Name: 成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ改良酵母ツーハイブリッドシステムを用いたProgranulin相互作用タンパク質の同定法。偽陽性を大幅に削減し、遺伝学的スクリーニングの効率と信頼性を向上させる実験手法を解説します。

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この作品は、NIHの研究助成K01AR053210、R01AR061484と国立乾癬財団からの助成金によって賄われていた。

1。背景情報酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質-タンパク質相互作用16、17を発見するのに使用される強力な遺伝学的手法です。などのLexA -ベースのシステム、SOSの募集システム、および細菌または哺乳類細胞ベースの2 - ハイブリッドとして2 - ハイブリッドシステム、、いくつかの種類が市販されている、この論文では特に、最も一般的に使用されるGAL4ベースの変更に焦点を当てて酵母2 - ハイブリッドシステム。簡単に言えば、法はDNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインから構成される酵母のGAL4タンパク質の性質に基づいています。獲物のタンパク質がGAL4活性化ドメイン（AD）への融合体として発現している間、baitタンパク質は、GAL4 DNA結合ドメイン（DNA - BD）の融合として表現さ​​れます。餌と獲物の融合タンパク質間の相互作用は、酵母のGに統合されているレポーター遺伝子を含むGAL4結合部位の転写アクティベーションにつながるenome。 Y2Hの原理を図に示します。 1と実験手順を図にまとめられている。 2。 2。必要な材料とソリューション<ol><li> YPD培地（ペプトンのブレンド、酵母エキス、およびほとんどのサッカロマイセスセレビシエ菌を成長させるための最適な割合でブドウ糖）。 </li><li>最小限の合成定義（SD）塩基は酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、及び炭素源を含む最小のSDベース（、デキストロース。ドロップアウト（DO）サプリメントは、指定を欠く合成、定義された培地を作るためのMinimal SD Baseに追加することができます。栄養素）。 </li><li>レイ/ - Trpをドロップアウト（DO）サプリメント（ロイシンおよびトリプトファンを除く全ての必須アミノ酸を含む） </li><li> -His/-Leu/-Trp/-Uraドロップアウト（DO）サプリメント（ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン、およびウラシルを除くすべての必須アミノ酸を含む） </li><li>ルリア培地（LB）（トリプトン10g / L、酵母エキス5g / L、塩化ナトリウムを5g / L） </li><li> X- ギャル（5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β- D -ガラクトピラノシド）ソリューション：Nで20 mg / mlのストック溶液として調製し、N -ジメチルホルムアミド</li><li> 10X TE（100mMトリス- HCl（pH 7.5）を、10mMのEDTA、オートクレーブ処理したもの） </li><li>超音波処理したニシンやサケ精子DNA、ゆで（10 mg / ml）を</li><li> 10X LiAc（1 M酢酸リチウム、オートクレーブ処理したもの） </li><li> 50％PEG - 3350ソリューション、フィルター滅菌</li><li> 3 - アミノ-1、2、4 - トリアゾール（3AT） </li><li>カナマイシン</li><li>アンピシリン</li><li> ELECTROMAXDH5α細胞</li><li> Zバッファ：16.1グラムNa2HPO4 7H2O（または8.52グラム無水）、H2O 5.5グラムリン酸二水素ナトリウム（または4.8 ganhydrous）、0.75グラムのKCl、0.246グラム硫酸マグネシウム7H2O（または0.12グラム無水）、1リットルのオートクレーブ、蒸留水に溶解して調整pH 7.0の。 </li></ol> 3。餌の世代（pDBLeu - PGRN） シグナルペプチド（aa21 - 588）を欠いているcDNA断片のエンコーディングPGRNは、方向的に、pDBLeuベクトルのSalI -をNot I部位（ProQuestのツーハイブリッドシステム、Invitrogen）にクローニングしたpDBLeu - PGRNを生成するためのGAL4 DNA結合ドメインと同様の翻訳読み枠を保持。 <ol><li>インフレーム融合を可能にする制限部位を（3&#39;末端サル5&#39;末端にIおよびNot I）を含むように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRにより、上記のPGRNのcDNA断片を増幅する。 </li><li>ゲルPCR産物を精製し、制限付きダイジェストはSalIとはI.エンドヌクレアーゼ 同一の制限エンドヌクレアーゼによる二重制限消化によりDBベクトルpDBLeuを準備します。 </li><li>線形化pDBLeuベクターに制限PGRN断片をライゲーションし、25μg/ mlのLB +カナマイシンのための選択とDH5αに変身。 </li><li> DNAシークエンシングでは構成要素の修正を確認してください。 </li></ol> 4。プラスミド餌の小スケール変換<ol><li> Mav203（Invitrogen社）のコロニーをYPDの5 mlを接種し、30℃一晩振とう℃を</li><li> YPD 50mlに一晩培養を希釈する。