Name: マウス肺樹状細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶマウス肺樹状細胞の分離法。コラゲナーゼ消化と磁気細胞分離、フローサイトメトリーによる細胞選別を用いて、高純度の従来型樹状細胞を取得する方法です。免疫学研究に有用です。

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著者らは、顕微鏡との彼の援助のための細胞選別とピーターモットラムと彼女の助けのためにLSUのフローサイトメトリーコアファシリティーでマリリンディートリッヒに感謝したいと思います。この作品は、フライトアテンダント医学研究所、LSU -競争的研究プログラム賞、およびNIH / NIAID助成金P20 RR020159とR03AI081171によって資金を供給された。

1。肺血流と、単一の細胞懸濁液<ol><li>大腿静脈を経由してケタミン/キシラジン麻酔の混合物（1mg /マウスケタミン1.8では、キシラジン0.19）と放血の腹腔内注射したマウスを安楽死させる</li><li>カットと軽く腹膜の外側の皮を引き戻すことによって胸腔を公開。心臓と肺の両方を公開するために、胸郭を切断してダイアフラムを開くに進みます。 </li><li> EDTA - HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まないHBSSで1mMのEDTA）を充填した5mlの注射器を使って静かに肺を灌流。 25 Gの針を接続し、右心室に針を挿入する。注入時の漏れを防ぐために、鉗子を使用して針の周囲心筋組織を固定します。一定の圧力を維持しながらゆっくりとソリューションを注入する。正確な血流は肺の膨張とピンク/白への色の変化になります。 </li><li>この組織からの潜在的な汚染を破棄するように所属リンパ節を削除します。 </li><li>収集肺組織では、氷の上でペトリ皿に移し、カミソリの刃を使用して、小さな断片に切り刻む。 </li><li>を5 ml /コラゲナーゼ消化液の肺を含むgentleMACS C管に接地された組織を転送する（コラゲナーゼタイプ1Aは0.5 mg / mlのプラスIV型ウシ膵臓のDNase 20 5％FBS、100 U / mlペニシリンおよび100μg/mlを含むHBSSでμg/ mlの/ mlのストレプトマイシン）。 </li><li>単一の細胞懸濁液を得るためにgentleMACSのdissociatorを使用してください。 m_lung_01：プログラムを選択してください。 30分間37℃でサンプルをインキュベートする。組織片を懸濁するためにチューブを5分ごとに振る。プログラムm_lung_02に進みます。 </li><li> 4で335 x gで10分間、15mlコニカルチューブと遠心分離機にサンプルを移す℃にこのステップの後、4で全ての試薬と遠心分離を維持° Cは、細胞の生存率の低下を防止する。 </li><li>上清を捨て、室温で1分間ACK溶解緩衝液2 mlを加え、残りの赤血球を溶解する。 13で細胞を洗浄4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃のミリリットル</li><li>コー​​ルドPBS/0.5％のBSAの5mlに上清、再懸合計セルを廃棄し、100μmのナイロンメッシュを徹底的に渡します。 </li><li>トリパンブルー排除色素を使用して、総細胞数を決定します。 </li></ol> 2。磁気分離とCD11c +細胞の濃縮<ol><li> 4℃で200 × gで10分間、単一の細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 10 8合計のセルごとに分離バッファー400μlの再懸濁し細胞ペレット（PBS、0.5％BSA、および2mM EDTA）。 4℃で30分間anti-CD16/CD32抗体（0.5μg/ 10 6細胞）を使用して、結合ブロックのFcを介する非特異的抗体℃に</li><li> 4で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心を10ml℃で細胞を洗浄分離バッファー400μlで細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 8あたりのCD11cマイクロビーズを100μlを加え</SUP&gt;の合計のセルを。よく混ぜ、冷蔵庫で15分（2〜8℃）インキュベートする。 </li><li> 4℃で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心の10mlで細胞を洗浄し、上清を捨てる。 </li><li>冷分離緩衝液3mlで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>プログラムのposseldを選択することにより、autoMACS ProのTMのセパレータを使用して磁気分離を実行します。