Name: 胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ胎児肺細胞におけるメカノトランスダクションの研究法。マウスの胎児肺タイプII上皮細胞と線維芽細胞を分離し、in vitro系で機械的刺激を与える方法を解説。肺発生と損傷の理解に貢献する。

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1。 ECMタンパク質とプレートのコーティング<ol><li>無菌条件下で、プレート当たり冷滅菌1X PBS 12 mlでラミニン120μgを混合します。 </li><li> Bioflex未処理の板を取り、各ウェルに溶液の2ミリリットルを追加します（ラミニンの最終濃度は2μg/ cm 2である）。また、他のECMタンパク質は、コラーゲン-1 [10μgの/ cm 2]と、フィブロネクチン[を5μg/ cm 2]と、ビトロネクチン[0.5μgの個/ cm 2]またはエラスチン[10μgの個/ cm 2]のように、使用することができます。コー​​ティング技術は、それがラミニンコーティングのために説明されているものに似ています。井戸は完全に溶液で覆われていることを確認してください。 </li><li>プラスチック製のプレートをラップし、ウェルの底に吸着ラミニンを可能にするために一晩、平らな面に4℃で置く。まだ良いECMの機能を維持しながら、これらの条件において、プレートは少なくとも1週間保存することができます。 </li><li>翌日、無菌条件下で、1X PBSでウェルを3回洗浄します。 </li><l私は&gt;を各ウェルに1×PBSで1％のBSAを1mlを加え、37℃でインキュベート膜上の非特異的結合部位をブロックするために1hの°C。の</li><li>非吸着タンパク質を除去するために1X PBSでプレートを3回すすいでください。 </li><li>細胞は、ステップ2.14から隔離されるまで37℃DMEM中℃でプレートを保持します。 </li></ol> 2。胎児の齧歯類の肺II型上皮細胞の分離分離前の日は、オートクレーブと準備ができて、異なるサイズのナイロンメッシュを使用して、画面のコップを持っています。 <ol><li>妊娠のE17-19の上でマウス/ラット時限妊婦から胎児肺を取得します。 DMEM培地を含む50 mlのコニカルチューブに組織を移し、氷の上に置きます。 </li><li> 50 mlコニカルチューブに消化バッファーを作成します。（10ミリリットル）。このボリュームには、マウス/ラットから約20胎児からの肺組織が使用されます。 8.5ミリリットルDMEM 0.5ミリリットル500MM pH7.4のHEPES 5 mgのコラゲナーゼ1 5 mgのコラゲナーゼ1A 1ミリリットル鶏血清、不活化熱</li><li>すべてのコンポーネントが、無菌フード内0.2ミクロンのシリンジフィルターを通して溶解し、フィルターされるまでよく混ぜる。 37℃の水浴中で消化緩衝液を含むコニカルチューブ℃を置く</li><li>ステップ2.1からコニカルチューブからDMEM培地を除去し、滅菌シャーレに組織を転送します。 </li><li> 1mm以上の組織片は、以下のように、ステップ2.3から予め温めておいた消化緩衝液を含むコニカルチューブに組織を転送するために滅菌済みのハサミかカミソリの刃でも肺をミンチ。 </li><li>上下にピペッティングによって組織を消化する。 10ミリリットルピペットで100倍 5ミリリットルピペットで100倍 パスツールピペットで100倍</li><li>室温で5分間1300 rpmでホモジネートを遠心分離します。 </li><li>慎重に吸引して上清を除去し、ペレットをDMEMを15ml加え、20％FBSで細胞を含む再懸濁する。 </li><li> 100画面のコップを取り出し、 - 、30 - 、15ミクロンのナイロンメッシュと場所番目滅菌した150mlのビーカーにEM。 </li><li>ステップ2.8から細胞ホモジネートを追加し、順次フィルタ100を介して - 、30 - 、15ミクロンのメッシュスクリーンカップ。 </li><li>非上皮細胞のろ過を容易にするために、DMEM +10％FBSで数回洗浄した後、15ミクロンメッシュ - 凝集30から非濾過し、細胞を収集します。 </li><li>主に線維芽細胞が含まれている15ミクロンメッシュからろ液を捨てる。 </li><li> 30分（フラスコ当たりの細胞懸濁液のapproximatelly10 ml）を75-cm 2のフラスコにステップ2.11から細胞をインキュベートすることにより、さらにII型細胞を精製する。 </li><li>ペレット細胞に室温で5分間1300 rpmで遠心し上清を収集します。 </li><li>慎重に吸引して上清を除去し、ペレットを無血清DMEM中で細胞を含む再懸濁する。再懸濁の量は、処理された組織の量に依存します。およそ、私たちプレートは、細胞と同等の阿智のために（2 ml）を各ウェルに1つの胎児から得られた次の日にコンフルエントに百分の60から70の間で前夜。 </li><li>ラミニンまたはフィブロネクチンでプレコートBioflex 6ウェルプレート上にプレートの細胞懸濁液。 </li></ol> 3。胎児のげっ歯類の肺線維芽細胞の分離<ol><li> 2.11までのII型細胞の単離のために上記と同じ手順に従ってください。 </li><li>線維芽細胞が付着できるようにするために30〜60分間37℃で75-cm 2の上に、プレートを、15ミクロンメッシュ（おおよその体積は10〜15 mlで前洗浄せず）からのろ液を取る。 </li><li> supernantantを吸引除去し、無血清DMEMと交換して、一晩インキュベートする。 </li><li>次の日、0.4mMのEDTAおよびプレートそれらのフィブロネクチンでプレコートBioflexプレート上で0.25％（wt / vol）のトリプシンで細胞を収穫します。 </li></ol> 4。肺細胞に機械的刺激を提供するための実験系<ol><li>種子無血清DMEMでBioflex培養プレート上で細胞（約50％コンフルエント）（2ミリリットル/ウェル）し、それらを添付してSPREう実験前少なくとも6時間の広告。一般的に私たちの研究室では、機械的歪みを適用する前に、約24時間の培養中の細胞を維持しています。特定のセルの数は実験に必要な場合は、分離した後、II型細胞は無血清DMEM 75-cm 2のフラスコと次の日に保持され、細胞をトリプシン処理し、計数し、その後に播種されています。 </li><li>翌日、メディアは新鮮な無血清DMEM（2ミリリットル/ウェル）とbioflexプレートに置き換えられますがFlexcell FX-5000ひずみユニットに搭載されている。単分子膜は、実験の開始前に超えない80％コンフルエントでなければなりません。 </li><li>等二軸ひずみが膜に適用されます。株のレジメンは（説明を参照してください）in vivoでの機械的な力のシミュレーションによって異なります。 </li><li>並列で培養した無延伸膜上に培養した細胞を対照として使用されています。 </li><li>実験の終わりに、単分子膜は、遺伝子発現の変更（例えば、界面活性プロテインCのために）分析するために処理することができますリアルタイム-PCR、ウエスタンブロット法によるタンパク質の豊富さなどによっても、組織化単分子膜は、免疫細胞化学実験のために固定することができます。この手法では、固定した後、シラスティック膜は板から切り出しており、抗体を用いた透過性とインキュベーションの前に取り付け剤としての水の10〜20μlを用いてスライドガラス上にマウントされている。上清はまた、成長因子、サイトカインなどの存在を調査するために使用することができます</li></ol> 5。代表的な結果 E18胎児マウスのII型細胞の図1と図2には、show代表的な位相コントラストの写真は、この原稿で説明する手法を用いて単離された。 図3は、その機械的ひずみがマーカーとして界面活性剤、タンパク質-Cを使って胎児のII型上皮細胞の分化を誘導を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" /> 図1。担当者resentative位相コントラストの写真は、右胎児のII型細胞の凝集外観を示す分離後に撮影。 <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" /> 図2：E18胎児のII型上皮細胞は、ここで説明したように単離され、ラミニンでコーティングされたbioflexプレート上に播種した。無延伸細胞はパラホルムアルデヒドで固定した後の写真は、次の日に撮影された。細胞の純度は90であることが決定された±5％をSP-Cの上皮細胞の形態や免疫染色の顕微鏡分析によって。 <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" /> 図3。胎児II型上皮細胞を16時間40サイクル/分で5％、環状の歪みにさらされた。そのひずみを示す界面活性プロテインC（SP-C）mRNAの発現）ノーザンブロットは、異なるECM基板を用いたII型細胞の分化を誘導する。 + / - 記号は、sへの暴露を表すかどうかそれぞれ電車、。データは+ /を意味するとして表示されます- SEM、n = 3で、* P &lt;0.05 B）蛍光免疫細胞化学画像は機械的ひずみにさらされるかどうか（コントロール）胎児のII型細胞でSP-C蛋白質レベル（緑）を実証する。核はDAPI（青）で対比染色した。バーは、そのメカニカルストレッチを示す3つの実験から10μmである。C）ウェスタンブロットの結果は、SP-C蛋白質を向上させます。 N = 3、* P &lt;0.05。

