胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

本手順の目的は、胎児肺細胞における機械的刺激受容を研究するための実験系について記述することである。これは、培養プレートを細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることによって行われる。その後、胎児マウス肺の2型上皮細胞を単離し、続いて胎児マウス線維芽細胞を単離する。

最終ステップでは、肺細胞に機械的刺激を与えるためのin vitroシステムについて説明します。最終的に、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、および蛍光免疫化学染色画像を通じて、2型細胞の分化の増加を示す結果を得ることができます。これらの手法は、胎児の肺の発達や肺損傷など、メカノトランスダクション（機械的刺激受容）分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

手順の実演は、当研究室の技術者であるJulian guが行います。ラミナーフローフード内で無菌状態で作業を行い、1プレートあたり12 mLの冷製滅菌1×PBSを用いて、120 µgのラミニンを調製します。コーティングには、他の細胞外マトリックスタンパク質を使用することも可能です。詳細は書面によるプロトコルを参照してください。次に、未処理のBioFlexプレートを用意し、最終濃度が2 µg/cm²となるように、各ウェルにラミニン溶液を2 mLずつ加えます。

ウェルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。プレート全体をプラスチックラップで完全に覆い、4 °Cの環境下で平らな場所に一晩置いて、ラミネートがウェルの底に吸収されるようにします。コーティング済みプレートは、これらの条件下で少なくとも1週間保存でき、翌日も良好なECM機能を維持します。

無菌条件下で、各ウェルを1×PBSで3回洗浄します。次に、1% BSA含有1×PBSを1 mLずつ各ウェルに加えます。膜上の非特異的結合部位をブロックするため、37 °Cで1時間インキュベートします。

次に、ウェルを1 XPBSで3回洗浄します。吸収されなかったタンパク質を除去するため、プレートの各ウェルに1 mLのDMEMを加えます。その後、胎児げっ歯類肺2型上皮細胞の単離が完了し、播種準備が整うまで、プレートを37 °Cで保存します。

細胞分離の手順を開始する前日に、130 µmおよび15 µmのナイロンメッシュを用いてスクリーンカップを組み立て、オートクレーブで滅菌します。また、培養当日に、同数の150 mLガラスピークをオートクレーブで滅菌します。妊娠17〜19日のマウスから胎児肺を採取します。

組織をDMEA培地を含む50 milliliter遠心チューブに移し、氷上に置きます。書面でのプロトコルのレシピに従い、50 milliliter遠心チューブで新鮮な消化バッファーを調製します。そして、ラミナーフローフード内で作業し、0.2 micronシリンジフィルターでろ過滅菌します。

このバッファー10 millilitersで、マウス胎児約20匹分から得られる肺組織を処理するのに十分です。消化バッファーを入れたコニカルチューブを37 °Cのウォーターバスに入れます。胎児肺組織が入ったコニカルチューブから組織を取り出し、滅菌済みハサミまたはカミソリを用いて滅菌済みのシャーレに移し、組織を1 millimeter未満の大きさに細切します。

次に、組織をあらかじめ温めておいた消化緩衝液の入ったコニカルチューブに移します。続いて、開口径の小さいピペットを順に使い、胎児肺細胞懸濁液を100回ずつピペッティングして、組織の消化を機械的に促進します。消化プロセスが完了後、ホモジネートを室温で1,300 RPMで5分間遠心分離します。

次に、上清を吸引により慎重に除き、細胞を含むペレットを15 millilitersのDMEM（20%FBS添加）に再懸濁します。続いて、130および15 micronのナイロンメッシュが付いたスクリーンカップを取り出し、滅菌済みの150 milliliterビーカーの上に配置します。細胞ホモジネートを100 micronメッシュ上にピペッティングします。

ろ液を回収し、これを30 micronのメッシュ上にピペットで分注します。30 micronのメッシュを、新鮮な10% FBS添加DMEMで数回洗浄します。多くのタイプ2細胞は凝集するため、メッシュを通過しません。

これらの洗浄操作により、凝集塊に付着している可能性のある非上皮細胞を除去します。30 µmメッシュでろ過したろ液を、15 µmメッシュのスクリーンカップに適用します。同様に、前述の手順で数回洗浄します。

このステップでは、30 µmのメッシュを通り抜けた可能性のあるタイプ2細胞を回収します。タイプ2細胞をさらに濃縮するため、30 µmおよび15 µmのメッシュから凝集した非ろ過細胞を回収してください。胎児マウス肺線維芽細胞を培養する場合は、15 µmメッシュのろ液を保持してください。

