成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

このMY two Hシステムは、従来の酵母ツーハイブリッド法を改良したもので、偽陽性の数を大幅に減少させることができます。まず、ベイトプラスミドを酵母に小規模形質転換します。競合阻害剤スクリーンを用いてベイト構築物を検証した後、minus fourプレートでcDNAライブラリーのスクリーニングを行います。

XGLおよびレポーターアッセイを用いて陽性クローンの検証を行います。次に、DNAシーケンシングとバイオインフォマティクス解析により、相互作用する可能性のあるタンパク質を同定します。最終的に、この改良された酵母ツーハイブリッドシステムにより、スクリーニングプロセスの効率と成功率が大幅に向上します。

従来の酵母ツーハイブリッド法は、偽陽性を多く生成することで知られています。本動画では、ツーハイブリッド解析における特異性を大幅に向上させた、改良後のスクリーニング手順をご紹介します。それでは始めていきましょう。

50 mLのYPDに、MAV 2 0 3の5 mLオーバーナイト培養液を接種します。30 °Cで2〜4時間培養します。その後、遠心分離により酵母を回収し、1回洗浄した後、ペレットを2 mLの溶液1に再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。

形質転換用のDNAミックスを調製します。酵母細胞を100 µL加え、よく混ぜ合わせます。次に、溶液2を700 µL加え、よく混ぜ合わせます。

まず30 °Cで30分間インキュベートし、その後ヒートショックを行います。続いて、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを200 µLのオートクレーブ滅菌蒸留水に再懸濁させます。この懸濁液を段階希釈し、SD LUプレートに塗布して30 °Cで2〜3日間インキュベートします。このステップにより、ベイトプラスミドが転写を活性化すること、およびこの自己活性化がhis3遺伝子産物の競合的阻害剤である3-ATなどの阻害剤によって中和されることを確認します。

まず、ベイトプラスミドをMAV 2 0 3酵母に形質転換します。反応液をSD LUプレートに塗布し、30 °Cでインキュベートします。3-AT誘導による自己活性化を示すコロニーをスクリーニングするため、オートクレーブ済みのピックを用いて、各形質転換コロニーを3-ATの濃度を段階的に高めたSD LU hissプレートにパッチし、30 °Cでインキュベートします。

100 millimolar 3-ATを含むプレートで生育するベイト株は、reのツーハイブリッドスクリーニングに使用するのに適さないため、除外します。残りのベイトについては、CD NAライブラリースクリーニングに使用するため、細胞増殖を抑制する最低濃度の3-ATを選択します。ベイトプラスミドを含む酵母の単離コロニーを数個、100 microlitersのオートクレーブ滅菌蒸留水に懸濁させます。これを2枚の10 centimeter SD LUプレートに塗布します。

両方のプレートを30 °Cでインキュベートします。細胞をスクレイパーで回収し、10 mLに完全に懸濁させます。蒸留水をオートクレーブ滅菌し、500 mLの液体YPD培地に接種します。

スペクトル、光度測定、および30 °Cでの培養により細胞密度を確認します。その後、遠心分離により細胞を回収します。100 mLのオートクレーブ滅菌蒸留水で1回洗浄し、次いで50 mLの溶液1で1回洗浄します。

次に、ペレットを2.5 millilitersの溶液1で再懸濁します。そこに、変性した剪断済みサケ精子DNAと、ピペッティングで緩やかに混合したCD NAライブラリを加えます。その後、40%polyethylene glycolを含む15 millilitersの溶液2を加えます。

緩やかに混合し、700 µLずつ25本のオートクレーブ済み1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。30 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートした後、42 °Cのウォーターバスで15分間のヒートショックを行います。

遠心分離により細胞を回収し、各ペレットを400 µLのオートクレーブ滅菌蒸留水で穏やかに再懸濁します。各形質転換混合物を2枚の選択プレートに播種し、反応プレートの形質転換効率を対照的に推定するため、30 °Cで5〜10日間培養します。1つの反応液の段階希釈を行います。

30 °Cで3日間インキュベートした後、全コロニー数を測定します。コロニーをYPDプレートに転写し、30 °Cで一晩インキュベートします。その後、気泡が入らないように注意しながら、円形のニトロセルロースメンブレンをYPDプレートに直接貼り付けます。

1分後、すべてのコロニーがメンブレンに転移していることを確認します。メンブレンのコロニー側を上に向けた状態でアルミ箔のボートに配置し、液体窒素の表面に20秒間置きます。その後、液体窒素に数分間浸します。

次に、メンブレンを取り出して解凍します。その間に、新鮮なXCA溶液を染み込ませたアマン紙を入れたペトリ皿を準備します。その後、解凍したメンブレンを慎重に浸し、37 °Cでインキュベートします。

青色のコロニーが出現するまで待ちます。獲物（prey）、クローン、およびベイト構築物を酵母に導入し、反応させることで、偽陽性をさらに排除できます。まず、相互作用するタンパク質を含んでいる可能性がある酵母株からプラスミドDNAを単離します。

DNAをe coli DH5αに形質転換し、LBアンピシリンプレートでの増殖により選択します。制限酵素分析によって形質転換体をスクリーニングします。次に、preyおよびbaitプラスミドを酵母MAV203に共形質転換し、SC-Leu-Trpプレートに塗布して30°Cで2〜3日間培養します。

xalアッセイシーケンスを実施するために3つの異なるコロニーを選択し、陽性クローンのプラスミドDNAから遺伝子を同定し、バイオインフォマティクスを用いて解析します。本実験では、脳のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのベイトとして、成長因子pro Granulinを使用し、54個の陽性クローンを得ました。

250万個の形質転換体の中から、pro granulinベイトを用いてスクリーニングを行い、候補を単離した。さらにex skullアッセイによる解析を行った結果、pro granulinベイトに対して23個の陽性クローン候補が特定された。

興味深いことに、シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析によりTNF R2が特定されました。実際に、さらなる機能実験によって、プログラニュリンがTNF受容体の新規リガンドであることが確認されました。このビデオを視聴することで、目的のベースを用いてこの改変酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行う方法について、十分に理解できるはずです。

使用する一部の領域には危険が伴うため、必ず手袋を着用して作業してください。実験の成功をお祈りします。