大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

小胞膜を介したペプチドの転位を定量化する。トリプシンを封入した蛍光標識脂質小胞を作製する。外来性トリプシンの活性を阻害するためにトリプシンインヒビターを添加し、小胞腔内にのみ活性のあるトリプシンを保持させる。

蛍光標識ペプチドを小胞に添加したときのみ、その蛍光タグがFRETドナーとして機能し、小胞上の蛍光分子を励起します。しかし、タンパク質が膜を通過すると、それらはトリプシンによって消化され、FRETシグナルが消失します。分光分析によりペプチド転位の程度が明らかになり、これは時間経過に伴う小胞とペプチド間のFRETの減少として観察されます。

他の脂質小胞技術や細胞内へのペプチド流入を測定する方法を含む他の手法と比較して、本手法の主な利点は、膜への進入速度に関する情報が得られること、およびペプチドにトリプトファンが含まれている場合は蛍光ラベルを付加する必要がないことです。この方法は、効果的な膜透過にどのような特性が必要かなど、膜活性ペプチドの設計およびエンジニアリングにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順の最初のステップは、アッセイにおける細胞膜の模倣体として機能させるため、巨大単層脂質小胞（UUV）を調製することです。

まず、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、および5-ジメチルアミノナフチル-1-スルホニルホスファチジルエタノールアミンを、クロロホルム中で50:45:5の比率で混合します。通常、1回の実験または対照試験に必要な量のベシクルを調製するには、総脂質量0.376 mgで十分です。

1つのバイアルを実験サンプルとして、もう1つをコントロールとして用意し、窒素ガス流を用いてクロロホルムを蒸発させます。この工程後に残った乾燥脂質をリピッドケーキと呼びます。リピッドケーキを真空デシケーター内で9～14時間乾燥させます。

次に、10 mMのHEIストック溶液、0.4 mMの豚トリプシンストック溶液、および4.0 mMのBowman Burkeトリプシンインヒビターストック溶液を調製します。調製方法の詳細については、付属文書をご参照ください。乾燥させた脂質ケーキに、0.4 mMのトリプシンストック溶液と10 mMのHEIバッファー溶液を等量ずつ加えます。その後、バイアルをボルテックスして、マルチラメラ小胞（MV）を再構成します。コントロール用MVを再構成するには、乾燥させた脂質ケーキに0.4 mMのトリプシンストック溶液と4.0 mMのトリプシンインヒビターを等量加え、前述と同様にボルテックスします。

mvsの再構成が完了したら、MLV溶液をガラスバイアルから1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、液体窒素と30 °Cの水槽を交互に用いて、MLV溶液を5回凍結融解させます。続いて、2つのフィルターサポートをHeiss Bufferで湿らせ、リピッドエクストルーダーを準備します。

次に、それぞれを湿らせたテフロン製エクストルーダーピースの上に置き、2つのテフロン製エクストルーダーピースの間に孔径 0.1 micron のヌクレオポア・トラックエッチ膜を挟みます。続いて、エクストルーダーピースを金属製エクストルーダーキャニスターに入れ、2つのエクストルーダーピースの上にドーナツスペーサーを配置します。エクストルーダーキャニスターの金属製トップを締め、250 microliter ガラスシリンジを用いてホルダーに固定します。

ベシクルサンプルの消失を防ぐため、エクストルーダーの空隙に10 millimolarの HEPES緩衝液を500 µL充填します。サンプルを10 milliliterビーカーに移します。

次に、各MLVサンプルをエクストルーダーに充填し、メンブレンを通して少なくとも21回押し出します。エクストルージョン後にElla小胞のサイズを均一にするため、巨大ELLA脂質小胞またはL UUVsを1.7 mLのマイクロ遠心チューブに移します。UUVsは4 °Cで保存し、48時間以内に使用してください。

LUV濃度を評価するために、サンプル中の全リン含有量を測定します。以下の試薬を、付属の書面プロトコルの仕様に従って調製してください。8.9 N H₂SO₄、2.5% (w/v) モリブデン酸アンモニウム、10% (w/v) アスコルビン酸、および 0.65 mM リン酸緩衝液です。

ここに示す通り、6つのリン標準液を調製します。次に、コントロールに使用したものと同じ量の0.2 millimolar トリプシンおよび2.0 millimolar Bowman BIR阻害剤溶液を用いて、LUVブランクを調製します。これは、Bowman B阻害剤粉末に含まれる乾燥したリン塩の影響を補正するために行います。

次に、通常は約25 µLに相当する約0.1 µmolのUUVsを、使い捨てガラス培養チューブに3連（triplicate）で分注します。次に、各サンプル、標準物質、およびブランクチューブに8.9 NのH₂SO₄を450 µL加えます。その後、サンプル、標準物質、およびブランクを175～210 °Cのオーブンに入れ、25分間加熱します。