陽性画分（0.5 ml）を収集する。 </li></ol> 3。従来の樹状細胞（CDC）の分離<ol><li>抗CD11c PE - Cy7とanti-IA/IE（MHC - II）- FITC抗体で30分間、4℃でインキュベートし、濃縮CD11c陽性細胞懸濁液抗体の最適化された濃度は、細胞の0.5μg/ 10 6です。 </li><li> 4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃で細胞を洗浄再懸PBS/0.5％BSAを0.5mlの中の細胞と40μmのナイロンメッシュを介してそれらを渡す。 </li><li>に進んでください純度のモードでFACSのアリアのセルソーターを使用してセルを並べ替える。精製された細胞の損傷を防止するためにコレクションチューブにPBS/0.5％BSAを100μlのを追加。細胞選別のプロセスを通して冷蔵温度であなたの細胞を保つ。 </li></ol> 4。単一の細胞懸濁液およびCD11c +細胞の濃縮を取得するための代替プロトコル<ol><li> gentleMACSのdissociatorの交換では、ステップ1.5から接地肺組織は、37℃で1時間肺とインキュベートあたりのコラゲナーゼ溶液5 mlを入れた15 mlコニカルチューブに移すことができる渦は、細胞が15分ごとに組織断片を再懸濁するため。 inとout 20 Gの針に接続して、3 mlの注射器を介してサンプルを6-8回を渡すことによって、組織を混乱させる。プロセス中に泡を避ける、特に細胞の生存率が低下します。単一の細胞懸濁液が得られれば、1.8に進みます。 </li><li> AutoMACSPro TM separaの交換でTorは、樹状細胞の細胞の濃縮のための磁気分離は、また、2つのMACSカラムを介して手動で細胞懸濁液を渡すことで実行できます。適切な列の選択は、サンプルサイズが異なります。 </li></ol> 5。代表的な結果： 肺CDCは、CD11cはハイ / MHC - II ハイの細胞集団として同定されています。図に示す。 1は、CDCは、脾臓（4.8％）などのいくつかの他の組織に比べて1.4％の小さな割合を表しています。しかし、脾臓とは対照的に、肺のCD11c陽性細胞は、CDCとは異なる細胞集団を含む、MHC - IIの異なる量を表現する。単一細胞調製後、全肺の細胞の細胞収率はわずか1％以上がCDCのサブセットを表す、そこから60〜70パーセントの生存率と3.8から3.0程度× 10 7細胞/肺であった。この割合は、総肺CDCは約10 tをインクリメントされた樹状細胞の磁気分離後に増加したオリジナルの準備（図2A）からのIME（&gt; 16％）。しかし、MHC - II（CD11cはHI / MHC - II LO、マクロファージ）の少量を表現するCD11cは細胞が肺CDCのサブセットと混合され、高汚染の細胞集団（&gt; 70％）を表す。図に示す。 2B、それらの細胞は、CDCの純度は&gt; 96％に達した細胞選別工程後に除去した。全体の手順の後にCDCの通常の収率は5 × 10 4細胞/肺であった。顕微鏡写真は、代表的な樹状突起（上のパネル）と丸い細胞としてCDCの形態的特徴を示す。一方、CD11cはハイ / MHC - II LOは、マクロファージ（Mφ、下のパネル）12の典型的な細胞の突起を示す形態学的に異なるサブセットを表す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> マウスの肺及び脾臓で図1の差動DC周波数 。肺C57BL / 6マウスからNDの脾臓組織をコラゲナーゼで収集し、処理した。コラゲナーゼ消化後、細胞を抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCで染色した。代表的なフローサイトメトリープロットでは、肺と脾臓におけるCDCの割合（CD11cはHI / MHC - II ハイ ） を示す。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> （2）マウスの肺からCDCの分離。マウスの肺の単一細胞の懸濁液を抗CD11cマイクロビーズで標識し、自動細胞分離装置を通過した。）代表的なプロットは、CDCの割合を示す図 （樹状細胞ハイ / MHC - II HI）とマクロファージ（Mφ、CD11cはハイ / MHC - II LO）CD11cは濃縮後の集団。濃縮分画のさらなる染色は、抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCを使用して続く。二重陽性細胞をソートし、フローサイトメトリーによって分析した。へのその形態を特定する、セルが変更されたライト-ギムザ染色でサイトスピンし、染色した。B）代表プロットは、細胞選別後のCDCおよびMφの割合を示す。顕微鏡写真では肺CDCと肺のMφの代表画像を示す。バー=20μmのスケール。

