Name: 特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶラモスB細胞における遺伝子発現制御と体細胞高頻度変異の評価手法。レトロウイルスまたはレンチウイルス感染を用いて過剰発現やノックダウンを行い、IgM解析と遺伝子シーケンスで変異を測定する。抗体多様化に関与する新規因子の同定に役立つ。

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pMSCV - AID - I - Thy1.1とpKat2ベクトルはDGシャッツから親切な贈り物だったとpVSV - G、pRSV - REV、およびpMDLg / pRREベクトルはBRカレンから親切な贈り物でした。

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
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<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

前述したように、抗体の多様化のための細胞株のモデルは、抗体の多様化中に別のステップに影響を与える新規タンパク質を同定するために人気の出発点となっている。我々はここにラモスB細胞株におけるノックダウンまたは過剰発現するタンパク質のいずれかにウイルス感染を使用するための方法を提示し、SHMの影響を調べる。 これらの研究では、WTラモスとAID ハイラモス細胞の両方を利用する。 AIDのハイテク細胞は AIDの発現に影響を与える要因を除外しながらWT細胞は、標的またはAIDの発現だけでなく、AIDによって生成された病変の修復に関与する因子を研究するために使用することができます。 それはSHMが最初にIgM抗体+である細胞の集団からのIgMの損失を測定することによりこちらで計測され、ていることにも留意すべきである。また、それはIgMで起動することが可能です- 。細胞をして復帰アッセイ23中のIgM <su...

推奨試薬-これらのほとんどは他のベンダーから同様の製品で置換されていてもよい。 <table border="1" ><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th >会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td > 6ウェル明確なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mLのBDルアーLoksyringes </td><td > BDメディカル</td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24ウェル透明なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96ウェル透明な平底ポリスチレンTC -処理マイクロプレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100ミリメートルTC処理培養皿</td><td >コー​​ニング</td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td >アクロディスクシリンジフィルター、孔径0.45μm </td><td >ポールライフサイエンス</td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td >寒天</td><td > Teknova </td><td > A7777 </tD&gt; <td ></td></tr><tr><td >アガロース</td><td > GeneMate </td><td> E - 3120 - 500 </td><td ></td></tr><tr><td >アンピシリン</td><td>シグマ</td><td > A0166 </td><td>水中では100 mg / mLの</td></tr><tr><td > BD FACSCanto IIフローサイトメーター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td ></td><td >または類似の</td></tr><tr><td> BDファルコン丸底のポリスチレンチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td > 352054 </td><td > FACS用</td></tr><tr><td > BOSC 23細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37の可能なCO 2インキュベーター° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地） </td><td >シグマ</td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS（ウシ胎児血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITCα-ラットCD90/mouse CD90.1抗体</td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα- Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td >ロッシュ</td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES緩衝液</td><td >インビトロジェン</td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPAハイファイDNAポリメラーゼ</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB培地（溶原スープ - ルリア）パウダー</td><td >ディフコ</td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNAの細菌のグリセロールストック</td><td >シグマ</td><td ></td><td> shRNAベクター</td></tr><tr><td > NCS（新生児ウシ血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS（リン酸緩衝液） </td><td >インビトロジェン</td><td> 70011 </td><td >水で1Xに希釈</td></tr><tr><td > PEα-ヒトIgM抗体</td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS（ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン溶液） </td><td >ジェミニバイオProducts </td><td > 400から110 </td><td ></td></tr><tr><td>ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン） </td><td >シグマ</td><td > 107689 </td><td >水に10 mg / mLの</td></tr><tr><td > PureYieldプラスミドミディプレップシステム</td><td >プロメガ</td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ</td><td > P8833 </td><td >水の250μg/ mLの</td></tr><tr><td > QIAquickゲル抽出キット</td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td>ラモス（RA 1）細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI - 1640培地</td><td >シグマ</td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td >スーパースクリプトII </td><td >インビトロジェン</td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST定量PCRキット</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNAポリメラーゼ</td><td >インビトロジェン</td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TAクローニングキット</td><td >体外ジェン</td><td > K4520 - 01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIZOL </td><td >インビトロジェン</td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td >ウィザードSVゲノムDNA精製システム</td><td >プロメガ</td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X - Galを[5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - indoyl -β- D - galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C - 5687 </td><td > DMSOに40 mg / mLの</td></tr></tbody></table>