アドインを拡大itional 2〜4時間。 </li><li>室温で5分間3000rpmでペレットは、細胞。オートクレーブ、蒸留水40mlにペレットを再懸濁する。 </li><li>再ペレット細胞。私は、RTで10分間でインキュベート溶液2mlに再懸濁します。 溶液I：0.5ミリリットル10xLiAc、0.5ミリリットル10xTE、4ミリリットルH 2 O </li><li> pDBLeu - PGRNの2-3μL（0.25μg/μl）と変性剪断サケ精子DNA（10μg/μl）10μlの：チューブにDNAを分注する。 100μlの酵母細胞を追加して、よく混ぜる。 </li><li> 700μl溶液IIを追加、よく混ぜる。 30℃で30分間インキュベートします。 II液：0.2ミリリットル10xLiAc、0.2ミリリットル10xTE、1.6ミリリットル50パーセントPEG3350。 </li><li> 42℃のヒートショック℃で15分間。 </li><li> 2分間ペレット。上清を捨てる。 200μlのオートクレーブ、蒸留水でペレットを再懸濁する。 </li><li>段階希釈によるSD - Leuのプレート上にサスペンションプレート。 2〜3日、30℃でインキュベートする。 </li></ol> 5。餌の検証いやを行う前に自己活性化し、HIS3レポーター遺伝子の基底発現レベルを決定するためのSTツーハイブリッドスクリーニング、テストpDBLeu - PGRN。このテストでは、餌が転写を活性化するかどうかと自己活性化は阻害剤によって中和することができるかどうかを決定します。 3 -アミノ-1、2、4 -トリアゾール（3 - AT）は、HIS3 -遺伝子産物の競合阻害剤であり、ヒスチジン欠乏培地での増殖に必要なHIS3の発現の最小レベルを滴定するために使用することができます。 <ol><li>酵母Mav203ひずみ、プレートSD - Leuのプレートに変換にpDBLeu - PGRNを変換し、そして30℃で48〜72時間インキュベート℃に</li><li>にオートクレーブつまようじを使用して、各形質転換からのパッチのコロニーSD - LEU -彼の10mMの濃度で3 - ATを含むプレート、25mMの、50mMの、75mMの、及び100mM。 - AT 3は3 - ATの存在下で増殖できるようになるHIS3酵素と自己活性化を示す唯一の餌の競合的阻害剤です。 </li><li>プレートcontainiに成長する餌株NGの100mM 3 - ATは、ツーハイブリッドスクリーンでの使用には適していません。使用できる餌のために、最低3 - AT濃度の細胞増殖を阻害します。多くの場合、3 - ATの25mMのスクリーニングに使用されます。 </li></ol> 6。 cDNAライブラリーのスクリーニングプラスミドpDBLeu - PGRNは、上述したように小規模の変換を使用してMaV203に導入される。 MaV203（pDBLeu - PGRN）にpPC86 -ライブラリ（Invitrogen）を導入するため、手順は以下のとおり、通常、プラスミドライブラリーDNAの0.5μgで〜4 × 10 4コロニーが得られます。したがって、2.5 × 10 6の酵母形質転換体は、〜30.0μgのpPC86 - cDNAライブラリープラスミドDNA、25の変換、五十10cmのプレート（SD - Leuの- TRP -彼の浦3 AT）が必要になります。 <ol><li>プレート（下の手順のための50）に10cmのSD - Leuの- TRP -彼の浦3の適切な数を準備します。また、形質転換体の数を推定するために少なくとも4つの10cmのSD - LEU - Trpプレートを準備。 </li><li>ライブラリへの変換下記の手順に従ってpDBLeu - PGRNを含むMaV203。 <ol><li> 〜100μlのオートクレーブ、蒸留水でMaV203のいくつかの単離されたコロニー（pDBLeu - PGRNを）中断して、10cmのSD - Leuのプレートの上にそれらを広げ。第二SD - Leuの板のための手順を繰り返します。 30℃で18〜24時間の両方のプレートをインキュベート℃に</li><li>削ると完全に10ミリリットルオートクレーブ、蒸留水で細胞を懸濁する。 〜0.1のOD 600を与えるためにフラスコ内の液体YPD培地500mlに細胞懸濁液の十分なボリュームを追加します。 </li><li> ODは、接種後〜0.1であることを確認してください。 </li><li> OD 600が約0.4に達するまで30℃で振とうする。 </li><li>新鮮な準備： <ol type="a"><li> 11ミリリットル10X TE、11ミリリットル10X LiAc、および88ミリリットルオートクレーブ水を組み合わせることにより、110ミリリットル1 × TE / LiAc。 </li><li> 1.6ミリリットル10X TE、1.6ミリリットル10X LiAc、および12.8ミリリットルの50％PEG - 3350を組み合わせることで、16ミリリットルPEG / LiAc。 </li></ol></li><li>室温で5分間、3000グラムで、細胞を回収します。 </li><li> tを捨てる彼は清と穏やかに、室温で100ミリリットルオートクレーブ、蒸留水でピペッティングでペレットを再懸濁します。 </li><li>室温で5分間3000gで遠心する。 </li><li>遠心分離細胞の上清を捨て、50 mlの1X TE / LiAc溶液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>室温で5分間3000gで遠心する。 </li><li>上清を取り除くと2.5 mlの1X TE / LiAc溶液の最終体積でペレットを再懸濁します。 </li><li> 25の変換を実行します。 