Name: ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚心臓の高速免疫染色法。麻酔下からの摘出、抗体浸透性向上、高解像度イメージングにより細胞・亜細胞構造を可視化。従来法より短時間で発生生物学研究に有用です。

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我々は、ゼブラフィッシュ畜産で彼の助けのためにBeninio Jomokに感謝。この作品は、NIH HL81753によって運営されている。

1。スライドの準備と加湿チャンバー<ol><li>加湿チャンバーを空にチップボックスのようなボックスから行うことができます。チャンバーと光から試料を保護するためにアルミホイルでカバーの両方を包みます。 </li><li>チャンバー内に、乾燥から心臓サンプルを防ぐことがチャンバ内の湿度を維持するために湿紙タオルの山を置く。スライド用ラックとしてペーパータオルの上に小さなプレートを設定します。 </li><li> 5 × 5 mm程度の寸法と心臓のサンプル用井戸を作るためにimmEdgeのペンを使って顕微鏡スライドの表面に線や円のいずれかを描く。スライドを乾燥させて。 </li><li>加湿チャンバー内のスライドを入れて、各ウェルに50UL新鮮な4％のホルムアルデヒドを追加。 </li></ol> 2。胚の心臓の解剖<ol><li>魚止めのボディの動きまで、約1分間0.4％tricaineを含むE3卵の水7で魚の胚を麻酔がまだ正常な心を持っている鼓動。 </li><li>解剖顕微鏡のステージ上に凹の顕微鏡用スライドを置く。よく凹部に胚を移す。 </li><li>明らかに心を明らかにするために解剖顕微鏡の光の組み合わせを調整します。個人の好みに応じて、暗視野やDICのような偏光状態のいずれかである可能性があります。 </li><li>その後、乾燥、75％エタノールで2つのインスリン注射器を清掃してください。 </li><li>心臓より高い倍率と焦点に解剖顕微鏡を調整します。物理的に頭部に近い卵黄体節境界に1つの針の先端を挿入することによって胚を修正。心臓領域に別の針の近くに挿入し、すぐに心を引き出します。心臓が完全に胚から分離されていない場合は、心臓と卵黄の間に、残りの接続組織を切断。 </li><li>分離された心臓の低倍率と焦点に顕微鏡を調整します。 10μlのpipettemanを使用し、1μlの音量に設定します。どちら描画または触れるためにpipettemanの先端を適用する単離心臓の内でまたは先端の表面に付着するのどちらかになるように心はサンプル、。 </li><li>準備されたスライド上の4％ホルムアルデヒド溶液でピペット先端を浸して溶液中に心を解放するためにピペットピストンを押し下げる。水面の表面張力は、溶液にピペットチップから心を解放するのに役立ちます。各ウェルの3心より小さいを置く。 </li></ol> 3。免疫染色<ol><li>チャンバーを閉じ、穏やかなロッキング運動でシェーカー上に置いた。室温で20分間心臓のサンプルを修正。 </li><li>スライドの裏面に水を拭いてから、交換するバッファのための解剖顕微鏡のステージにスライドを置く。 </li><li>各ウェルに空の領域に10μlのpipettemanから先端を浸し、心臓のサンプルから可能な限り先端を保つ。ソリューションを先端に描画されるときに心が水の流れで移動する可能性がありますので、先端に装着、心臓を避けるために注意してください。変更必要に応じて先端のローカライズ、。 </li><li>組織上に溶液を処分すると心臓のサンプルが容易に気泡の存在下で失われているので、先端に気泡を生成することは避けてください。短い時間のために心臓のサンプルは部分的に乾燥しておくこと心がスライドに付着したままでいることができます。 </li><li>心臓のサンプルをカバーし、5分間ゆっくりと揺動運動の加湿チャンバー内でインキュベートする50μlのPBSTを追加。リンスつのより多くの時間を繰り返します。このステップの後、心臓のサンプルは4℃加湿チャンバーまでの1週間℃で保存することができます。 </li><li>室温で1時間、PBSTで10％のヒツジ血清で心臓のサンプルをブロックする。 </li><li>室温で1時間10％ヒツジ血清/ PBSTで、このようなβ-カテニン抗体の1:200希釈とMEF2特異抗体の1:200希釈などの一次抗体、と心臓のサンプルをインキュベートする。 </li><li>室温でPBST三回（5分。ごと）で心臓のサンプルを洗浄してください。 </li><li>二次でサンプルをインキュベートするPBSTで0.5時間のためのそのようなアレクサタグ付き抗マウスおよび/または抗ウサギ抗体の1:1000希釈のような抗体を、、。 </li><li> PBSTで3回心臓サンプルを洗う（5分。ごと）室温での。 </li></ol> 4。イメージング<ol><li> PBSTを取り外し、各ウェルに10μlの封入剤を加える。溶液が透明になるまで数分間チャンバーを揺らし。 </li><li>封入剤のほとんどを削除し、顕微鏡のカバーガラス（24x50）とのスライドで井戸のすべてをカバーしています。 </li><li>ツァイスAxioplan 2顕微鏡を用いて画像の魚の心臓は、線分（カールツァイス）を装備。 </li></ol> 5。代表的な結果すべてのゼブラフィッシュの心筋細胞の膜と核を明らかに画像の例を図に示します。 1。 MEF2Cとβ-カテニン抗体は52 HPFのゼブラフィッシュの胚から摘出心臓の試料を染色するために一緒に使用されていました。一方MEF2C抗体染色の心筋細胞の核、β-カテニン抗体は、各セル8-10の境界を明らかにする。複合顕微鏡のステージを調整することにより、心臓のサンプルの画像は、外側の曲率と心臓11の内側の曲率の観察を可能にする同じ方向に調整することができます。合計心筋細胞の数、心筋細胞のサイズ、および真円度を測定することができます。 胎児心臓のサルコメア構造を外部にもらす別の例を図に示します。 2。我々は解剖胎児心でF59、ミオシンの抗体を用いて免疫染色を行った。太いフィラメントの紋帯が高い倍率（図2）6で明らかにすることができますながら、全体の胎児心における筋原線維のネットワークを明確に、低倍率で明らかにすることができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> 核とOUTLを表示するMEF2（赤）とβ-カテニン（緑）の図1。免疫染色ゼブラフィッシュ心室の心筋細胞のINES。スケールバー=10μmの<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> どちらかの低倍率（）または高倍率（B）でゼブラフィッシュ脳室に太いフィラメントを表示するミオシンの図2。Immnostaining。スケールバー=10μmの