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスb細胞に体細胞高頻度変異の評価

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

B細胞は、V（D）J組換えにより生成された低親和性の抗体とその生活を始める。しかし、病原体を検出すると、免疫グロブリン（Ig）遺伝子の可変（V）領域は、高親和性抗体の1,2の結果、約10万倍以上の体細胞超変異（SHM）を通じて、ゲノムの他の部分よりも変異している。さらに、クラススイッチ組み換え（CSR）は、特定の病原体に必要とされる免疫応答の種類に応じて、異なるエフェクター機能を有する抗体を産生する。 CSRとSHMの両方は、ウラシルを生成するためにDNAのシトシン残基をdeaminates活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されています。これらのウラシルは、最終的には突然変異と1-3組換えにつながる、修復経路のエラーが発生しやすいフォームによって処理されます。 マウスでの研究の組み合わせから来るSHMとCSRの分子の詳細、主要な細胞、細胞株、およびセルの- fの私たちの現在の理解REE実験。マウスモデルは、多くの修復因子（例えば雄、MSH2、MSH6、EXO1、およびポリメラーゼη）4-10のために重要な役割を示す遺伝子ノックアウトとゴールドスタンダードのまま。ただし、すべての遺伝子がノックアウトの研究のために適している。例えば、いくつかの二重鎖切断修復タンパク質のノックアウトはembryonically致死的またはB細胞の開発11-14損なう。また、時々SHMやCSRにおけるタンパク質の特定の機能をノックアウトによって引き起こされる多くの世界的な欠陥によってマスクされることがあります。さらに、マウスでの実験以来、細胞株における個々の遺伝子の発現が候補遺伝子15-18識別し、特徴付けるために、ますます人気の第一歩となっている変更、時間がかかる場合があります。 ラモス-構成的にSHMを受けるバーキットリンパ腫細胞株は- SHM 18-24勉強に人気の細胞ラインのモデルとなっています。ラモス細胞の一つの利点は、内蔵の便利なセミを持っていることです。SHMの定量的尺度。野生型の細胞は、突然変異、IgM抗体の発現をノックアウト変異のいくつかをピックアップとして、IgMを発現しており。したがって、蛍光活性化細胞のスキャン（FACS）によってIgMの損失をアッセイすることSHMのレベルのための読み出し迅速に提供します。 SHMのより定量的な測定は、直接抗体遺伝子をシーケンシングすることによって得ることができる。 ラモス細胞はトランスフェクションが困難なので、我々はそれぞれ過剰発現カセットまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、のいずれかを含むレトロウイルスやレンチウイルスのコンストラクトで細胞を感染させることによって増加または個々の遺伝子の発現を低下している安定した誘導体を生成する。ここで、我々はラモスの細胞に感染してから、SHM（図1）上の特定の遺伝子の役割を調べるために、これらの細胞を使用する方法について説明します。

我々は、過剰発現またはshRNAを含む人間ラモスB細胞株とどのようにこれらの細胞で体細胞高頻度変異を測定するためのコンストラクトのレトロウイルスやレンチウイルス感染症を実行する方法について説明します。

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

B細胞は、V(D)J遺伝子再構成によって生成された低親和性の抗体を持って分化します。しかし、病原体を検知すると、...の可変（V）領域が...

