Name: 果実キューティクルの単離と生物物理学的研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 学ぶトマト果実キューティクルの単離と固形NMR・原子間力顕微鏡による生物物理学的解析。エピ・イントラキューティキュラーワックスの選択的除去と架橋能評価の手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、米国国立科学財団の助成金＃MCB-0741914とMCB-0843627によってサポートされていました、追加のインフラストラクチャのサポートは、健康の2国立研究所の研究資源のナショナルセンターからG12 RR03060-26でニューヨーク市立大学で提供されていました。我々は感謝してJKCにはM82（野生型）およびCM15（変異）トマトのキューティクルを提供するためのコーネル大学の植物生物学部門でグループをローズ認める。我々は、AFMの実験と彼の寛大な助けのために教授アレクサンダーCouzisのCCNY化学工学グループから博士スピロスMonastiriotisに感謝します。我々は、グラフィカルな設計をサポートするために氏ローレン郷原に感謝します。

<ol><li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+design+of+plant+cuticles%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li>
<li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li>
<li>Jetter, R., Schäffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li>
<li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+%C3%8E%C2%B2-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Botany%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li>
<li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties%2C+but+not+transpirational+water+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li>
<li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li>
<li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li>
<li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li>
<li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li>
<li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters%5BTitle%5D)+AND+%22Solid+State+Nucl.+Mag%22%5BJournal%5D)">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li>
<li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Amer.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li>
<li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li>
<li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin%2C+an+insoluble+plant+polyester%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li>
<li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li>
<li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li>
<li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li>
<li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li>
<li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+a+versatile+tool+in+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).</li>
<li>Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li>
<li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

プロトコルは、ここに破壊的な化学分解を必要とせずに複雑な難治性の植物材料の詳細な分子とミクロ特性評価を可能に説明します。我々は、異種クチクラブレンドからepicuticularとintracuticularワックスの選択的な除去のための手順を実施し、監視対象のクチクラアセンブリの構造組織を制御するさまざまな脂質（ワックス）とクチンのバイオポリエステルのブレンドは、10を検討する。固体13 C NMRは、栽培、野生型および単一遺伝子からcutinsの架橋機能を比較するためにワックス分子成分の抽出を判断するために使用され、原子間力顕微鏡は、表面粗さの付随的な変化を調べるのに役立った。6,11ました変異体トマト果実、固体13 C NMRは、CHOおよびCH 2 Oの化学成分の相対的な数値を推定するために使用されていました。 設計機能の数このプロトコルのsは注目に値する。ワックス材料が発散極性の溶剤の一連の果実表皮の治療、脂質の広い範囲を包含するように徹底的な脱脂を達成するために不可欠です。さらに、脱蝋時間は8時間からキューティクルのサンプルの性質に応じて24時間ごとに異なる​​可能性があります。無傷の果実の表皮から一貫しepicuticularワックスを抽出するためには、表面に均一に接着剤コーティングを適用することが不可欠です。 ソリッドステートCPMAS 13 C NMR 12は 、そのネイティブの物理的特性を維持しながら、高度に不均一と不溶性の植物の生体高分子の様々な構造要素を識別するための迅速定性法である、13の伝統的な溶液状態のNMRも抽出ワックス混合物を特徴付けるために使用することができます。官能基の定量は、無傷の植物ポリマー、5高忠実度の直接偏波マジック角回転（Dのために望まれている場合PMAS）13 C NMR 5,14は、相補的な方法として使用する必要があります。官能基の正確な定量には、リサイクル回数、励起パルスの長さ、および異種デカップリングの強さの慎重な最適化を必要とする15異種デカップリングTPPM 16またはを使用して、50 kHzから185 kHzまでの範囲の1 Hの電界強度を設定することができ脊髄7の方法。これらのパラメータに加えて、CPMAS測定の感度はスピンロックの時間とハートマン·ハーン一致条件に依存しています。伝統的なCPMASの代わりに15が 、傾斜振幅CP（RAMP-CP）技術は、クロスを最大化するために実装することができますスピンロック期間（またはその逆）の間に一定の13 Cの電界強度の振幅を維持しながら直線的に（〜20から50パーセント）または接線方向に1 Hの振幅を変化させることにより、偏光効率でCPMAS測定を行う17,18二つの異なるROの最小Torの紡糸の周波数スペクトルのメインピークからスピニングサイドバンドを区別することが不可欠です。 コンタクトモードで行わ同時AFM測定には、ろうの成分の逐次除去時にインスタンスの高いスキャン速度と高解像度、19とキューティクルの表面状態の直接的なイメージングを可能にします。横方向（剪断）力による損傷を回避し、試料表面の削り、繊細な&quot;ソフト&quot;の植物材料の表面特性評価のための代替として使用することができます（非接触）モードをタップでAFMを動作させる。いずれの場合において5,20 、表面上の同じ場所の複数の画像の連続取得は、AFM測定の&quot;プローブ·表面相互作用&quot;に起因するどのような表面の損傷を識別するのに役立ちます。6,21最適な再現性については、ソフトクチクラ表面に適したバネ定数を有するAFMプローブがなければなりません使用され、温度と湿度の恒常性が維持されるべきである。6,15,20 </sまで固体NMRのに対し&gt;はアンサンブル平均（バルク）トマト果実キューティクルのプロパティの分子プロファイルを提供しており、原子間力イメージングは、これらの絶妙な複雑な巨大分子集合体の表面形状を追跡するための補完的な非侵襲性のプローブ22,23を提供しています。1,2