25分が経過した後、すべてのチューブをオーブンから取り出し、冷却させます。各チューブに30% H₂Oを150 µL加えます。その後、サンプル、標準試料、およびブランクを175〜210 °Cでさらに30分間加熱します。

30分後、試料標準液とブランクを加熱装置から取り出します。溶液に色が残っている場合は、すべてのチューブに50 µLのH2Oを加え、175～210 °Cでさらに15分間加熱してください。溶液が無色になったら、各チューブに3.9 mLのnano pure H2O、0.5 mLのモリブデン酸アンモニウム溶液、および0.5 mLのアスコルビン酸溶液を加えます。

その後、すべてのチューブを5〜7分間加熱します。沸騰水浴中で、Agilent 8 4 5 3 UV可視分光光度計を用い、各標準試料およびサンプルの吸光度を820 nanometersで測定します。実験群と対照群のLUV濃度は、個別に測定する必要があります。

0.0 millimolesのリンを含むチューブを、すべての標準試料および実験用LUV試料のブランクとして使用します。0.2 millimolarのトリプシンと2.0 millimolarのbone and bir阻害剤溶液を含むチューブを、コントロールLUV試料のブランクとして使用します。作成された吸光度対リン含有量の線形標準曲線を用いて、試料の総リン含有量およびLUV濃度を算出します。

ペプチド溶液を調製するために、ペプチドをOppu H2Oに溶解させます。このアッセイで使用するペプチドには、1つのトリプトファン残基が含まれている必要があります。282 nmにおけるペプチド溶液の吸光度を3回繰り返し測定してください。トリプトファンのモル吸光係数 5,700 を用いて、ペプチド濃度を算出します。

1 M⁻¹ cm⁻¹のペプチドをNano Pure Waterで希釈し、最終濃度を30 µMにして-20 °Cで保存します。転移量を定量するため、1.7 mLマイクロ遠心チューブに実験サンプルとコントロールサンプルを調製します。各溶液に、最終濃度が250 µMになる十分な量のUUVsを添加します。

Bowman BIR阻害剤溶液を、最終濃度がtryin濃度の10倍になるまで加えます。10 mMのHEPESバッファーを加え、最終溶液量を450 µLにします。50 µLのペプチド溶液をStarna micro chordsフルオリメーターセルに入れ、分光光度計のプログラムにセットします。

280 nmの励起波長および525 nmの蛍光波長を用い、25 °Cにて、少なくとも1秒に1回の蛍光読み取りを行う25分間の蛍光キネティクス実験に使用する蛍光分光光度計。PMT感度を「high」に設定し、実験サンプルまたはコントロールサンプルをqve内のペプチド溶液に加える。これにより、最終的なペプチド濃度を3 µMにし、直ちに蛍光キネティクス実験を開始する。

実験サンプルとコントロールサンプルの両方のランが完了したら、付属文書に従って転位比を算出します。sとペプチドの比率は、たとえ転位して小胞内に入ったペプチドが一つもなかったとしても、ほぼすべての無傷のペプチドがdansel基に十分に近い距離にあり、fret信号を発するのに十分な高さに設定されています。これは、小胞に転位するペプチドと転位しないペプチドの両方について、コントロール条件下で同様のfretが観察されることと一致しています。

転位アッセイはこのビデオに記載された方法で実施しました。この図は、顕著な転位を示した代表的なペプチドの結果を示しています。黒いラインで表されるこの実験のシグナルは、FRETシグナルの著しい低下を示しています。

時間の経過とともに、転位率が高くなることは、ペプチドが効率的に転位していることを示しています。ここに示した細胞透過性ペプチドの転位率は1.19です。不完全なトリプシン消化や抑制剤、あるいは転位能とは無関係なその他の要因によるFRET信号の損失の可能性を制御するため、弱く転位するペプチドの転位率は1に近い値となります。トリプシンとBowman BRKトリプシン抑制剤の両方を含むUUVとペプチドの間のFRET信号を測定します。

これはグレーのトレースで示されています。トリプシンインヒビターを含むUUVを用いたコントロール実験の重要性が、ここに示されたデータによって強調されています。この場合、ペプチド信号は、黒色のトレースで示された実験サンプルにおける前図と同程度の減少を示しました。

しかし、コントロールサンプルではこのペプチドの減少がより急速に起こるため、正味の転移量は低くなります。このビデオを視聴することで、リピッドベシクルの作製方法と、トリプトファン含有ペプチドの転移を測定する方法について十分に理解できたはずです。この手順を試みる際は、ペプチドとベシクルを混合した直後にデータ収集を開始することが重要である点に注意してください。