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
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<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

肺マウスDCの分離は、呼吸器の刺激の広い範囲の研究のための重要なテクニックです。これらの細胞を得る工程は、細胞の喪失だけでなく、細胞の生存と純度を防ぐための重要な手順が含まれています。コレクションの前に肺を灌流しても、末梢細胞を排除するだけでなく、汚染物質の赤血球を削減することができます。肺の多数が処理されるときに自動化された解離の使用はadvanteogusことができる、そうでなければ、手動で行う際にコラゲナーゼ消化後の組織の分散が優しく実行されるべきであることを念頭に置きつつ、別のプロトコルを選ぶことができます。肺組織の潜伏期間は、コラゲナーゼ溶液中に指示されたインキュベーション時間を超えて拡張されるべきではない。このステップの後、残りのプロセスは、細胞死を減らすために氷冷緩衝液と冷凍遠心機を使用して行う必要があります。混入赤血球の溶血は、よりトン繰り返されるべきではないステップです全体のプロセス中にハン倍。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を渡し、指示された手順で、セルソーターの目詰まりだけでなく、細胞の純度が損なわれる細胞凝集体を減少させるのを防ぐために重要です。単離された細胞のin vitroでのさらなる文化...

<table width="200" border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> ACK溶解緩衝液</td><td>インビトロジェン</td><td> D6 - 0005DG </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスのCD11c（HL3） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 5580979 </td><td> PE - Cy7共役</td></tr><tr><td>抗マウスIA / IE（269） </td><td> BD - Pharmingen社</td><td> 553623 </td><td>共役FITC </td></tr><tr><td> Collangenaseタイプ1A </td><td>シグマ</td><td> 9891 - 500mgの</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340、352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11cは（N418）マイクロビーズ</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>シグマ</td><td> D5025 - 150KU </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES緩衝液</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿は60mm </td><td> BDファルコン</td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS™Cチューブ</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td>ジェントルMACS dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS - Pro™の</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCSアリア</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

マウス肺樹状細胞の分離

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

肺の樹状細胞（DC）は、侵入病原体の1,2と同様に気道の免疫寛容の回答3の制御でのセンシングにおいて重要な役割を果たします。肺の樹状細胞の少なくとも3つの主要なサブセットは、マウスで記載されている：従来のDC（CDC）4、形質DC（PDC）5とIFN -産生キラーDC（IKDC）6,7。 CDCのサブセットは、肺8で最も顕著なDCのサブセットです。 DCサブセットを識別するために知られている一般的なマーカーは、CD11cは、I型も単球、マクロファージ、好中球およびいくつかのB細胞9上に発現される膜貫通インテグリン（β2）です。一部の組織では、マウスDCを識別するマーカーとして樹状細胞を使用すると、ほとんどのCD11c +細胞は主要組織適合遺伝子複合体クラスII（MHC - II）の高レベルを表すCDCのサブセットを表す脾臓、のように、有効です。しかし、肺はものより異質な組織であるサイドDCサブセットは、MHC - IIの低レベルの試合CD11cは高レベルの表現の異なる細胞集団の割合が高いがあります。その特性上、ほとんどがF4/80、脾臓マクロファージのマーカーのその式に基づいて、CD11cはハイ MHC - II LOの肺の細胞集団は、潜在的なDC前駆11として、肺のマクロファージ、最近10として同定されている。 マウスPDCには対照的に、肺の免疫応答におけるCDCの特定の役割の研究は、これらの細胞の分離に役立つ可能性が特異的なマーカーの不足により制限されている。したがって、この作品では、我々は高度に精製されたマウスの肺CDCを分離する手順を説明します。肺DCサブセットの分離は、呼吸器病原体だけでなく、肺の宿主免疫応答を誘発する環境要因に応答してこれらの細胞の機能に関する洞察を得るために非常に便利なツールを表します。

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。

肺樹状細胞（DC）は、侵入した病原体の感知1,2および、...における免疫寛容反応の制御3において、基本的な役割を果たしている。

この手順の全般的な目的は、高度に精製されたマウス肺樹状細胞調製物を得ることにあります。これは、まず排泄リンパ節を含まずに肺組織を回収し、次にコラゲナーゼ消化によって単一細胞懸濁液を得ることで達成されます。次のステップでは、磁気細胞分離システムを用いてCD 11 C陽性細胞を濃縮します。次に、フローサイトメトリーによるセルソーティングを用いて、従来の樹状細胞サブセットを単離します。最終的に、マウス肺組織から単離された従来の樹状細胞を、フローサイトメトリーおよび光学顕微鏡で解析できます。この手法は、呼吸器系における自然免疫および感染症における従来型樹状細胞サブセットの関与はどのようなものであるかなど、免疫学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるIssa Lancelinと私が行います。マウスを安楽死させた後、腹膜の外皮を切開し、慎重に剥離して胸腔を露出させることから始めてください。肋骨をカットして横隔膜を開き、心臓と肺の両方を露出させます。心臓と肺が露出したら、灌流処置を開始できます。5 mLのシリンジにEDTA-HBSSを満たし、25Gの針をシリンジに接続します。次に、注入中の漏出を防ぐため、針を右心室に挿入します。ピンセットを用いて、針周囲の心筋組織を固定します。その後、一定の圧力を維持しながら、溶液をゆっくりと注入します。正確に灌流が行われると、肺が膨張し、色がピンクまたは白に変化します。潜在的な汚染を避けるため、ドレナージリンパ節を取り除いて廃棄してください。その後、肺組織を採取し、切除した臓器を氷上のペトリ皿に移します。GentleMax Cチューブに5 mLの肺コラゲナーゼ消化液を満たし、肺を細かく刻みます。カミソリを使用して、組織をチューブに移し、緩やかな最大解離（max dissociation）を行います。単一細胞懸濁液を得るために、プログラムM lung zero oneを選択します。次に、サンプルを37°Cで30分間インキュベートし、5分ごとにチューブを振って組織断片を再懸濁させ、プログラムM lung zero twoに進みます。次に、サンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、4°Cで335 ×g、10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットに2 mLのCK溶血バッファーを加え、室温で1分間置いて残りの赤血球を溶血させます。その後、0.5% BSAを添加した冷PBS 13 mLで細胞を洗浄します。上清を捨てた後、このペレットを5 mLの冷PBS + BSAで再度懸濁し、細胞液を100 µmのナイロンメッシュでろ過します。最後に、トリパンブルー排除法により総細胞数を決定します。GentleMACS解離装置を使用する代わりに、15 mLコニカルチューブに肺1個あたり

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