<table><tbody><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>ペクチナーゼ</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;、要冷蔵</td></tr><tr><td>セルラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1.3 units/mg、要冷蔵</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>極めて有害</td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカー</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model No.G24</td><td>MFG No.M1036-000G</td></tr><tr><td>真空乾燥機</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>バリアックコントローラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスシンターろ過用スリーブ (85 mm/25mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て抽出スリーブ (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>ガラスウール</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>アラビアゴム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1.6 mm fastMASジルコニアローター</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR分光計</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>standard bore magnet</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>CPMAS用モデル化合物</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>CPMAS用モデル化合物</td></tr><tr><td>アダマンタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>NMRの90&amp;#x00B0;パルス校正用</td></tr><tr><td>マルチモード走査型プローブ顕微鏡 (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscopeソフトウェア</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>AFMプローブ (非導電性窒化ケイ素チップ)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Model NP-20</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネットパック</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルーツピーラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;chner漏斗</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

キューティクル、陸生植物の空中部分に疎水性の保護層は、様々な生物と非生物的ストレスへの多彩な防御壁として機能し、また外部環境からの水の流れを調節します。1バイオポリエステル（クチン）と長鎖脂肪酸（ワックス）がキューティクルの主要な構造的な枠組みを形成する;。クチクラ層の機能の整合性は、外側の&#39;epicuticular&#39;層だけでなく、クチンの生体高分子と&quot;intracuticular &#39;ワックスから成るブレンドに依存して2ここで、我々は包括的なプロトコルを記述する商業的トマト（Solanum lycopersicum）の果実キューティクルから徹底的にワックスを抽出したり、キューティクルのコンポジットから順次選択してepicuticularとintracuticularワックスを除去する。ジェッターとシェーファー（2001）の方法は、果実の表皮からepicuticularとintracuticularワックスの段階的な抽出のために適応されました。3,4監視するにはシーケンシャルワックス除去、ソリッド·ステート·交差偏波マジック角スピニングのプロセス（CPMAS）13 C NMR分光法についての情報を補完するバルク材料の分子レベルの構造のプロファイルを提供し、原子間力顕微鏡（AFM）と並列に使用されましたマイクロスケールの地形とクチクラ表面の粗さ。栽培、野生型および単一遺伝子変異体トマト果実からの脱蝋キューティクルの架橋能力を評価するには、MAS 13 C NMRは酸素族（CHOおよびCH 2 O）の化学成分の相対比率を比較するために使用されていました。 様々な極性の溶剤のパネルで段階的にソックスレー抽出による徹底的な脱蝋は、クチンのバイオポリエステルの化学構造を維持しながら、彼らの脂肪族および芳香族成分の疎水性の特性に基づいて、ワックス部分を分離するための効果的な手段を提供します。 epicuticularワックス、セレの機械的な抽出補完的な物理的方法論によって監視intracuticularワックスのctive除去、キューティクルアセンブリを調査するための前例のない手段を提供します。このアプローチでは、超分子組織とワックスの様々なタイプの構造的統合、クチンワックスマトリックスのアーキテクチャ、および化学物質を明らかに各成分の組成物。さらに、固体13 C NMRは、野生型と変異型赤熟したトマト果実のCHOおよびCH 2 Oの化学成分の相対的な数値の違いを明らかにする。 NMR技術は、指紋に、不溶性アモルファス、化学的に不均一であるクチクラ物質の分子構造を優れたツールを提供しています。非侵襲性の面選択的イメージング技術として、AFMは、NM-μmの長さスケールのクチクラアセンブリの構造組織を調べるために、効果的かつ直接的な手段を供給する。

