡にセットしてください。すべてのヒーターパッドをコントローラーに接続します。上部ヒーターの開口部に水を加え、対物レンズを慎重に水の中へ下げます。XYおよびZ外部コントローラーを使用して、血管またはGFPT領域に焦点を合わせます。迅速に関心領域を特定してください。PMTのゲインを調整して色の分離を最適化し、バックグラウンドに対して十分な信号を得るために必要なレーザー出力を最小限に抑えます。関心領域を特定したら、基本セットアップを用いて、深さ 50 µm の組織ボリュームの連続画像を撮影し、タイムラプスイメージングの取得を開始します。各ボリュームの取得には 30 秒かかります。したがって、このボリュームを60回連続で反復することで、30分間の画像取得が完了します。このビデオでは、胸腺内のGFP陽性細胞を示しています。細胞の移動と血管内の血流に注目してください。しかしながら、準備が不十分な場合、特に臓器の温度が低い場合には、血流が続いていても細胞が移動しなくなります。ここで説明する手法を用いることで、胸腺細胞のin vivo観察が可能になります。これらの手法は、T細胞分化における胸腺細胞の分布と相互作用の観察に関心を持つ免疫学者にとって非常に有用であると考えられます。手順は極めて単純ですが、実験的なアーティファクトを避けるためにいくつかの注意点があります。例えば、組織内の酸素供給量が低下するため、血管を損傷させないよう注意する必要があります。また、温度は常に37 Celsius degreeに維持してください。最終的に、ここで得られた結果は、他のあらゆる結果やx vivo法によって得られた結果を検証する上で非常に有用であると考えられます。

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。...

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

我々は、新生児キメラの世代だけでなく、2光子顕微鏡によるex...

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。...

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

マウス脳微小血管系のIn vivoイメージングのための2光子顕微鏡

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T...

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

本研究ではマウスの気管粘膜のインフルエンザ ウイルスに感染後 2...

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

本プロトコルは、開腹手術のリスクを回避し、盲検経皮的注射の精度を向上させるためにマウスの胸腺内注射のために確立されたインターベンショナルラジオロジー手順について説明しています。...

マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。...

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

本研究は、マウスの前足の皮膚における低閾値機械受容体(LTMR)軸索末端の構造を可視化するための 生体内...

マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

学ぶ2光子顕微鏡を用いたマウス胸腺の生体内イメージング手法。T細胞発生におけるタイムサイトの動態と相互作用を観察し、免疫学研究に有用なプロトコルを確立する方法です。

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

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