それ以外の場合は、このろ過液を廃棄します。次に、30µmおよび15µmのメッシュカップでろ過されなかった細胞に培地を加え、75cm²の組織培養フラスコで30分間インキュベートし、タイプ2上皮細胞群をさらに精製します。このインキュベーション後、前述と同様に上清を遠心分離し、細胞をペレット化させ、その後、ペレットを2mLの無血清DMEMに再懸濁します。ラミネートコーティングされたBioFlex 6ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を1mLずつピペッティングします。この時点で、顕微鏡下で観察すると細胞は凝集して見えます。プレートを37°C、5% CO₂に設定した組織培養インキュベーターでインキュベートします。24時間のインキュベーションが最適ですが、最低でも6時間のインキュベーションが必要です。

機械的伸展実験を開始する前に、15 µmメッシュでろ過した液を回収し、37 °Cの75 cm²組織培養フラスコに移して30〜60分間静置し、線維芽細胞を接着させます。その後、上清を吸引して廃棄してください。次に、フラスコ内の液量を無血清DMEMに置き換え、一晩インキュベートします。翌日、0.25% trypsimおよび0.4 mM EDTAを用いて細胞を回収し、フィブロネクチンでコーティングしたBioFlexプレートに播種します。機械的伸展実験を開始する前に、37 °C、5% CO2に設定した組織培養インキュベーター内で、理想的には24時間インキュベートしてください。

実験に特定の細胞数が必要な場合は、最低6時間のインキュベーションが必要です。単離後、タイプ2細胞は無血清DMEMを用いた75 cm²フラスコで維持し、翌日にトリプシン処理して細胞数を数え、播種します。実験開始前の単層細胞のコンフルエンシーは80%以下である必要があります。機械的刺激実験の当日、細胞培養液を1ウェルあたり2 mLの新鮮な無血清DMEMに交換し、プレートをFlexcell FX-5000ストレインユニットに取り付けます。

次に、膜に等方性2軸伸展（EQU biaxial strain）を加えます。伸展のレジメンは、in vivoでの機械的力のシミュレーションに応じて異なります。記述プロトコルで述べた通り、非ST伸展膜上で培養した細胞を使用します。

並行して培養したものを実験のコントロールとして使用します。実験終了後、単層細胞を回収し、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の変化や、ウェスタンブロッティングによるタンパク質量の変化を解析することができます。さらに、この手法では、単層細胞を固定して免疫化学実験に用いることも可能です。

固定後、透過処理および抗体とのインキュベーションを行う前に、アスタティック膜をプレートから切り出し、10〜20 µLの水を封入剤として使用してガラススライドにマウントします。実験で得られた上清は、成長因子やサイトカインなどの放出物質の存在を調べるためにも使用できます。この画像は、本プロトコルに従って単離し、ラミニンでコーティングしたBioFlexプレートに播種した、ホルマリン固定済みのE 18胎児型タイプ2上皮細胞を示しています。

細胞を固定し、写真を撮影した。非ST伸展の翌日に細胞を播種した。上皮細胞の形態による顕微鏡解析およびサーファクタントタンパク質Cの免疫染色により、細胞の純度は90 ± 5%であることが確認された。以下の図は、40 cycles per minuteで5%の周期的な歪みに16時間さらした胎児型2型上皮細胞のデータである。

このサーファクタントプロテインC mRNA発現のノーザンブロットは、異なるECM基質を用いて、伸展刺激がII型細胞の分化を誘導することを明らかにしています。「+」および「-」の記号は、それぞれ伸展刺激への曝露ありと曝露なしを表しています。発現データはヒストグラムにて平均値 ± SEMとして示されており、N = 3、アスタリスクはP値 < 0.05であることを示しています。

これらの蛍光免疫化学染色の画像は、サーファクタントプロテインCのタンパク質レベルを緑色で示しています。左側の機械的刺激を受けていない胎児型2型細胞と、右側の機械的刺激を受けた細胞において、核をDAPIで対比染色しており、青色に表示されています。このヒストグラムは3回の実験によるウェスタンブロットの結果を定量化したものであり、機械的伸展によってサーファクタントプロテインCのタンパク質レベルが上昇することを示しています。

この実験では、Nは3であり、アスタリスクはP値が0.05未満であることを示しています。このビデオを視聴することで、胎児肺細胞を培養し、機械的な伸展にさらす方法について十分に理解できるはずです。