空中植物器官は表皮、超分子バイオポリエステルワックスアセンブリによって保護されています。我々は固体NMRと原子間力顕微鏡による分子とミクロスケールのトマト果実キューティクルからの選択的に除去するエピとintracuticularワックス、それぞれを監視するために、と設計されたクチクラbiopolyestersの架橋能力を評価するためのプロトコルを提示します。

陸上植物の地上部にある疎水性の保護層であるクチクラは、さまざまな生物的および...に対する多機能な防御障壁として機能します。

本実験では、生物物理学的な手法を用いて、トマトのクチクラおよび保護ポリマーの架橋能を評価し、果実クチクラからの表層および内部クチクラワックスの選択的除去をモニタリングします。果実全体からのクチクラの単離は、トマトの表皮および付着した細胞壁を酵素処理することで行われます。次に、果実クチクラを完全に脱脂するための抽出を行い、単離したクチンについて分子特性解析を行います。バイオポリエステルは、固体核磁気共鳴によって分析されます。固体NMRスペクトル解析により、野生型および改変トマト果実のクチクラに含まれるクチンにおいて、架橋可能な酸素含有アロファティック部位の相対的な割合に差があることが明らかになります。あるいは、果実全体にアラビアゴムを塗布して剥離させることでエピクチクラワックスを除去し、その後クロロホルムに浸漬して果実クチクラからイントラクチクラワックスを除去します。次に、トマトの果皮と同様の酵素処理によって部分的に脱ロウしたクチクラを、固体NMRおよび原子間力顕微鏡を用いて解析します。最終的に、NMRスペクトルにおけるロウのピークが段階的に減少していくこと、および同時に行ったAFMイメージングで観察される果実クチクラの表面プロファイルの変化を通じて、エピクチクラロウおよびイントラクチクラロウが逐次的に除去されることが明らかになります。植物の地上部器官は、クチクラと呼ばれるバイオポリエステルロウの集合体によって保護されています。本稿では、固体核磁気共鳴および原子間力顕微鏡を用いて、トマト果実のクチクラから内部ロウおよび外部ロウを選択的に除去することを評価するためのプロトコルを提示します。これらの手法は、工学的に設計されたクチクラ材料の架橋能を評価するためにも利用できます。手順の実演を行うのは、研究グループのメンバーであるIshish Chatterjee博士、博士課程候補生のShantani Sarkar、および元高校生のJulia Tikです。また、化学工学の同僚であるAlexander博士の研究室のポストドクトラルフェロー、Olivia Nisau博士も実演に加わります。トマトの表皮の酵素的単離を開始するには、市販または栽培された果実3個をボウルに入れ、表皮を大きな断片状に剥き、内側の果皮組織を取り除きます。その後、トマトの皮を脱イオン水で洗浄し、記述プロトコルに従って調製した酵素カクテルの中に、皮が完全に浸かるようにしてビーカー内で保存します。31 °Cで24時間、連続的に振盪しながらインキュベートしてください。その後、ビュナー漏斗またはキッチンストレーナーを用いてトマトの皮を回収し、脱イオン水で洗浄します。室温の真空乾燥機に1時間置いた後、乾燥させた表皮をラベル付きの密閉ボトルに保存します。その後の脱ロウ操作では、中心に配置したガラス製または使い捨てのシンブルにトマト表皮サンプルを半分ほど満たし、ピンセットを用いて、溶媒抽出カラムの底部に慎重に配置します。その後、記述されたプロトコルに従い、溶媒としてメタノールを用いて抽出装置のセットアップを続けます。1時間にわたってプロセスを監視し、リザーバーに1秒あたり約1滴が蓄積し、装置内のソックス内でサイフォニングが起こるようにバリアックの電圧を調整します。12時間の抽出後、シンブルが満たされたら、装置を冷却させ、ヒーティングマントルを下げてから、抽出後の溶媒を廃棄するために抽出器とリザーバーを一体のユニットとして取り出します。カラムを傾けて、下のフラスコへサイフォニングさせます。ピンセットを使用して、シンブルを抽出カラムのネックの直下まで引き上げます。余分な溶媒を排出し、シンブルを清潔な表面の上に置きます。フラスコを取り外し、廃液をラベル付きの溶媒回収容器に注ぎます。クロロホルムやヘキサンなど、極性が徐々に低くなる溶媒を用いて、それぞれ12時間ずつ抽出手順を繰り返します。トマト角皮サンプルの乾燥後、質量を測定し、パラフィルムで密封したスクリューキャップ付きの容器に入れて室温で保存します。