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利害の衝突が宣言されません。

本稿では、我々は胎児のII型上皮細胞と線維芽細胞を分離し、Flexcellひずみ装置を使用して機械的な刺激にそれらを公開する方法について説明します。我々は、上皮細胞の分化1,2を評価し、受容体とストレッチ3月9日によって活性化シグナル伝達経路を研究するためにこのテクニックを使用しています。さらに、このメソッドはまた、機械的損傷10,11によって誘導される細胞の応答を調査するために使用することができます。手順については、コラゲナーゼと肺組織の消化に基づいています。それは消化した後一緒に凝集し、II型細胞の傾向を利用しています。このテクニックを実行中に重要なステップは、肺の消化を促進するためにも組織ミンチであり、非上皮細胞のろ過を容易にするため、II型細胞の高い純度を達成するために、30および15ミクロンのメッシュ上で徹底的に非フィルタ処理細胞を洗浄。 当研究室では、mを使用していますembranesは、基底膜のECM組成をシミュレートするためにコラーゲンやラミニンでコーティングされた。しかし、細胞は20％の伸びにさらさ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>鶏血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>スクリーンカップ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>100 µm ナイロンメッシュ</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>30 µm メッシュ</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>15 µm メッシュ</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>エラスチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Bioflexプレート</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>非コーティング</td></tr><tr><td>Flexcell Strain Unit</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

反復的な呼吸のような動きによって、流体の膨張によって子宮内で生成された機械的な力は、通常の肺の開発のために重要である。肺開発の主要なコンポーネントは、肺サーファクタントの主要な源、肺胞II型上皮細胞の分化である。これらの細胞はまた、肺胞腔、宿主防御、および損傷修復に体液の恒常性に参加しています。さらに、遠位の肺実質細胞が直接、出生後の機械的人工換気中の誇張されたストレッチを公開することができます。しかし、肺の細胞が肺の開発に影響を与えると肺傷害を促進するために機械的刺激を感知する正確な分子·細胞メカニズムは完全に理解されていません。ここでは、げっ歯類の胎児の肺からのII型細胞と線維芽細胞を単離するためのシンプルかつ高純度のメソッドを提供します。その後、我々は、機械的な力をシミュレートし、胎児の細胞に機械的な刺激を提供するためには、in vitroシステム、Flexcellひずみユニットで説明胎児肺の開発や肺損傷。この実験システムでは、ストレッチにさらされる胎児肺細胞では分子·細胞メカニズムを調べるための優れたツールを提供しています。このアプローチを使用して、私たちの研究室では、胎児の肺の開発と肺傷害にメカノに参加し、いくつかの受容体とシグナル伝達タンパク質を同定しました。

機械的な力は、肺の開発と肺傷害において重要な役割を果たしています。ここでは、げっ歯類の胎児の肺II型上皮細胞と線維芽細胞を分離するとを使用して機械的刺激にそれらを公開する方法について説明します。<em&gt; in vitroで</em&gt;システム。

子宮内で繰り返される呼吸様運動や液体による拡張によって生じる機械的な力は、正常な肺の発達にとって極めて重要である。重要な……