2.5ミリリットルの細胞、125μlの（10μg/μl）変性剪断サケ精子DNA、および30μgのcDNAライブラリーを組み合わせる。ピペッティングにより穏やかに混合。 15ミリリットルPEG / LiAcソリューションを加え、穏やかに混ぜる。 700μlを各25オートクレーブした1.5​​ mlのマイクロ遠心チューブに分注し。 </li><li> 30 ° Cの水浴中で30分間インキュベート。 </li><li> 42℃の水浴中で15分間熱ショック。 </li><li>室温で1分間6,000 × gで遠心する。慎重にスーパーを削除する上清。優しく上下にピペッティングすること400μlのオートクレーブ、蒸留水でそれぞれのペレットを再懸濁します。 </li></ol></li><li>プレートシングル10cmのSD - Leuの- TRP -彼の浦3 AT（3AT濃度：25mM）を上に各形質転換から200μlの形質転換混合物スプレッドのバーを使用してプレートには、その25は、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに50プレートを作ることができるオートクレーブ（SD - Leuの- TRP -彼の浦+3 AT）。 </li><li> 30℃で5-10日間培養する℃を</li><li>反応の形質転換効率を推定するために、一つの反応（1:40、1:400と1:4000）の連続希釈液をSD - Leuの- TRPプレート上にプレーされています。 30℃で3日間Cインキュベートした後、コロニー数を計数し、形質転換体の総数が計算されます。 </li></ol> 7。 X - galアッセイ<ol><li> YPDプレートにコロニーを移し、30℃で一晩。 </li><li>場所は、YPDプレート上にニトロセルロース膜を丸め、膜とYPDプレートの間に気泡がないことを確認してください。 1〜2分、MA後のKEは、必ずすべてのコロニーは、膜（ニトロセルロース紙）に転送されます。 </li><li>アルミ箔の紙で作られたボートで膜のコロニー側を上に置きます。 </li><li>液体窒素中にメンブレンを入れ、数分のために液体窒素中に20秒、と水没を待つ。 </li><li>雪解けに膜を取り出して。 </li><li>一方、以下の試薬を混ぜる。 1.5ミリリットルZバッファ 20μlのX - galを（20 mg / ml）を</li><li>その上に場所ワットマン濾紙、ペトリ皿の中でZバッファー/ X - galを削除します。 </li><li>ワットマン濾紙の上にニトロセルロース紙を慎重に置きます。 </li><li>青色のコロニーが現れるまで37℃でインキュベートする。 </li></ol> 8。再変換アッセイライブラリーのスクリーニングから単離された獲物の融合タンパク質（AD - Y）は、酵母に餌の融合タンパク質との相互作用（DB - X）レポートの遺伝子を誘導するために、そして獲物のクローンと餌の構造の再変換を維持する必要がありますさらに偽陽性を排除し、追加を容易にすることができますitional分析。 <ol><li>潜在的に相互作用するタンパク質を含む酵母菌株からプラスミドDNAを単離する。 </li><li>大腸菌にDNAを変換DH5α細胞を、プレートLB 100μg/ mlのアンピシリンプレート上での変換が選択的にpPC86 - cDNAライブラリーを分離し、37℃で一晩インキュベートする℃まで</li><li> LB 100μg/ mlのアンピシリンをスープに入れてプレートからいくつかのコロニーを選択してください。 </li><li>ミニプレップDNAを準備およびSal IおよびNot Iで二重制限分析により確認し</li><li>共同変換、MaV203に獲物がプラスミドと餌プラスミドプレートSC - LEU - Trpプレート上で形質転換混合物、および30℃で2-3日インキュベート℃に</li><li> SC - Leuの- TRPプレートから3つの異なるコロニーを選択、X - galアッセイを行います。 </li></ol> 9。シーケンシングとバイオインフォマティクス解析シーケンス可能性が真の陽性クローンから単離されたプラスミドDNAは、BLAを使用してGenBankのものにこれらのシーケンスを比較するSTプログラム、および既知の遺伝子に対応するこれら二つのハイブリッドクローンを識別する。配列データは、上記で得られた12陽性の二つが​​細胞表面TNFR2（;アク＃NM_130426 TNFRSF1B/CD120b）であることを示した。さらに、PGRNとTNFRとの間の相互作用は、インビトロ固相結合アッセイ、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴分析、およびフローサイトメトリーアッセイ14を含む様々なタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを、使用して検証した。 10。代表的な結果スクリーニングのフローチャートを図で説明されています。 3。通常は50から100までの正のクローンの候補者は、この段階で得られます。我々は、最初にPGRN餌でスクリーニング250万形質転換体のうち54陽性クローンの候補を単離した。陽性クローンの候補は、X - galアッセイを行うことにより検証した。通常は、約50％の偽陽性クローンは、X - galアッセイを介して削除されます。私たちは、率直な23の陽性クローンを得<html> PGRNの餌（ 図4）のためのこのステップでATES。獲物のクローンと酵母に餌の構造の再変換は、さらに、まだレポーター遺伝子は、おそらく真の陽性を表すアクティブに偽陽性とクローンを排除する。通常は、約50％の陽性クローンの候補が削除されます。