NMRサンプルの調製には、完全に脱ロウ処理されたトマト角皮（クチン）を4〜6 mg、販売元提供のパッキングツールを用いて1.6 mmの高速MASジルコニアローターに充填します。トップキャップを取り付けた後、回転速度を測定できるように、キャップの半分を黒のインクマーカーで塗ります。固体NMR実験の初期セットアップは技術的に困難なプロセスであり、経験豊富なスタッフの指導の下で行われます。まず、記載されたプロトコルに従い、モデル化合物を用いて磁場均一性の調整と実験パラメータの最適化を行います。その後、キュエットに封入したローターをプローブに挿入し、プローブをマグネットに設置します。回転速度を10 kHzまで徐々に上げ、サンプルの充填状態が良好であること、および回転子の回転変動が20 Hz未満で安定していることを確認します。プローブのチューニングコンデンサとマッチングコンデンサを繰り返し調整し、プロトンおよび炭素13 NMR周波数の両方において電力反射が最小になるようにします。実験温度を25 °Cに設定します。10 kHzの回転周波数で決定されたHartman-Hanプロトン・カーボンマッチング条件に対応する、最適化済みのCPMA実験を開始します。4,096回のトランジェントを収集後、50〜100 Hzの指数関数的なラインブロードニングでスペクトルを処理し、フーリエ変換を行って、信号強度対化学的遮蔽（ppm）のNMRスペクトルを生成します。炭素13の化学シフトは、本文の記述に従って参照してください。ローターの回転周波数を15 kilohertzに上げ、C-P-M-A-S炭素13 NMRスペクトルのラダー回転周波数化学シフト分析で決定されたHartman Han Matching条件に対応するC-P-M-A-S測定を繰り返します。徹底的に脱ロウ処理したトマト角皮に存在する主要な官能基として、長鎖PHA、酸素含有PHA、多重結合、および芳香族化合物と炭素収率が同定されました。酸素含有PHAは、クチンバイオポリマーのモノマー単位間に共有結合を形成し、それによってクチンマトリックスの分子構造を構築する上で極めて重要な役割を果たしています。45 ppmから100 ppmのスペクトル領域で観察された相対ピーク面積の違いは、変異体のクチンが野生型のapinと比較して、架橋形成に関与するCHO構造部位を相対的に高い割合で含んでいることを示唆しています。これにより、エピクチクラワックスおよびイントラクチクラワックスの選択的分離を開始します。2回目のホールトマトのバッチを蒸留水で洗浄します。ペーパータオルとKimwipeで水分を拭き取り、アルミホイルの上にヘタを下にして置きます。ホールトマトの上部から下部にかけて、120%アラビアゴム水溶液を塗布します。アラビアゴムを果皮上で1時間乾燥させ、薄膜を形成させます。ピンセットを用いてこの膜を取り除きますが、トマトの果皮を突き刺さないように注意してください。本文に記載されている方法でこの膜をさらに処理することで、外表クチクラワックスが得られます。トマトは物理的にそのままの状態を維持します。トマトをクロロフォームに2分間浸します。室温で溶媒を蒸発させた後、クチクラ内ワックスを回収します。次に、トマトの皮をむき、セルラーゼ、ペクチナーゼ、および酢酸ナトリウム緩衝液を用いて酵素処理を行い、それぞれセルロースとペクチンを除去します。その後、前述の手順に従ってサリ抽出を行い、トマトのワックスを完全に除去します。C-P-M-A-S実験は、本文に記載されている通り、天然および部分的に脱ワックス処理した果皮キューティクル試料を用いて繰り返すことができます。原子間力顕微鏡のセットアップは複雑な工程であるため、最初は経験豊富な技術スタッフの指導の下で行うことが最適です。まず、走査型プローブ顕微鏡（略称：SPM）の電源を入れ、顕微鏡モードの切替スイッチがコンタクト原子間力顕微鏡モードに設定されていることを確認します。次に、前面にある2つのユーザー調整ノブを回して、SPMヘッドを手動で上昇させます。ヘッド背面にあるクランプネジを回して、AFMチップホルダーをSPMヘッドから取り外します。ピンセットを使用して、ホルダーから既存のAFMカンチレバーを取り除きます。次に、パッケージから窒化シリコンチップ付きの新しいカンチレバーを慎重に取り出し、古いカンチレバーと交換して取り付けます。光学顕微鏡を用いて、新しく取り付けたFMカンチレバーが破損していないことを確認してください。