マウス肺樹状細胞の分離

この手順の全般的な目的は、高度に精製されたマウス肺樹状細胞調製物を得ることにあります。これは、まず排泄リンパ節を含まずに肺組織を回収し、次にコラゲナーゼ消化によって単一細胞懸濁液を得ることで達成されます。

次のステップでは、磁気細胞分離システムを用いてCD 11 C陽性細胞を濃縮します。次に、フローサイトメトリーによるセルソーティングを用いて、従来の樹状細胞サブセットを単離します。最終的に、マウス肺組織から単離された従来の樹状細胞を、フローサイトメトリーおよび光学顕微鏡で解析できます。

この手法は、呼吸器系における自然免疫および感染症における従来型樹状細胞サブセットの関与はどのようなものであるかなど、免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるIssa Lancelinと私が行います。マウスを安楽死させた後、腹膜の外皮を切開し、慎重に剥離して胸腔を露出させることから始めてください。

肋骨をカットして横隔膜を開き、心臓と肺の両方を露出させます。心臓と肺が露出したら、灌流処置を開始できます。5 mLのシリンジにEDTA-HBSSを満たし、25Gの針をシリンジに接続します。

次に、注入中の漏出を防ぐため、針を右心室に挿入します。ピンセットを用いて、針周囲の心筋組織を固定します。その後、一定の圧力を維持しながら、溶液をゆっくりと注入します。

正確に灌流が行われると、肺が膨張し、色がピンクまたは白に変化します。潜在的な汚染を避けるため、ドレナージリンパ節を取り除いて廃棄してください。その後、肺組織を採取し、切除した臓器を氷上のペトリ皿に移します。GentleMax Cチューブに5 mLの肺コラゲナーゼ消化液を満たし、肺を細かく刻みます。

カミソリを使用して、組織をチューブに移し、緩やかな最大解離（max dissociation）を行います。単一細胞懸濁液を得るために、プログラムM lung zero oneを選択します。次に、サンプルを37°Cで30分間インキュベートし、5分ごとにチューブを振って組織断片を再懸濁させ、プログラムM lung zero twoに進みます。

次に、サンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、4°Cで335 ×g、10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットに2 mLのCK溶血バッファーを加え、室温で1分間置いて残りの赤血球を溶血させます。その後、0.5% BSAを添加した冷PBS 13 mLで細胞を洗浄します。

上清を捨てた後、このペレットを5 mLの冷PBS + BSAで再度懸濁し、細胞液を100 µmのナイロンメッシュでろ過します。最後に、トリパンブルー排除法により総細胞数を決定します。GentleMACS解離装置を使用する代わりに、15 mLコニカルチューブに肺1個あたり5 mLのコラゲナーゼ溶液を満たします。

細切した肺組織をチューブに加え、37 °Cで1時間インキュベートします。組織片を再懸濁させるため、15分ごとにボルテックスミキサーで撹拌します。その後、3 mLシリンジに20Gの針を装着し、サンプルを6〜8回繰り返し通過させることで、消化組織を破砕します。

操作中に気泡が入らないように注意します。まず、単一細胞懸濁液を4°C、200 ×g で10分間遠心洗浄し、上清を捨てます。その後、細胞を400 µL の分離バッファーで再懸濁します。

0.5 µgの抗CD163抗体を用いて、10^8個の全細胞に対してFC介在性の非特異的抗体結合をブロックします。細胞を4°Cで30分間プレインキュベートします。冷やした分離バッファー10 mLで細胞を洗浄した後、細胞をさらに400 µLの分離バッファーに再懸濁します。次に、10^8個の全細胞にCD11cマイクロビーズ100 µLを加え、よく混ぜ合わせ、細胞とビーズの溶液を冷蔵庫内で15分間インキュベートします。

10 mLの冷 separation bufferで未結合のビーズを除去した後、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの冷 separation bufferで再懸濁します。最後に、サンプルをAutoMax pro separatorにロードし、CD 11 C発現細胞分画を回収するためにP-O-S-S-E-L-Dプログラムを実行します。

濃縮したCD 11 C陽性細胞懸濁液を、anti CD 11 C PEI sevenおよびこれらの細胞上のMHC Class Two分子に対する抗体とともに、4 °Cで30分間インキュベートします。冷PBS + BSAで細胞を洗浄した後、0.5 mLのPBS + BSAに細胞を再懸濁し、40 µmナイロンメッシュフィルターに通します。最後に、精製したCD 11 C陽性細胞を、後で定量を行うための個別のブランクチューブ（fax tube）に分注します。

精製された細胞へのダメージを防ぐため、5 mL コレクションチューブに 100 µL の PBS + BSA を加えます。フィルター処理した細胞懸濁液を FACS でソートし、細胞ソートの全過程を通じて回収細胞を冷蔵状態で保持します。これらの密度プロットでは、脾臓において肺の 3 倍以上の従来型樹状細胞が認められます。さらに、肺の CD11c 陽性細胞には、従来型樹状細胞ゲート外の MHC Class II low 群に示される、従来型樹状細胞ではない細胞集団が含まれています。

この密度プロットの図の左側に見られるように、CD11cによる全肺細胞の磁気分離により、従来型樹状細胞の数は全細胞の約1.5%から約16.5%に増加します。しかしながら、CD11c陽性MHC Class II lowのマクロファージが依然として全細胞集団の70%以上を占めており、分離プロセスのこの段階では、濃縮された肺従来型樹状細胞サブセットの純度が著しく低下しています。一方、FACSによるソーティングを行うことで、右上顕微鏡写真に見られるように、従来型樹状細胞の純度は96%以上に向上します。CD11c high MHC Class II highの従来型樹状細胞は、典型的な樹状突起を持つ円形の細胞であるのに対し、右下顕微鏡写真に見られるCD11c high MHC Class II lowの細胞は、マクロファージの形態により特有な細胞突起を示しています。

この手順を行う際は、肺組織および単一細胞調製物を指定の温度で取り扱うことが重要です。これは、細胞生存率および標準的な樹状細胞の回収率を維持するために不可欠です。このビデオを視聴することで、マウスの肺から樹状細胞サブセットを分離する方法について十分に理解できるはずです。

肺樹状細胞サブセットの単離は、呼吸器系病原体や、肺における宿主免疫応答を誘発し得る環境因子に対するこれらの細胞の機能について知見を得るための、非常に有用な手法となります。