果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

本実験では、生物物理学的な手法を用いて、トマトのクチクラおよび保護ポリマーの架橋能を評価し、果実クチクラからの表層および内部クチクラワックスの選択的除去をモニタリングします。果実全体からのクチクラの単離は、トマトの表皮および付着した細胞壁を酵素処理することで行われます。次に、果実クチクラを完全に脱脂するための抽出を行い、単離したクチンについて分子特性解析を行います。

バイオポリエステルは、固体核磁気共鳴によって分析されます。固体NMRスペクトル解析により、野生型および改変トマト果実のクチクラに含まれるクチンにおいて、架橋可能な酸素含有アロファティック部位の相対的な割合に差があることが明らかになります。あるいは、果実全体にアラビアゴムを塗布して剥離させることでエピクチクラワックスを除去し、その後クロロホルムに浸漬して果実クチクラからイントラクチクラワックスを除去します。

次に、トマトの果皮と同様の酵素処理によって部分的に脱ロウしたクチクラを、固体NMRおよび原子間力顕微鏡を用いて解析します。最終的に、NMRスペクトルにおけるロウのピークが段階的に減少していくこと、および同時に行ったAFMイメージングで観察される果実クチクラの表面プロファイルの変化を通じて、エピクチクラロウおよびイントラクチクラロウが逐次的に除去されることが明らかになります。植物の地上部器官は、クチクラと呼ばれるバイオポリエステルロウの集合体によって保護されています。本稿では、固体核磁気共鳴および原子間力顕微鏡を用いて、トマト果実のクチクラから内部ロウおよび外部ロウを選択的に除去することを評価するためのプロトコルを提示します。

これらの手法は、工学的に設計されたクチクラ材料の架橋能を評価するためにも利用できます。手順の実演を行うのは、研究グループのメンバーであるIshish Chatterjee博士、博士課程候補生のShantani Sarkar、および元高校生のJulia Tikです。また、化学工学の同僚であるAlexander博士の研究室のポストドクトラルフェロー、Olivia Nisau博士も実演に加わります。トマトの表皮の酵素的単離を開始するには、市販または栽培された果実3個をボウルに入れ、表皮を大きな断片状に剥き、内側の果皮組織を取り除きます。

その後、トマトの皮を脱イオン水で洗浄し、記述プロトコルに従って調製した酵素カクテルの中に、皮が完全に浸かるようにしてビーカー内で保存します。31 °Cで24時間、連続的に振盪しながらインキュベートしてください。その後、ビュナー漏斗またはキッチンストレーナーを用いてトマトの皮を回収し、脱イオン水で洗浄します。

室温の真空乾燥機に1時間置いた後、乾燥させた表皮をラベル付きの密閉ボトルに保存します。その後の脱ロウ操作では、中心に配置したガラス製または使い捨てのシンブルにトマト表皮サンプルを半分ほど満たし、ピンセットを用いて、溶媒抽出カラムの底部に慎重に配置します。その後、記述されたプロトコルに従い、溶媒としてメタノールを用いて抽出装置のセットアップを続けます。

1時間にわたってプロセスを監視し、リザーバーに1秒あたり約1滴が蓄積し、装置内のソックス内でサイフォニングが起こるようにバリアックの電圧を調整します。12時間の抽出後、シンブルが満たされたら、装置を冷却させ、ヒーティングマントルを下げてから、抽出後の溶媒を廃棄するために抽出器とリザーバーを一体のユニットとして取り出します。カラムを傾けて、下のフラスコへサイフォニングさせます。

ピンセットを使用して、シンブルを抽出カラムのネックの直下まで引き上げます。余分な溶媒を排出し、シンブルを清潔な表面の上に置きます。フラスコを取り外し、廃液をラベル付きの溶媒回収容器に注ぎます。

クロロホルムやヘキサンなど、極性が徐々に低くなる溶媒を用いて、それぞれ12時間ずつ抽出手順を繰り返します。トマト角皮サンプルの乾燥後、質量を測定し、パラフィルムで密封したスクリューキャップ付きの容器に入れて室温で保存します。NMRサンプルの調製には、完全に脱ロウ処理されたトマト角皮（クチン）を4〜6 mg、販売元提供のパッキングツールを用いて1.6 mmの高速MASジルコニアローターに充填します。