トマトのクチクラサンプルを、両面テープでサンプルパックに貼り付けます。光学顕微鏡を用いて、クチクラ試料が平坦で滑らかな状態であることを確認します。試料をパックに固定した後、パックに取り付けられたトマトクチクラ試料をSPMスキャナー上部の磁性領域に配置します。ノブを回して、スキャナー前面の2つの手動ネジを、AFMチップの破損を避けるのに十分な高さに設定してください。チップホルダーをSPMヘッドに装着する際は、電動背面ネジを前方の2本のネジとほぼ同じ高さに設定してください。チップホルダーをSPMヘッドに再度挿入し、ヘッドの背面クランプネジを締めて固定します。レーザーを点灯させた後、ヘッド上部の中央および右側のレーザー調整ノブを使用して、FMカンチレバー上のレーザースポットを調整してください。反射レーザービームを紙の上でモニターし、レーザースポットをFMカンチレバーの先端に正確に配置します。レーザースポットの位置を調整し、合計信号を最大にします。可動ミラーを水平方向および垂直方向に調整してフォトディテクター上の反射レーザースポットの位置を制御し、入射光が4つのクアドラントに均等に受信されるようにします。SPMスキャナーのユーザー制御フロントネジと電動バックネジを戻すことで、検出器がAFMチップを下げます。倒立顕微鏡を用いて、AFMチップが試料表面に接近する様子を視覚的に監視してください。3本のネジがすべて同じレベルにあることを確認してください。傾いた試料をイメージングした際にアーティファクトが生じるのを避けるため、チップを試料に近づけますが、試料表面に接触したり突き破ったりしない程度の距離を保ってください。窒化シリコン製 AFM プローブを用いたコンタクト AFM モードでは、AFM カンチレバーで反射したレーザー光が可動ミラーで反射し、光検出器へと到達します。ミラーの位置を調整し、ゼロボルト・セットポイントの出力信号電圧を -2 V に、差動信号を 0 V に設定してください。nano scopeソフトウェアを使用します。顕微鏡アイコンをクリックし、適切なプロファイルを選択してください。スキャン制御設定パネルを使用して、スキャン速度とスキャンサイズを設定します。チップエンゲージアイコンをクリックして、AFMチップを試料表面に接触させます。プログラムがSPMベースの電動バックスクリューを制御し、チップが試料表面に接触するまで下降させます。チップの接触が正常に完了すると、スキャンプロセスが自動的に開始されます。ソフトウェアのイメージモードとスコープモードの両方を使用してスキャンプロセスを監視し、記載されたプロトコルに従って、最高の解像度の画像が得られるようパラメータを繰り返し調整してください。例えば、最初は大きなZ軸データスケール値でスキャンを開始します。その後、Zデータスケール値を慎重に下げて、画像上の表面形態のコントラストを最適化します。画像をキャプチャしてデータファイルを保存します。フラットニング関数を用いてデータを処理し、垂直スキャナーのドリフトによる画像の湾曲や、スキャンライン間の垂直オフセットなどの画像アーティファクトを除去します。最後に、平均粗さ（Ra）を算出します。$^{13}\text{C-P-MAS-NMR}$スペクトルでは、31 ppmのワックスピークが漸次的に減少しており、これはクチンバイオポリマーの主要な化学構造を維持したまま、クチクルおよびワックス複合体から表皮および内部のクチクルワックスが順次除去されたことを示している。FM像の解析により、果実クチクルから表皮および内部のクチクルワックスが段階的に抽出されたことで表面の不規則性が明らかになり、クチクルアセンブリの組織的な変化が示唆された。この手法に習熟すれば、トマト果実クチクルからの表皮および内部クチクルワックスの順次除去を2時間で完了させることができる。果皮キューティクルの徹底的な抽出のために溶媒抽出を行う際は、コンタクトノードを使用した後、極性の異なる一連の溶媒を用いることが重要です。ここでは AFM プロトコルを示します。さらに、AFM 実験を用いてキューティクルの表面弾性率を測定することも可能です。このビデオを視聴することで、クチン・ワックス複合体から各成分を系統的に単離する方法、および固体NMRとFMを用いてそれぞれクチクラ材料の分子構造解析および迅速な表面検査を行う方法について、十分に理解することができます。本ビデオで解説する手法により、植物生物学の研究者は、天然および設計された植物組織の分子組成と超分子構造を決定することが可能になります。