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子の発現を改変し、それが体細胞超変異に及ぼす影響を測定することです。これは、Bosque 23細胞に導入し、過剰発現用またはSHRA含有構築物を含むウイルス粒子を産生させることで達成されます。次に、ramo細胞にこれらのウイルスを感染させ、目的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現を誘導します。次に、細胞に突然変異を蓄積させるため、単一細胞クローンを数週間培養します。最終的に、IgMの消失の解析およびIG遺伝子のシーケンシングにより、遺伝子発現の変化による影響を決定できます。この手法は、抗体多様性に関与する新規因子の特定に役立つ可能性があります。まず、600 µLの温めたDMEMを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。次に、培地の中に直接ピペットで加えるよう注意しながら、30 µLのFUgene 6をチューブに添加し、溶液を1秒未満ボルテックスした後、チューブを室温で5分間インキュベートします。次に、本手法のようなレンチウイルス感染のために、6 µgのshRNAコンストラクトと、1.5 µgずつのpVSVG-pmdLGPRREおよびpRSV-revをDMEM/FUgene 6混合液に加えます。溶液を短時間ボルテックスし、再び室温で25分間インキュベートします。最後に、50〜60%コンフルエンスのBosque 23細胞培養物にD-N-A-D-M-E-M FU遺伝子をトランスフェクションします。細胞を混合し、37°C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートしてください。翌日、細胞に5 mLのDMEMを加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。トランスフェクションから3日後、10 mLシリンジを用いてトランスフェクションしたbox 23細胞から10 mLの培地を回収し、シリンジの先端に0.45 µmフィルターを取り付けます。ろ過した培地を清潔な15 mLポリプロピレンチューブに回収します。感染の24時間前に、2 × 10⁵ cells/mLのRamos細胞 2 mLを完全RPMI中で6ウェルプレートに播種します。翌日、3 µLの10 µg/mLポリブレン溶液と1 mLのウイルスをRamos細胞に加え、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混ぜ合わせます。非感染コントロールについては、ウイルスの代わりに完全RPMI 1 mLとpoly brain 3 µLをウェルの1つに加えます。また、別のウェルに適合するネガティブコントロールを、さらに別のウェルにGFP含有ベクターを感染させ、FACSによる感染効率を決定します。次に、6ウェルプレートを室温で3000 ×g、90分間遠心分離し、その後プレートをインキュベーターに戻して48時間培養します。最後に、感染させた細胞を15 mLポリプロピレンチューブに入れ、400 Gsで4分

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免疫学と感染症

我々は、RNAiを用いて細胞から内因性のBRCA1蛋白質を破壊し、コーディングの変更が含まれているBRCA1点変異体でそれを置き換えることにより、DNA損傷の相同組換え修復のためのアッセイに基づいて組織培養でのBRCA1の変異体をテストするための方法を提供する。...

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。...

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna...

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

リボ核酸 (cRNA) 血液からを循環の検出は、臨床診断で満たされていない必要性です。ここで我々 は非小細胞肺癌患者特異的かつ高感度デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してから cRNA を特徴付ける方法を説明します。テストは、72...

血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション...

遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化

南しみが付くことおよび/または PCR を用いたマウス胚性幹細胞に発生した相同組換えイベントを識別するための詳しいプロトコルを紹介します。このメソッドは、伝統的な胚性幹細胞を用いた相同組換えを介したターゲット技術を使用して非ミオシン II 遺伝子交換マウス...

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

ここで提示されるアッセイは、マウスペイヤーのパッチから胚中心B細胞を用いた免疫グロブリン重鎖遺伝子遺伝子軌跡内の体細胞過突然変異を定量化するアッセイである。...

マウスペイヤーパッチからの胚芽センターB細胞のJH4イントロンにおける体細胞ハイパー突然変異の解析

この記事では、血管免疫芽球性リンパ腫におけるサンガーシーケンシングに基づく低周波検出法の応用について紹介します。この方法を他の病気に適用するための基礎を提供します。...

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo...

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

学ぶラモスB細胞における遺伝子発現制御と体細胞高頻度変異の評価手法。レトロウイルスまたはレンチウイルス感染を用いて過剰発現やノックダウンを行い、IgM解析と遺伝子シーケンスで変異を測定する。抗体多様化に関与する新規因子の同定に役立つ。

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

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