Name: 特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶラモスB細胞における遺伝子発現制御と体細胞高頻度変異の評価手法。レトロウイルスまたはレンチウイルス感染を用いて過剰発現やノックダウンを行い、IgM解析と遺伝子シーケンスで変異を測定する。抗体多様化に関与する新規因子の同定に役立つ。

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pMSCV - AID - I - Thy1.1とpKat2ベクトルはDGシャッツから親切な贈り物だったとpVSV - G、pRSV - REV、およびpMDLg / pRREベクトルはBRカレンから親切な贈り物でした。

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

前述したように、抗体の多様化のための細胞株のモデルは、抗体の多様化中に別のステップに影響を与える新規タンパク質を同定するために人気の出発点となっている。我々はここにラモスB細胞株におけるノックダウンまたは過剰発現するタンパク質のいずれかにウイルス感染を使用するための方法を提示し、SHMの影響を調べる。 これらの研究では、WTラモスとAID ハイラモス細胞の両方を利用する。 AIDのハイテク細胞は AIDの発現に影響を与える要因を除外しながらWT細胞は、標的またはAIDの発現だけでなく、AIDによって生成された病変の修復に関与する因子を研究するために使用することができます。 それはSHMが最初にIgM抗体+である細胞の集団からのIgMの損失を測定することによりこちらで計測され、ていることにも留意すべきである。また、それはIgMで起動することが可能です- 。細胞をして復帰アッセイ23中のIgM <su...

推奨試薬-これらのほとんどは他のベンダーから同様の製品で置換されていてもよい。 <table border="1" ><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th >会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td > 6ウェル明確なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mLのBDルアーLoksyringes </td><td > BDメディカル</td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24ウェル透明なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96ウェル透明な平底ポリスチレンTC -処理マイクロプレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100ミリメートルTC処理培養皿</td><td >コー​​ニング</td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td >アクロディスクシリンジフィルター、孔径0.45μm </td><td >ポールライフサイエンス</td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td >寒天</td><td > Teknova </td><td > A7777 </tD&gt; <td ></td></tr><tr><td >アガロース</td><td > GeneMate </td><td> E - 3120 - 500 </td><td ></td></tr><tr><td >アンピシリン</td><td>シグマ</td><td > A0166 </td><td>水中では100 mg / mLの</td></tr><tr><td > BD FACSCanto IIフローサイトメーター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td ></td><td >または類似の</td></tr><tr><td> BDファルコン丸底のポリスチレンチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td > 352054 </td><td > FACS用</td></tr><tr><td > BOSC 23細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37の可能なCO 2インキュベーター° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地） </td><td >シグマ</td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS（ウシ胎児血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITCα-ラットCD90/mouse CD90.1抗体</td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα- Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td >ロッシュ</td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES緩衝液</td><td >インビトロジェン</td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPAハイファイDNAポリメラーゼ</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB培地（溶原スープ - ルリア）パウダー</td><td >ディフコ</td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNAの細菌のグリセロールストック</td><td >シグマ</td><td ></td><td> shRNAベクター</td></tr><tr><td > NCS（新生児ウシ血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS（リン酸緩衝液） </td><td >インビトロジェン</td><td> 70011 </td><td >水で1Xに希釈</td></tr><tr><td > PEα-ヒトIgM抗体</td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS（ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン溶液） </td><td >ジェミニバイオProducts </td><td > 400から110 </td><td ></td></tr><tr><td>ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン） </td><td >シグマ</td><td > 107689 </td><td >水に10 mg / mLの</td></tr><tr><td > PureYieldプラスミドミディプレップシステム</td><td >プロメガ</td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ</td><td > P8833 </td><td >水の250μg/ mLの</td></tr><tr><td > QIAquickゲル抽出キット</td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td>ラモス（RA 1）細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI - 1640培地</td><td >シグマ</td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td >スーパースクリプトII </td><td >インビトロジェン</td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST定量PCRキット</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNAポリメラーゼ</td><td >インビトロジェン</td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TAクローニングキット</td><td >体外ジェン</td><td > K4520 - 01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIZOL </td><td >インビトロジェン</td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td >ウィザードSVゲノムDNA精製システム</td><td >プロメガ</td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X - Galを[5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - indoyl -β- D - galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C - 5687 </td><td > DMSOに40 mg / mLの</td></tr></tbody></table>