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物のキューティクルは、水の保全に主要な役割を持っているだけでなく、病原性微生物のエントリに対して重要な障壁である植物のワックス状の外装です。このビデオでは、我々は前方および逆遺伝学的アプローチによって識別される植物のクチクラの変異体の分析を示しています。...

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

ショウジョウバエの血リンパは、血液と間質液の両方として機能し、幼虫と成虫の段階で全身を循環します。このビデオでは、循環細胞を定量するために幼虫の血リンパを採取するプロトコルについて説明しています。...

キューティクルの混乱:ショウジョウバエの幼虫から血リンパを採取する方法

私たちは、無傷のツリーの師部を保存し、それを観察するための準備をする技術を提供します。 師部組織に生息する節足動物や微生物などの生物を導入・観察するための師部サンドイッチという装置を創製しています。...

ツリー組織内節足動物と微生物群集を研究するための技術

脂質ポリエステルは、植物のキューティクルとスベリンを含む拡散バリアという2つの細胞壁修飾の構造成分を構成しています。この動画では、脱脂した葉全体からクチンを解重合する方法をご紹介します。この方法は、クチンまたはスベリンの生合成で損なわれた変異体の研究に適用することができます。...

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

成体幹細胞の生物学を研究するための理想的なモデルは、マウスの毛包です。ここでは、マウスの背側皮膚の酵素消化とそれに続くFACS分析を使用して、毛包幹細胞と表皮ケラチノサイトの異なる集団を分離するためのプロトコルを紹介します。...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

このプロトコルの目的は、分子生物学、生化学、蛍光活性化細胞選別、一次インビトロ用途(例えば、クロノジェニック)などの様々な下流アプリケーションのために、成体マウスの後皮から表皮ケラチノサイトを分離することです。ケラチノサイト)。...

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

筋骨格損傷に関連する創傷治癒の研究は、しばしば、シュワン細胞(SC)、ケラチノサイト、および線維芽細胞間の インビトロ 相互作用の評価を必要とする。このプロトコルは、ヒト包皮からのこれらの初代細胞の単離、培養、および特性評価を記述している。...

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

様々な光合成生物に関連するプラストグロビュール脂肪滴を単離するための迅速かつ効率的なプロトコルが提示されています。単離されたプラストグロビュールの調製を成功させることは、プロテオミクス解析やリピドミック解析などの詳細な分子調査に先立つ重要な第一歩です。...

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の便利で高スループットの分離と濃縮のためのプロトコルが提示されています。このプロトコルは、液体窒素、ドライアイス、ナイロンふるいのみを使用したトリコームの乾燥した非緩衝抽出に基づいており、RNA抽出およびトランスクリプトーム解析に適しています。...

カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の非水性分離と濃縮

本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

学ぶトマト果実キューティクルの単離と固形NMR・原子間力顕微鏡による生物物理学的解析。エピ・イントラキューティキュラーワックスの選択的除去と架橋能評価の手法を習得できます。

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

さらに動画を探す