本手順の目的は、胎児肺細胞における機械的刺激受容を研究するための実験系について記述することである。これは、培養プレートを細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることによって行われる。その後、胎児マウス肺の2型上皮細胞を単離し、続いて胎児マウス線維芽細胞を単離する。最終ステップでは、肺細胞に機械的刺激を与えるためのin vitroシステムについて説明します。最終的に、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、および蛍光免疫化学染色画像を通じて、2型細胞の分化の増加を示す結果を得ることができます。これらの手法は、胎児の肺の発達や肺損傷など、メカノトランスダクション（機械的刺激受容）分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。手順の実演は、当研究室の技術者であるJulian guが行います。ラミナーフローフード内で無菌状態で作業を行い、1プレートあたり12 mLの冷製滅菌1×PBSを用いて、120 µgのラミニンを調製します。コーティングには、他の細胞外マトリックスタンパク質を使用することも可能です。詳細は書面によるプロトコルを参照してください。次に、未処理のBioFlexプレートを用意し、最終濃度が2 µg/cm²となるように、各ウェルにラミニン溶液を2 mLずつ加えます。ウェルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。プレート全体をプラスチックラップで完全に覆い、4 °Cの環境下で平らな場所に一晩置いて、ラミネートがウェルの底に吸収されるようにします。コーティング済みプレートは、これらの条件下で少なくとも1週間保存でき、翌日も良好なECM機能を維持します。無菌条件下で、各ウェルを1×PBSで3回洗浄します。次に、1% BSA含有1×PBSを1 mLずつ各ウェルに加えます。膜上の非特異的結合部位をブロックするため、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、ウェルを1 XPBSで3回洗浄します。吸収されなかったタンパク質を除去するため、プレートの各ウェルに1 mLのDMEMを加えます。その後、胎児げっ歯類肺2型上皮細胞の単離が完了し、播種準備が整うまで、プレートを37 °Cで保存します。細胞分離の手順を開始する前日に、130 µmおよび15 µmのナイロンメッシュを用いてスクリーンカップを組み立て、オートクレーブで滅菌します。また、培養当日に、同数の150 mLガラスピークをオートクレーブで滅菌します。妊娠17〜19日のマウスから胎児肺を採取します。組織をDMEA培地を含む50 milliliter遠心チューブに移し、氷上に置きます。書面でのプロトコルのレシピに従い、50 milliliter遠心チューブで新鮮な消化バッファーを調製します。そして、ラミナーフローフード内で作業し、0.2 micronシリンジフィルターでろ過滅菌します。このバッファー10 millilitersで、マウス胎児約20匹分から得られる肺組織を処理するのに十分です。消化バッファーを入れたコニカルチューブを37 °Cのウォーターバスに入れます。胎児肺組織が入ったコニカルチューブから組織を取り出し、滅菌済みハサミまたはカミソリを用いて滅菌済みのシャーレに移し、組織を1 millimeter未満の大きさに細切します。次に、組織をあらかじめ温めておいた消化緩衝液の入ったコニカルチューブに移します。続いて、開口径の小さいピペットを順に使い、胎児肺細胞懸濁液を100回ずつピペッティングして、組織の消化を機械的に促進します。消化プロセスが完了後、ホモジネートを室温で1,300 RPMで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引により慎重に除き、細胞を含むペレットを15 millilitersのDMEM（20%FBS添加）に再懸濁します。続いて、130および15 micronのナイロンメッシュが付いたスクリーンカップを取り出し、滅菌済みの150 milliliterビーカーの上に配置します。細胞ホモジネートを100 micronメッシュ上にピペッティングします。ろ液を回収し、これを30 micronのメッシュ上にピペットで分注します。30 micronのメッシュを、新鮮な10% FBS添加DMEMで数回洗浄します。多くのタイプ2細胞は凝集するため、メッシュを通過しません。これらの洗浄操作により、凝集塊に付着している可能性のある非上皮細胞を除去します。30 µmメッシュでろ過したろ液を、15 µmメッシュのスクリーンカップに適用します。同様に、前述の手順で数回洗浄します。このステップでは、30 µmのメッシュを通り抜けた可能性のあるタイプ2細胞を回収します。タイプ2細胞をさらに濃縮するため、30 µmおよび15 µmのメッシュから凝集した非ろ過細胞を回収してください。胎児マウス肺線維芽細胞を培養する場合は、15 µmメッシュのろ液を保持してください。