胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

機械的な力は、肺の開発と肺傷害において重要な役割を果たしています。ここでは、げっ歯類の胎児の肺II型上皮細胞と線維芽細胞を分離するとを使用して機械的刺激にそれらを公開する方法について説明します。

この手順の目的は、胎児の肺細胞における機械的形質導入を研究するための実験システムを説明することです。これは、培養プレートを細胞外マトリックスタンパク質でコードすることによって達成されます。次に、マウスの胎児肺2型上皮細胞を単離し、続いてマウスの胎児線維芽細胞を単離します。

最後のステップでは、肺細胞に機械的刺激を与えるin vitroシステムについて説明します。最終的には、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、蛍光免疫化学画像を通じて、2型細胞分化の増加を示す結果を得ることができます。これらの方法は、胎児の肺の発達や肺の損傷など、メカノ形質導入分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるジュリアン・グーです 無菌条件下で層流フードで作業している間、120マイクログラムのラミニンと12ミリリットルの冷たく滅菌された1つのXPBSをプレートごとに作ります。他の細胞外マトリックスタンパク質をコーティングに使用してもよい。詳細については、書面によるプロトコルを参照し、BioFlex未処理プレートを取り、各ウェルに2ミリリットルのラミネート溶液を加えて、1平方センチメートルあたり2マイクログラムの最終濃度にします。

ウェルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。プレートをラップで完全に覆い、ラミネートがウェルの底に吸収されるように、摂氏4度の環境で一晩平らな面に置きます。コーティングされたプレートは、これらの条件下で少なくとも1週間保存でき、翌日も良好なECM機能を保持しています。

無菌条件下で、1つのXPBSでウェルを3回洗浄します。次に、それぞれに1つのXPBSに1ミリリットルの1%BSAを追加します。37°Cで1時間インキュベートし、メンブレン上の非特異的結合部位をブロックします。

次に、1つのXPBSでウェルを3回洗います。吸収されないタンパク質を除去するには、プレートの各ウェルに1ミリリットルのDMEMを追加します。次に、胎児のげっ歯類肺型2つの上皮細胞が分離され、プレーティングの準備が整うまで、プレートを摂氏37度で保存します。

細胞単離手順を開始する前日に、130ミクロンと15ミクロンのナイロンメッシュでスクリーンカップを組み立て、オートクレーブ滅菌します。また、培養の日に同じ数の150ミリリットルのガラスピークをオートクレーブします。妊娠のE 17から19に時限妊娠マウスから胎児の肺を取得します。

DMEA培地が入った50ミリリットルの遠心チューブに組織を移し、氷の上に置きます。書かれたプロトコルのレシピに従って、50ミリリットルの遠心分離管で新鮮な消化緩衝液を作成します。また、層流フードフィルターで作業しながら、0.2ミクロンのシリンジフィルターで滅菌します。

この緩衝液の10ミリリットルは、約20人のマウス胎児から得られる肺組織に十分です。消化緩衝液が入った円錐管を摂氏37度の水浴に入れます。胎児の肺組織を含む円錐形のチューブからジウムをAsateし、滅菌ハサミまたはかみそりの刃を使用して組織を滅菌ペトリ皿に移し、組織を1ミリメートル未満のサイズに細かく刻みます。

次に、組織を予温消化バッファーを含む円錐管に移します。次に、開口部のサイズが小さくなったピペットを使用して、胎児の肺細胞懸濁液をそれぞれ100回上下にピペッティングすることにより、組織の消化を機械的に補助します。消化プロセスが完了したら、ホモジネートを室温で5分間、1,300RPMで遠心分離します。

次に、吸引によって仰臥位を慎重に除去し、細胞を含むペレットを15ミリリットルのDMEMと20%FBSに再懸濁します。次に、130ミクロンと15ミクロンのナイロンメッシュを備えたスクリーンカップを取り出し、滅菌済みの150ミリリットルビーカーの上に置きます。細胞ホモジネートを100ミクロンメッシュにピペットで移します。

ろ液を回収し、これを30ミクロンメッシュにピペットで移します。30ミクロンのメッシュを新しいDMEMと10%FBSで数回洗います。タイプ2のセルのほとんどは凝集し、メッシュを通過しません。

これらの洗浄液は、塊に付着している可能性のある非上皮細胞を除去します。30ミクロンメッシュから15ミクロンメッシュスクリーンカップに濾液を塗布します。再度、前回と同様に数回洗います。