トップキャップを取り付けた後、回転速度を測定できるように、キャップの半分を黒のインクマーカーで塗ります。固体NMR実験の初期セットアップは技術的に困難なプロセスであり、経験豊富なスタッフの指導の下で行われます。まず、記載されたプロトコルに従い、モデル化合物を用いて磁場均一性の調整と実験パラメータの最適化を行います。その後、キュエットに封入したローターをプローブに挿入し、プローブをマグネットに設置します。

回転速度を10 kHzまで徐々に上げ、サンプルの充填状態が良好であること、および回転子の回転変動が20 Hz未満で安定していることを確認します。プローブのチューニングコンデンサとマッチングコンデンサを繰り返し調整し、プロトンおよび炭素13 NMR周波数の両方において電力反射が最小になるようにします。実験温度を25 °Cに設定します。

10 kHzの回転周波数で決定されたHartman-Hanプロトン・カーボンマッチング条件に対応する、最適化済みのCPMA実験を開始します。4,096回のトランジェントを収集後、50〜100 Hzの指数関数的なラインブロードニングでスペクトルを処理し、フーリエ変換を行って、信号強度対化学的遮蔽（ppm）のNMRスペクトルを生成します。炭素13の化学シフトは、本文の記述に従って参照してください。

ローターの回転周波数を15 kilohertzに上げ、C-P-M-A-S炭素13 NMRスペクトルのラダー回転周波数化学シフト分析で決定されたHartman Han Matching条件に対応するC-P-M-A-S測定を繰り返します。徹底的に脱ロウ処理したトマト角皮に存在する主要な官能基として、長鎖PHA、酸素含有PHA、多重結合、および芳香族化合物と炭素収率が同定されました。酸素含有PHAは、クチンバイオポリマーのモノマー単位間に共有結合を形成し、それによってクチンマトリックスの分子構造を構築する上で極めて重要な役割を果たしています。

45 ppmから100 ppmのスペクトル領域で観察された相対ピーク面積の違いは、変異体のクチンが野生型のapinと比較して、架橋形成に関与するCHO構造部位を相対的に高い割合で含んでいることを示唆しています。これにより、エピクチクラワックスおよびイントラクチクラワックスの選択的分離を開始します。

2回目のホールトマトのバッチを蒸留水で洗浄します。ペーパータオルとKimwipeで水分を拭き取り、アルミホイルの上にヘタを下にして置きます。ホールトマトの上部から下部にかけて、120%アラビアゴム水溶液を塗布します。

アラビアゴムを果皮上で1時間乾燥させ、薄膜を形成させます。ピンセットを用いてこの膜を取り除きますが、トマトの果皮を突き刺さないように注意してください。本文に記載されている方法でこの膜をさらに処理することで、外表クチクラワックスが得られます。

トマトは物理的にそのままの状態を維持します。トマトをクロロフォームに2分間浸します。室温で溶媒を蒸発させた後、クチクラ内ワックスを回収します。次に、トマトの皮をむき、セルラーゼ、ペクチナーゼ、および酢酸ナトリウム緩衝液を用いて酵素処理を行い、それぞれセルロースとペクチンを除去します。

その後、前述の手順に従ってサリ抽出を行い、トマトのワックスを完全に除去します。C-P-M-A-S実験は、本文に記載されている通り、天然および部分的に脱ワックス処理した果皮キューティクル試料を用いて繰り返すことができます。原子間力顕微鏡のセットアップは複雑な工程であるため、最初は経験豊富な技術スタッフの指導の下で行うことが最適です。まず、走査型プローブ顕微鏡（略称：SPM）の電源を入れ、顕微鏡モードの切替スイッチがコンタクト原子間力顕微鏡モードに設定されていることを確認します。

次に、前面にある2つのユーザー調整ノブを回して、SPMヘッドを手動で上昇させます。ヘッド背面にあるクランプネジを回して、AFMチップホルダーをSPMヘッドから取り外します。ピンセットを使用して、ホルダーから既存のAFMカンチレバーを取り除きます。

次に、パッケージから窒化シリコンチップ付きの新しいカンチレバーを慎重に取り出し、古いカンチレバーと交換して取り付けます。光学顕微鏡を用いて、新しく取り付けたFMカンチレバーが破損していないことを確認してください。トマトのクチクラサンプルを、両面テープでサンプルパックに貼り付けます。

