特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子の発現を改変し、それが体細胞超変異に及ぼす影響を測定することです。これは、Bosque 23細胞に導入し、過剰発現用またはSHRA含有構築物を含むウイルス粒子を産生させることで達成されます。次に、ramo細胞にこれらのウイルスを感染させ、目的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現を誘導します。

次に、細胞に突然変異を蓄積させるため、単一細胞クローンを数週間培養します。最終的に、IgMの消失の解析およびIG遺伝子のシーケンシングにより、遺伝子発現の変化による影響を決定できます。この手法は、抗体多様性に関与する新規因子の特定に役立つ可能性があります。

まず、600 µLの温めたDMEMを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。次に、培地の中に直接ピペットで加えるよう注意しながら、30 µLのFUgene 6をチューブに添加し、溶液を1秒未満ボルテックスした後、チューブを室温で5分間インキュベートします。次に、本手法のようなレンチウイルス感染のために、6 µgのshRNAコンストラクトと、1.5 µgずつのpVSVG-pmdLGPRREおよびpRSV-revをDMEM/FUgene 6混合液に加えます。

溶液を短時間ボルテックスし、再び室温で25分間インキュベートします。最後に、50〜60%コンフルエンスのBosque 23細胞培養物にD-N-A-D-M-E-M FU遺伝子をトランスフェクションします。細胞を混合し、37°C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートしてください。

翌日、細胞に5 mLのDMEMを加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。トランスフェクションから3日後、10 mLシリンジを用いてトランスフェクションしたbox 23細胞から10 mLの培地を回収し、シリンジの先端に0.45 µmフィルターを取り付けます。ろ過した培地を清潔な15 mLポリプロピレンチューブに回収します。感染の24時間前に、2 × 10⁵ cells/mLのRamos細胞 2 mLを完全RPMI中で6ウェルプレートに播種します。翌日、3 µLの10 µg/mLポリブレン溶液と1 mLのウイルスをRamos細胞に加え、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混ぜ合わせます。

非感染コントロールについては、ウイルスの代わりに完全RPMI 1 mLとpoly brain 3 µLをウェルの1つに加えます。また、別のウェルに適合するネガティブコントロールを、さらに別のウェルにGFP含有ベクターを感染させ、FACSによる感染効率を決定します。次に、6ウェルプレートを室温で3000 ×g、90分間遠心分離し、その後プレートをインキュベーターに戻して48時間培養します。

最後に、感染させた細胞を15 mLポリプロピレンチューブに入れ、400 Gsで4分間遠心分離します。室温で培地を吸引し、その際細胞ペレットを乱さないように注意して、新鮮なRPMIで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントした後、感染させたRAMO細胞の分注量を10 cells/mLに調整します。

各播種プレートにつき、最終容量10 millilitersになるようにRPMIコンディショニング培地とFBSの溶液を調製します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、希釈した細胞を96ウェルプレートの各ウェルに100 microlitersずつ播種します。

プレートを37°C、5%二酸化炭素条件下で24時間インキュベートした後、顕微鏡を用いて各ウェルを確認します。単一細胞を特定するための適切な深さを決定するのは困難な場合があるため、細胞の存在を確認してください。まず、96ウェルプレートの底面に印字されているウェル番号に焦点を合わせるようにしてください。

その後、2週間後に細胞の探索を試みます。油性ペンを用いて、ウェルの縁に沿って細胞コロニーがあるかを確認してください。細胞の増殖が旺盛なウェルに印を付け、その後、さらなる培養のためにコロニーを1 mLのRPMIが入った24ウェルプレートに移植します。

数日間の培養後、細胞を6ウェルプレートに移植し、培養を継続します。6ウェルプレートに細胞コロニーを播種してから3週間後、各ウェルから5×10⁵個の細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。このとき、コントロールおよびHRNAノックダウンの各ウェルから細胞を回収し、さらに無染色コントロール用のサンプルを1つ採取します。

次に、室温で400 Gs、4分間、すべての細胞を遠心分離します。2回目の遠心時には、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄してください。2回目の洗浄後、未染色のコントロールペレットを50 µLのPBSに、その他のペレットはPBSにPE標識抗ヒトIgM抗体を1:20に希釈して加えた液に懸濁します。その後、すべての細胞サンプルを氷上で1時間インキュベートします。前述と同様にPBSでさらに2回細胞を洗浄し、上清を捨てて、すべてのペレットを100 µLのPBSで再懸濁します。

次に、再懸濁した染色済み細胞およびコントロールの未染色細胞をファルコンチューブに移し、フローサイトメトリーで細胞を分析します。コントロールと比較して、S-H-R-N-Aノックダウン細胞におけるIgM陰性細胞の割合を比較してください。IDのためのレトロウイルス過剰発現ベクターをbosque 23細胞にトランスフェクションしました。

その後、ウイルスを回収し、野生型（wt）およびAID過剰発現細胞（AID.High）の両方のRamos細胞に感染させました。シングルセルで播種し3週間培養した後、定量RT-PCRを用いて遺伝子発現を解析しました。予想通り、定量RT-PCRの結果から、AID過剰発現ベクターを感染させた細胞においてAID発現が著しく増加していることが示されました。また、感染細胞におけるIgMの消失をFACsで評価しました。前図の3週時点での表面IgMをFACsで測定し、野生型細胞とAID.High細胞におけるIgM消失率を算出してここにグラフで示しました。予想通り、AID過剰発現細胞では表面IgMのより大きな消失が認められました。

別の実験において、コントロールとして無関係なS-H-R-N-Aを含むレンチウイルス、またはSHMを保護すると予想される高忠実度DNA修復因子に対するS-H-R-N-Aを含むレンチウイルスをbosque 23細胞で作製しました。その後、これらのレンチウイルスをRamos細胞のa ID highクローンに感染させました。再度、遺伝子発現を解析したところ、予想通り、当該因子に対する標的S-H-R-N-Aの存在下でDNA修復因子のレベルが低下していることが観察されました。また、修復因子はSHM中の変異に対する保護能を提供すると考えられているため、3週間後に単一細胞クローンにおけるIGM喪失を解析しました。この図で観察されるように、当該因子が存在しない場合、IGM喪失とSHMの増加が起こります。

このビデオを視聴することで、raw B細胞株においてOVEREXPRESSIONまたはS-H-R-N-A含有コンストラクトを用いたウイルス感染を行う方法、およびそれらの細胞における体細胞超変異を測定する方法について十分に理解することができます。