我々は最終的に酵母におけるPGRNと相互作用する12個の陽性クローンを単離した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig1.jpg" /> 図酵母ツーハイブリッドシステム1。原理<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig2.jpg" /> 図2酵母ツーハイブリッドシステムを用いたタンパク質結合パートナーを同定するのパイプライン<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig3.jpg" /> スクリーニング酵母ツーハイブリッドライブラリの図3。フローチャート。rge.jpg&quot;ターゲット=&quot;_blank&quot;&gt;この画像のフルサイズバージョンを表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig4.jpg" /> 陽性クローンの候補の図4。β-ガラクトシダーゼアッセイ。ライブラリ画面から得られる、陽性クローンをYPDプレートに移し、30℃で一晩インキュベートした; Bは、YPDプレート上のすべてのコロニーをニトロセルロース膜に転写し、β-ガラクトシダーゼアッセイは、実施した。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、タンパク質の相互作用16、17を同定する際に有効なツールであることが証明されている。このような生化学的共精製とプロテインチップなどの蛋白質 - 結合パートナーを同定するための他のアプローチと比較して、酵母ツーハイブリッドシステムは、比較的単純な実験でコード配列の非常に高い数字をスクリーニングに用いることができる敏感な遺伝学的アプローチであり、でさらには、それはin vivoでの相互作用で検出し、複雑なタンパク質の精製を必要としません。もちろん、酵母ツーハイブリッドシステムは、例えば、必要な翻訳後修飾、不十分なフォールディングおよび/または融合タンパク質の安定性、および変更された細胞内局在の不在を制限があります（タンパク質が核に運ばれ、このしているかもしれない）実際の生理的状態ではない。さらに、レポーター遺伝子、例えば、自己活性化、のスプリアス活性を示すタンパク質は、直接餌CDをスクリーニングするための餌として使用することはできません。NAライブラリ。この欠点を克服するために、個々の機能ドメインの代わりに、無傷のタンパク質は、通常、無傷のタンパク質で、様々な...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> ProQuestのツーハイブリッドシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD培養液</td><td>クロンテック</td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD寒天培地</td><td>クロンテック</td><td> 630410 </td></tr><tr><td>最小限のSD寒天ベース</td><td>クロンテック</td><td> 630412 </td></tr><tr><td> - Leuのは、サプリメントのDO </td><td>クロンテック</td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp DOの補足</td><td>クロンテック</td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura DOの補足</td><td>クロンテック</td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3 - アミノ-1,2,4 - トリアゾール（3AT） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A8056 </td></tr><tr><td>ルリア培地（LB） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X - Galを</td><td>インビトロジェン</td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td>超音波処理サケ精子DNA </td><td>ストラタジーン</td><td> 201190 </td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td>サブクローニングの効率™DH5α™コンピテントセル</td><td>インビトロジェン</td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ®ベース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T6066 </td></tr><tr><td>リチウム酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L4158 </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> ED </td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜</td><td> Bio - Rad社</td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10cmのペトリ皿</td><td> ITIサイエンティフィック</td><td> CT - 903 </td></tr><tr><td>インキュベーター（30℃） </td><td> ATR（Ecotron） </td><td></td></tr></table>