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
<li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cardiac+development%3A+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li>
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<li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li>
<li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

古典的な全体のマウント免疫染色の方法に比べ、本手法は次のような利点があります。最初に、はるかに強い蛍光シグナルが一貫して改善された浸透のために取得することができます。全体のマウント免疫染色法では、心臓を取り巻く濃い皮膚組織は大幅に全身に高グラウンドで、その結果、多くの抗体の浸透を減少させた。この問題は、3日後に受精（DPF）より古い胚には特に厳しいです。対照的に、解剖心ははるかに良い浸透をレンダリングする、いくつかの細胞層で構成されています。第二に、ために多くの改善浸透、免疫染色のプロセス全体は、1日からわずか数時間に短縮することができます。我々は成功し、1時間からこのようなアクチニンなどのいくつかの抗体のための30分にIntegin結合キナーゼ（ILK）、およびβ-カテニン特異的抗体をインキュベーション時間を短縮している。第三に、高解像度の画像は、一貫して無傷の心から得ることができます。セルラー/細胞内の情報を明らかにする。ため卵黄の横にある心膜嚢の内部心臓の局在から、より高い倍率の対物レンズは、画像はそのまま胚を使用することはできません。したがって、心はそのまま心の画像が必要な場合解剖する必要があります。しかし、このような胚を弱める...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> tricaine </td><td>研究の有機物</td><td> 3007T </td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 329461 </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>シグマ</td><td> T8532 </td></tr><tr><td>抗β-カテニン抗体</td><td>シグマ</td><td> C7207 </td></tr><tr><td>抗MEF2C抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> ZFIN </td><td></td></tr><tr><td>抗α-アクチニン抗体</td><td>シグマ</td><td> A7811 </td></tr><tr><td>抗ILK抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> ＃3862 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 568ヤギ抗ウサギIgG抗体</<html> TD&gt; <td>インビトロジェン</td><td> A11011 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG1 </td><td>インビトロジェン</td><td> A21121 </td></tr><tr><td>蛍光用封入剤</td><td>ベクトル</td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> ImmEdgeペン</td><td>ベクトル</td><td> H - 4000 </td></tr><tr><td>ポリ- L -リシンコートしたスライド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 63410〜01 </td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 12から543 - D </td></tr><tr><td>凹んだ顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー</td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカMZ95 </td><td></td></tr><tr><td>化合物の顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td>線分</td><td>ツァイス</td><td></td></tr></tbody></table> PBST： 1 × PBS 0.5％トリトンX - 100 ENT&quot;&gt; 25X Tricaine： 400 mgのTricaine 97.9 mLののddH 2 O 2.1 mLの（1MトリスPH9） pHを7.0に調整する