このステップでは、30ミクロンメッシュを通過した可能性のあるタイプ2の細胞をリクルートします。凝集したろ過されていない細胞を30ミクロンおよび15ミクロンのメッシュから収集し、さらに2型細胞を濃縮します。胎児のげっ歯類の肺線維芽細胞を培養する場合は、15ミクロンメッシュから濾液を保持します。

それ以外の場合は、この濾液を廃棄します。もう。このインキュベーション後、30ミクロンと15ミクロンのメッシュカップから30ミクロンと15ミクロンのメッシュカップから非ろ過細胞をインキュベートし、このインキュベーション後30分間、スーパーネームを遠心分離することにより、2型上皮細胞集団を精製し、細胞を脱ペレット化し、その後、ペレットを2ミリリットルの血清フリーDMEMプロ胎児ピペットで再懸濁します 細胞懸濁液1ミリリットルをラミネートコーティングの各ウェルにこの時点でBioFlex 6ウェルプレートは、顕微鏡で観察すると細胞が塊状に現れ、37°Cおよび5%二酸化炭素に設定された組織培養インキュベーターでプレートをインキュベートします。24時間のインキュベーションが最適で、最低6時間のインキュベーションが必要です。

機械的ひずみ実験を開始する前に、15ミクロンメッシュから濾液を取り出し、摂氏37度の75平方センチメートルの組織培養フラスコに30〜60分間移し、線維芽細胞が付着、吸引、およびセートを廃棄できるようにします。次に、フラスコ内の容量を無血清DMEMに交換し、一晩インキュベートします。翌日、0.4ミリモルEDTA中の0.25%トリプシンで細胞を採取し、フィブロネクチンでコーティングされたBioFlexプレートにプレートし、摂氏37度と二酸化炭素5%に設定された組織培養インキュベーターでインキュベートします。理想的には、機械的ひずみ実験を開始する前に24時間。

実験に特定の数の細胞が必要な場合は、最低6時間のインキュベーションが必要です。2型細胞は、単離後、無血清DMEM 75平方センチメートルフラスコで維持され、翌日、細胞はトリプス初期化され、カウントされ、その後、着座した単層は、実験の開始前に80%以下のコンフルエントでなければなりません。機械的刺激実験の日に、細胞培養培地をウェルあたり2ミリリットルの新鮮な無血清DMEMに交換し、プレートをフレックスセルFX 5、000ひずみユニットに取り付けます。

次に、膜にEQU二軸ひずみを加えます。ひずみのレジメンは、in vivoでの機械的力のシミュレーションによって異なります。書面によるプロトコルで説明したように、細胞は非ST伸張膜上で増殖します。

並行して培養したものを実験のコントロールとして使用します。実験の最後に、単分子膜をプロセシングして、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の変化やウェスタンブロットによるタンパク質存在量の変化を解析することができます。さらに、この手法の免疫化学実験のために単層を固定することができます。

固定後、プレートから僧種膜を取り出し、10〜20マイクロリットルの水を装着剤としてスライドガラスにマウントした後、抗体を透過してインキュベートします。実験で得られたスーパーダチンは、成長因子やサイトカインなどの放出物質の存在を調べるためにも使用できます。この画像は、このプロトコルと同様に単離され、ラミニンでコードされたBioFlexプレートに播種されたパルマル固定E 18胎児型2の上皮細胞を示しています。

セルを固定し、写真を撮りました。非STストレッチ細胞を播種した翌日。細胞の純度は、界面活性剤タンパク質Cの上皮細胞形態と免疫染色の上皮細胞形態の顕微鏡分析により、90±5%であると決定されました。

この界面活性剤タンパク質C mRNA発現のノーザンブロットは、株が異なるECM基質を使用して2型細胞分化を誘導することを示しています。プラスマイナス記号は、それぞれひずみへの曝露またはひずみへの曝露なしを表します。式データは、ヒストグラムでは平均プラスまたはマイナスのSEMとして表示され、Nは3に等しく、アスタリスクは0.05未満のP値を示します。

これらの蛍光免疫化学画像は、界面活性剤タンパク質Cタンパク質のレベルを緑色で示しています。胎児型では、左側で機械的ひずみにさらされず、右側核で機械的ひずみにさらされた2つの細胞を、青色に見えるdapiで対比染色しました。このヒストグラムは、機械的伸縮が界面活性剤タンパク質Cタンパク質のレベルを増加させることを示す3つの実験からのウェスタンブロット結果を定量化したものです。

この実験では、Nは3に等しく、アスタリスクは0.05未満のP値を示します。このビデオを見た後、胎児の肺細胞を加速し、それらを機械的伸張にさらす方法についてよく理解しているはずです。