成長因子progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

またgranulin epithelin前駆体（GEP）として知られているProgranulin（PGRN）は、、593アミノ酸のオートクリン増殖因子です。 PGRNは、初期胚発生、創傷治癒1、炎症2、3、および宿主防御4を含む生理と病気のプロセス、さまざまな重要な役割を果たすことが知られている。神経栄養因子5、PGRNタンパク質の原因と前頭側頭型認知症6、7の部分的な損失をもたらすPGRN遺伝子の変異としてPGRNも機能します。私たちの最近の研究では、軟骨の開発と劣化8月11日の重要な調節因子としてPGRNの分離につながっている。 PGRNは、ほぼ二十年前に発見されたものの、、複数の生理学的および病理学的条件にPGRNのアクションを活用し、関与するメカニズムを理解する努力を大幅に結合受容体（複数可）を識別するために、私たちの無力によって妨げられているが決定的な役割を果たしている。この問題に対処するために、我々は修正を開発fied酵母ツーハイブリッド（MY2H）が最も一般的に使用されるGAL4ベースの2 - ハイブリッドシステムに基づくアプローチ。従来の酵母ツーハイブリッドスクリーンと比較して、MY2Hは劇的に画面のプロセスを短縮し、偽陽性クローンの数を減らすことができます。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性であり、そして我々が正常にイオンチャネル12、細胞外マトリックスタンパク質10、13、および成長因子14を含む様々なベイトの結合タンパク質を、単離することにこのシステムを採用している。本稿では、最初に知られてPGRN関連受容体14,15としてTNFR2の同定につながった例として、PGRNを用いて詳細にこのMY2H実験手順を説明します。

我々は、従来の酵母ツーハイブリッドスクリーニング、タンパク質相互作用の同定に効果的な遺伝的なツールを変更しました。この変更は著しく、プロセスを短縮する作業負荷を軽減、そして最も重要なのは、偽陽性の数を減らします。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性です。

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

プログラニュリン（PGRN）は、グラニュリン・エピテリン前駆体（GEP）としても知られており、593個のアミノ酸からなるオートクリン増殖因子である。PGRNは、重要な役割を果たすことが知られており...