それ以外の場合は、このろ過液を廃棄します。次に、30µmおよび15µmのメッシュカップでろ過されなかった細胞に培地を加え、75cm²の組織培養フラスコで30分間インキュベートし、タイプ2上皮細胞群をさらに精製します。このインキュベーション後、前述と同様に上清を遠心分離し、細胞をペレット化させ、その後、ペレットを2mLの無血清DMEMに再懸濁します。ラミネートコーティングされたBioFlex 6ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を1mLずつピペッティングします。この時点で、顕微鏡下で観察すると細胞は凝集して見えます。プレートを37°C、5% CO₂に設定した組織培養インキュベーターでインキュベートします。24時間のインキュベーションが最適ですが、最低でも6時間のインキュベーションが必要です。機械的伸展実験を開始する前に、15 µmメッシュでろ過した液を回収し、37 °Cの75 cm²組織培養フラスコに移して30〜60分間静置し、線維芽細胞を接着させます。その後、上清を吸引して廃棄してください。次に、フラスコ内の液量を無血清DMEMに置き換え、一晩インキュベートします。翌日、0.25% trypsimおよび0.4 mM EDTAを用いて細胞を回収し、フィブロネクチンでコーティングしたBioFlexプレートに播種します。機械的伸展実験を開始する前に、37 °C、5% CO2に設定した組織培養インキュベーター内で、理想的には24時間インキュベートしてください。実験に特定の細胞数が必要な場合は、最低6時間のインキュベーションが必要です。単離後、タイプ2細胞は無血清DMEMを用いた75 cm²フラスコで維持し、翌日にトリプシン処理して細胞数を数え、播種します。実験開始前の単層細胞のコンフルエンシーは80%以下である必要があります。機械的刺激実験の当日、細胞培養液を1ウェルあたり2 mLの新鮮な無血清DMEMに交換し、プレートをFlexcell FX-5000ストレインユニットに取り付けます。次に、膜に等方性2軸伸展（EQU biaxial strain）を加えます。伸展のレジメンは、in vivoでの機械的力のシミュレーションに応じて異なります。記述プロトコルで述べた通り、非ST伸展膜上で培養した細胞を使用します。並行して培養したものを実験のコントロールとして使用します。実験終了後、単層細胞を回収し、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の変化や、ウェスタンブロッティングによるタンパク質量の変化を解析することができます。さらに、この手法では、単層細胞を固定して免疫化学実験に用いることも可能です。固定後、透過処理および抗体とのインキュベーションを行う前に、アスタティック膜をプレートから切り出し、10〜20 µLの水を封入剤として使用してガラススライドにマウントします。実験で得られた上清は、成長因子やサイトカインなどの放出物質の存在を調べるためにも使用できます。この画像は、本プロトコルに従って単離し、ラミニンでコーティングしたBioFlexプレートに播種した、ホルマリン固定済みのE 18胎児型タイプ2上皮細胞を示しています。細胞を固定し、写真を撮影した。非ST伸展の翌日に細胞を播種した。上皮細胞の形態による顕微鏡解析およびサーファクタントタンパク質Cの免疫染色により、細胞の純度は90 ± 5%であることが確認された。以下の図は、40 cycles per minuteで5%の周期的な歪みに16時間さらした胎児型2型上皮細胞のデータである。このサーファクタントプロテインC mRNA発現のノーザンブロットは、異なるECM基質を用いて、伸展刺激がII型細胞の分化を誘導することを明らかにしています。「+」および「-」の記号は、それぞれ伸展刺激への曝露ありと曝露なしを表しています。発現データはヒストグラムにて平均値 ± SEMとして示されており、N = 3、アスタリスクはP値 < 0.05であることを示しています。これらの蛍光免疫化学染色の画像は、サーファクタントプロテインCのタンパク質レベルを緑色で示しています。左側の機械的刺激を受けていない胎児型2型細胞と、右側の機械的刺激を受けた細胞において、核をDAPIで対比染色しており、青色に表示されています。このヒストグラムは3回の実験によるウェスタンブロットの結果を定量化したものであり、機械的伸展によってサーファクタントプロテインCのタンパク質レベルが上昇することを示しています。この実験では、Nは3であり、アスタリスクはP値が0.05未満であることを示しています。このビデオを視聴することで、胎児肺細胞を培養し、機械的な伸展にさらす方法について十分に理解できるはずです。

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