光学顕微鏡を用いて、クチクラ試料が平坦で滑らかな状態であることを確認します。試料をパックに固定した後、パックに取り付けられたトマトクチクラ試料をSPMスキャナー上部の磁性領域に配置します。ノブを回して、スキャナー前面の2つの手動ネジを、AFMチップの破損を避けるのに十分な高さに設定してください。

チップホルダーをSPMヘッドに装着する際は、電動背面ネジを前方の2本のネジとほぼ同じ高さに設定してください。チップホルダーをSPMヘッドに再度挿入し、ヘッドの背面クランプネジを締めて固定します。レーザーを点灯させた後、ヘッド上部の中央および右側のレーザー調整ノブを使用して、FMカンチレバー上のレーザースポットを調整してください。

反射レーザービームを紙の上でモニターし、レーザースポットをFMカンチレバーの先端に正確に配置します。レーザースポットの位置を調整し、合計信号を最大にします。可動ミラーを水平方向および垂直方向に調整してフォトディテクター上の反射レーザースポットの位置を制御し、入射光が4つのクアドラントに均等に受信されるようにします。

SPMスキャナーのユーザー制御フロントネジと電動バックネジを戻すことで、検出器がAFMチップを下げます。倒立顕微鏡を用いて、AFMチップが試料表面に接近する様子を視覚的に監視してください。3本のネジがすべて同じレベルにあることを確認してください。

傾いた試料をイメージングした際にアーティファクトが生じるのを避けるため、チップを試料に近づけますが、試料表面に接触したり突き破ったりしない程度の距離を保ってください。窒化シリコン製 AFM プローブを用いたコンタクト AFM モードでは、AFM カンチレバーで反射したレーザー光が可動ミラーで反射し、光検出器へと到達します。ミラーの位置を調整し、ゼロボルト・セットポイントの出力信号電圧を -2 V に、差動信号を 0 V に設定してください。

nano scopeソフトウェアを使用します。顕微鏡アイコンをクリックし、適切なプロファイルを選択してください。スキャン制御設定パネルを使用して、スキャン速度とスキャンサイズを設定します。

チップエンゲージアイコンをクリックして、AFMチップを試料表面に接触させます。プログラムがSPMベースの電動バックスクリューを制御し、チップが試料表面に接触するまで下降させます。チップの接触が正常に完了すると、スキャンプロセスが自動的に開始されます。

ソフトウェアのイメージモードとスコープモードの両方を使用してスキャンプロセスを監視し、記載されたプロトコルに従って、最高の解像度の画像が得られるようパラメータを繰り返し調整してください。例えば、最初は大きなZ軸データスケール値でスキャンを開始します。その後、Zデータスケール値を慎重に下げて、画像上の表面形態のコントラストを最適化します。

画像をキャプチャしてデータファイルを保存します。フラットニング関数を用いてデータを処理し、垂直スキャナーのドリフトによる画像の湾曲や、スキャンライン間の垂直オフセットなどの画像アーティファクトを除去します。最後に、平均粗さ（Ra）を算出します。

$^{13}\text{C-P-MAS-NMR}$スペクトルでは、31 ppmのワックスピークが漸次的に減少しており、これはクチンバイオポリマーの主要な化学構造を維持したまま、クチクルおよびワックス複合体から表皮および内部のクチクルワックスが順次除去されたことを示している。FM像の解析により、果実クチクルから表皮および内部のクチクルワックスが段階的に抽出されたことで表面の不規則性が明らかになり、クチクルアセンブリの組織的な変化が示唆された。この手法に習熟すれば、トマト果実クチクルからの表皮および内部クチクルワックスの順次除去を2時間で完了させることができる。

果皮キューティクルの徹底的な抽出のために溶媒抽出を行う際は、コンタクトノードを使用した後、極性の異なる一連の溶媒を用いることが重要です。ここでは AFM プロトコルを示します。さらに、AFM 実験を用いてキューティクルの表面弾性率を測定することも可能です。

このビデオを視聴することで、クチン・ワックス複合体から各成分を系統的に単離する方法、および固体NMRとFMを用いてそれぞれクチクラ材料の分子構造解析および迅速な表面検査を行う方法について、十分に理解することができます。本ビデオで解説する手法により、植物生物学の研究者は、天然および設計された植物組織の分子組成と超分子構造を決定することが可能になります。