このMY two Hシステムは、従来の酵母ツーハイブリッド法を改良したもので、偽陽性の数を大幅に減少させることができます。まず、ベイトプラスミドを酵母に小規模形質転換します。競合阻害剤スクリーンを用いてベイト構築物を検証した後、minus fourプレートでcDNAライブラリーのスクリーニングを行います。XGLおよびレポーターアッセイを用いて陽性クローンの検証を行います。次に、DNAシーケンシングとバイオインフォマティクス解析により、相互作用する可能性のあるタンパク質を同定します。最終的に、この改良された酵母ツーハイブリッドシステムにより、スクリーニングプロセスの効率と成功率が大幅に向上します。従来の酵母ツーハイブリッド法は、偽陽性を多く生成することで知られています。本動画では、ツーハイブリッド解析における特異性を大幅に向上させた、改良後のスクリーニング手順をご紹介します。それでは始めていきましょう。50 mLのYPDに、MAV 2 0 3の5 mLオーバーナイト培養液を接種します。30 °Cで2〜4時間培養します。その後、遠心分離により酵母を回収し、1回洗浄した後、ペレットを2 mLの溶液1に再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。形質転換用のDNAミックスを調製します。酵母細胞を100 µL加え、よく混ぜ合わせます。次に、溶液2を700 µL加え、よく混ぜ合わせます。まず30 °Cで30分間インキュベートし、その後ヒートショックを行います。続いて、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを200 µLのオートクレーブ滅菌蒸留水に再懸濁させます。この懸濁液を段階希釈し、SD LUプレートに塗布して30 °Cで2〜3日間インキュベートします。このステップにより、ベイトプラスミドが転写を活性化すること、およびこの自己活性化がhis3遺伝子産物の競合的阻害剤である3-ATなどの阻害剤によって中和されることを確認します。まず、ベイトプラスミドをMAV 2 0 3酵母に形質転換します。反応液をSD LUプレートに塗布し、30 °Cでインキュベートします。3-AT誘導による自己活性化を示すコロニーをスクリーニングするため、オートクレーブ済みのピックを用いて、各形質転換コロニーを3-ATの濃度を段階的に高めたSD LU hissプレートにパッチし、30 °Cでインキュベートします。100 millimolar 3-ATを含むプレートで生育するベイト株は、reのツーハイブリッドスクリーニングに使用するのに適さないため、除外します。残りのベイトについては、CD NAライブラリースクリーニングに使用するため、細胞増殖を抑制する最低濃度の3-ATを選択します。ベイトプラスミドを含む酵母の単離コロニーを数個、100 microlitersのオートクレーブ滅菌蒸留水に懸濁させます。これを2枚の10 centimeter SD LUプレートに塗布します。両方のプレートを30 °Cでインキュベートします。細胞をスクレイパーで回収し、10 mLに完全に懸濁させます。蒸留水をオートクレーブ滅菌し、500 mLの液体YPD培地に接種します。スペクトル、光度測定、および30 °Cでの培養により細胞密度を確認します。その後、遠心分離により細胞を回収します。100 mLのオートクレーブ滅菌蒸留水で1回洗浄し、次いで50 mLの溶液1で1回洗浄します。次に、ペレットを2.5 millilitersの溶液1で再懸濁します。そこに、変性した剪断済みサケ精子DNAと、ピペッティングで緩やかに混合したCD NAライブラリを加えます。その後、40%polyethylene glycolを含む15 millilitersの溶液2を加えます。緩やかに混合し、700 µLずつ25本のオートクレーブ済み1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。30 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートした後、42 °Cのウォーターバスで15分間のヒートショックを行います。遠心分離により細胞を回収し、各ペレットを400 µLのオートクレーブ滅菌蒸留水で穏やかに再懸濁します。各形質転換混合物を2枚の選択プレートに播種し、反応プレートの形質転換効率を対照的に推定するため、30 °Cで5〜10日間培養します。1つの反応液の段階希釈を行います。30 °Cで3日間インキュベートした後、全コロニー数を測定します。コロニーをYPDプレートに転写し、30 °Cで一晩インキュベートします。その後、気泡が入らないように注意しながら、円形のニトロセルロースメンブレンをYPDプレートに直接貼り付けます。1分後、すべてのコロニーがメンブレンに転移していることを確認します。メンブレンのコロニー側を上に向けた状態でアルミ箔のボートに配置し、液体窒素の表面に20秒間置きます。その後、液体窒素に数分間浸します。次に、メンブレンを取り出して解凍します。その間に、新鮮なXCA溶液を染み込ませたアマン紙を入れたペトリ皿を準備します。その後、解凍したメンブレンを慎重に浸し、37 °Cでインキュベートします。青色のコロニーが出現するまで待ちます。獲物（prey）、クローン、およびベイト構築物を酵母に導入し、反応させることで、偽陽性をさらに排除できます。まず、相互作用するタンパク質を含んでいる可能性がある酵母株からプラスミドDNAを単離します。DNAをe coli DH5αに形質転換し、LBアンピシリンプレートでの増殖により選択します。制限酵素分析によって形質転換体をスクリーニングします。次に、preyおよびbaitプラスミドを酵母MAV203に共形質転換し、SC-Leu-Trpプレートに塗布して30°Cで2〜3日間培養します。xalアッセイシーケンスを実施するために3つの異なるコロニーを選択し、陽性クローンのプラスミドDNAから遺伝子を同定し、バイオインフォマティクスを用いて解析します。本実験では、脳のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのベイトとして、成長因子pro Granulinを使用し、54個の陽性クローンを得ました。250万個の形質転換体の中から、pro granulinベイトを用いてスクリーニングを行い、候補を単離した。さらにex skullアッセイによる解析を行った結果、pro granulinベイトに対して23個の陽性クローン候補が特定された。興味深いことに、シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析によりTNF R2が特定されました。実際に、さらなる機能実験によって、プログラニュリンがTNF受容体の新規リガンドであることが確認されました。このビデオを視聴することで、目的のベースを用いてこの改変酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行う方法について、十分に理解できるはずです。使用する一部の領域には危険が伴うため、必ず手袋を着用して作業してください。実験の成功をお祈りします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