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

ゼブラフィッシュの胚は、心臓の開発とその有利な発生学と遺伝学1,2のために人間の心の病気を研究するためのin vivoで脊椎動物のモデルで人気となる。約100-200胚は、成魚の単一ペアから毎週容易に入手可能である。 EX子宮を開発透明な胚は、心臓の欠陥3を評価するために最適です。任意の遺伝子の発現は、モルホリノ技術またはRNAの注射4を介して操作することができます。また、前方に遺伝子スクリーニングは、すでに心臓発生5の様々な観点に影響を与える変異体のリストを生成している。 全体のマウント免疫染色では、特定の組織6に標的タンパク質の発現パターンを明らかにするためには、この動物モデルにおいて重要なテクニックです。しかし、携帯電話または細胞内構造を明らかにすることができる高解像度の画像は、主に物理的なlocatに、難しい状態が続いている心と抗体のほとんど通過のイオン。 ここで、我々は最初の心臓を解剖し、顕微鏡スライドの表面に染色処理を行うことにより、これらのボトルネックに対処する方法を提示する。小さな心臓サンプルの損失を防ぐために、ソリューションの取り扱いを容易にするために、我々はimmEdgeのペンによって描画される顕微鏡の表面をスライド上に円の中で心臓のサンプルを制限。染色後、蛍光シグナルを直接複合顕微鏡で観察することができます。 胚魚の心臓は、わずか数細胞層で構成されて以来、私たちの新しいメソッドは、抗体の浸透を大幅に向上します。無傷の心からの高品質の画像が2日から6日に歳のゼブラフィッシュ胚のために多くの削減行列の時間内に得ることができます。我々の方法は、潜在的にゼブラフィッシュや他の小動物のいずれかから切除した他の器官を染色するために拡張することができます。

ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。

ゼブラフィッシュ胚は、その有利な胚発生特性により、心臓の発達およびヒトの心疾患を研究するための一般的な生体内（in vivo）脊椎動物モデルとなっています。

この手順の全般的な目的は、解剖したゼブラフィッシュ胚の心臓に対して免疫染色を行い、細胞または細胞内構造を高解像度で明らかにすることです。まず、免疫染色用に加湿チャンバー内でスライドを準備します。次に、麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚から心臓を解剖し、続いて特異的抗体を用いて胚心臓の免疫染色を行います。次に、aomeを搭載した顕微鏡を用いて魚の心臓の画像を記録します。最後に、浸透性が大幅に向上したことで、ゼブラフィッシュ胚心臓の細胞または細胞内構造を免疫蛍光顕微鏡を用いて明らかにします。ホールマウント免疫染色などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、標準的なゼブラフィッシュ心臓の高画質画像を取得できる点にあります。加湿チャンバーを準備し、サンプルを遮光するためには、アルミホイルでチャンバーと空のチップボックスの蓋を包んで使用してください。チャンバーの底に濡れたペーパータオルを重ねて配置し、サンプルの乾燥を防ぎます。また、スライドグラスを置くラックとして、ペーパータオルの上に小型マイクロプレートを設置します。イメージペンを使用して、顕微鏡スライドの表面に約 5 mm × 5 mm の円または線を描き、ウェルを作成します。スライドを乾燥させます。スライドを加湿チャンバーに入れ、各ウェルに 50 µL のホルムアルデヒドを加えます。胚心臓を解剖するために、魚の胚がすべての身体運動を停止し、かつ正常な心拍を維持している状態になるまで、0.4% tricaine 含有 E3 卵水中で麻酔をかけます。時間は約 1 分間です。胚を凹面スライドガラスに転移させます。暗視野照明またはDICのような偏光照明を備えた解剖顕微鏡のステージ上に、凹面顕微鏡スライドを設置します。心臓がはっきりと見えるように顕微鏡の光量を調整してください。次に、2本のインスリン注射器を75% ethanolで洗浄します。その後、乾燥させ、顕微鏡の倍率を上げて心臓に焦点を合わせます。次に、1本の針先を卵黄に挿入し、頭に近い部位の境界付近で胚を物理的に固定します。次に、心臓領域の近くに別の針を挿入し、速やかに心臓を取り出します。心臓が胚から完全に分離していない場合は、心臓と卵黄の間に残っている結合組織を切り離します。低倍率で心臓に焦点を合わせます。10 µLピペットマンを1 µLに設定します。ピペットマンのチップを心臓サンプルに当てて吸い上げるか、または軽く触れさせ、単離した心臓がチップ内部に入るか、あるいはチップの表面に付着するようにします。準備したスライド上のホルムアルデヒド溶液にピペットチップを浸し、ピペットのプランジャーを押して心臓を溶液中に放出します。ホルムアルデヒドに浸した心臓を凹みスライドガラスに載せ、チャンバーを閉じてシェーカーに設置し、室温で20分間緩やかに揺らします。スライドガラスの裏面の水分を拭き取り、バッファー交換を行うため、解剖顕微鏡のステージにスライドガラスを載せます。10 µL ピペットマンを使用して、心臓に触れないよう注意しながら、スライドガラスからホルムアルデヒドを慎重に吸引します。50 µL のPBSTを加えて心臓サンプルを覆い、加湿チャンバー内で5分間インキュベートします。心臓をPBSTで2回目に洗浄します。次に、心臓サンプルを10% sheep serum含有PBSTで室温で1時間ブロッキングします。その後、10% sheep serum含有PBSTで希釈したbeta cateninおよびF two特異的一次抗体（希釈倍率1:200）とともに、心臓サンプルを室温で1時間インキュベートします。心臓サンプルを室温でPBSTを用いて5分間ずつ3回洗浄します。1:1000に希釈したAlexaタグ付き抗マウスおよび／または抗ウサギ二次抗体を含むPBSTで、サンプルを30分間インキュベートします。サンプルのイメージングを行う前に、再びPBSTで3回洗浄します。PBSTを除去し、各ウェルに封入剤を1 µLずつ加えます。溶液が透明になるまで、チャンバーを数分間十分に揺らします。Zeiss Axio Plan 2顕微鏡（Aome搭載）を用いて魚の心臓を撮影します。この画像では、受精後52時間のゼブラフィッシュ胚由来のゼブラフィッシュ心筋細胞の核と細胞膜を、それぞれMEF2Cおよびベータアクチンに対する抗体で同定しています。複合顕微鏡のステージを調整することで、心臓サンプルの画像を同じ方向合わせにすることができ、これにより心臓の外弯と内弯の観察が可能になります。その後、心筋細胞の総数、心筋細胞のサイズ、および円形度を測定できます。ここでは、myosin抗体F 59を用いて、解剖した胚性心臓のサルコメア構造を示しています。胚性心臓心室全体のmyofibrilネットワークは低倍率で明確に確認でき、太いフィラメントの横紋帯は高倍率で観察されます。このビデオを視聴することで、解剖したゼブラフィッシュの胚の心臓における免疫染色の方法、特にゼブラフィッシュの胚から心臓を解剖する方法と、免疫染色プロセス中の心臓の取り扱い方法について十分に理解することができます。

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Biology

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学ぶゼブラフィッシュ胚心臓の高速免疫染色法。麻酔下からの摘出、抗体浸透性向上、高解像度イメージングにより細胞・亜細胞構造を可視化。従来法より短時間で発生生物学研究に有用です。

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

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