神話では、モデル生物出芽酵母で発現されるタンパク質間の過渡と安定な相互作用を高感度に検出することができます。それが正常にハイスループットな方法でそれらの相互作用パートナーを同定するために、外因性および酵母内在性膜タンパク質の研究に適用されています。...

スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール

有能な膜貫通型受容体のシグナリング小説を同定するためのハイコンテンツスクリーニング方法が記載されている。この方法は、大規模な自動化に適しているとの予測を可能にする...

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

このビデオでは、特定のタンパク質の自己相互作用を検出するための酵母2ハイブリッドアッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質は、β-ガラクトシダーゼ酵素をコードする転写因子の2つのドメインにタグ付けされます。2つのタンパク質が相互作用すると、転写と翻訳が酵素を形成し、生化学的アッセイを使用して検出されます。...

酵母細胞におけるタンパク質自己会合を決定するための酵母2ハイブリッドアッセイ

このビデオでは、標的DNAと相互作用する複数のタンパク質を検出する改変酵母ワンハイブリッドアッセイを実演します。形質転換酵母細胞は、レポーター遺伝子の上流に標的DNA配列を含んでいます。さらに、転写因子タンパク質を発現します。タンパク質が複合体を形成し、標的DNAに結合すると、レポーター遺伝子が発現し、酵素的に検出することができます。...

ヘテロメアタンパク質複合体-DNA相互作用を検出するための改変酵母-Oneハイブリッドアッセイ

この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用​​して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツー​​ハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。...

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体（PXR）の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。...

相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。...

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

本明細書に記載の改変酵母一ハイブリッドアッセイは、任意の機能的ゲノミクス研究のための異種系におけるヘテロメリックタンパク質複合体-DNA相互作用を研究および検証するための古典的酵母一ハイブリッド（Y1H）アッセイの延長である。...

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

酵母 2 ハイブリッド スクリーンのバッチ処理は、獲物の融合蛋白質の非常に複雑なセットを持つ複数の餌の蛋白質の相互作用のプロファイルの直接比較のためことができます。ここでは、我々...

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

タンパク質間相互作用などの生体分子の相互作用は、生体機能の分子基盤です。特に関連する相互作用を欠く相互作用ヌル/障害のある変異体を分離できれば、この相互作用の機能を理解するのに大いに役立ちます。この記事では、interaction-null/障害のある変異体を効率的に分離する方法を紹介します。...

Yeast Two-Hybrid Assayを用いたInteraction-Null/Impaired Mutantsの単離

学ぶ改良酵母ツーハイブリッドシステムを用いたProgranulin相互作用タンパク質の同定法。偽陽性を大幅に削減し、遺伝学的スクリーニングの効率と信頼性を向上させる実験手法を解説します。

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

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