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスb細胞に体細胞高頻度変異の評価

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

B細胞は、V（D）J組換えにより生成された低親和性の抗体とその生活を始める。しかし、病原体を検出すると、免疫グロブリン（Ig）遺伝子の可変（V）領域は、高親和性抗体の1,2の結果、約10万倍以上の体細胞超変異（SHM）を通じて、ゲノムの他の部分よりも変異している。さらに、クラススイッチ組み換え（CSR）は、特定の病原体に必要とされる免疫応答の種類に応じて、異なるエフェクター機能を有する抗体を産生する。 CSRとSHMの両方は、ウラシルを生成するためにDNAのシトシン残基をdeaminates活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されています。これらのウラシルは、最終的には突然変異と1-3組換えにつながる、修復経路のエラーが発生しやすいフォームによって処理されます。 マウスでの研究の組み合わせから来るSHMとCSRの分子の詳細、主要な細胞、細胞株、およびセルの- fの私たちの現在の理解REE実験。マウスモデルは、多くの修復因子（例えば雄、MSH2、MSH6、EXO1、およびポリメラーゼη）4-10のために重要な役割を示す遺伝子ノックアウトとゴールドスタンダードのまま。ただし、すべての遺伝子がノックアウトの研究のために適している。例えば、いくつかの二重鎖切断修復タンパク質のノックアウトはembryonically致死的またはB細胞の開発11-14損なう。また、時々SHMやCSRにおけるタンパク質の特定の機能をノックアウトによって引き起こされる多くの世界的な欠陥によってマスクされることがあります。さらに、マウスでの実験以来、細胞株における個々の遺伝子の発現が候補遺伝子15-18識別し、特徴付けるために、ますます人気の第一歩となっている変更、時間がかかる場合があります。 ラモス-構成的にSHMを受けるバーキットリンパ腫細胞株は- SHM 18-24勉強に人気の細胞ラインのモデルとなっています。ラモス細胞の一つの利点は、内蔵の便利なセミを持っていることです。SHMの定量的尺度。野生型の細胞は、突然変異、IgM抗体の発現をノックアウト変異のいくつかをピックアップとして、IgMを発現しており。したがって、蛍光活性化細胞のスキャン（FACS）によってIgMの損失をアッセイすることSHMのレベルのための読み出し迅速に提供します。 SHMのより定量的な測定は、直接抗体遺伝子をシーケンシングすることによって得ることができる。 ラモス細胞はトランスフェクションが困難なので、我々はそれぞれ過剰発現カセットまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、のいずれかを含むレトロウイルスやレンチウイルスのコンストラクトで細胞を感染させることによって増加または個々の遺伝子の発現を低下している安定した誘導体を生成する。ここで、我々はラモスの細胞に感染してから、SHM（図1）上の特定の遺伝子の役割を調べるために、これらの細胞を使用する方法について説明します。

我々は、過剰発現またはshRNAを含む人間ラモスB細胞株とどのようにこれらの細胞で体細胞高頻度変異を測定するためのコンストラクトのレトロウイルスやレンチウイルス感染症を実行する方法について説明します。

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

B細胞は、V(D)J遺伝子再構成によって生成された低親和性の抗体を持って分化します。しかし、病原体を検知すると、...の可変（V）領域が...

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子の発現を改変し、それが体細胞超変異に及ぼす影響を測定することです。これは、Bosque 23細胞に導入し、過剰発現用またはSHRA含有構築物を含むウイルス粒子を産生させることで達成されます。次に、ramo細胞にこれらのウイルスを感染させ、目的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現を誘導します。次に、細胞に突然変異を蓄積させるため、単一細胞クローンを数週間培養します。最終的に、IgMの消失の解析およびIG遺伝子のシーケンシングにより、遺伝子発現の変化による影響を決定できます。この手法は、抗体多様性に関与する新規因子の特定に役立つ可能性があります。まず、600 µLの温めたDMEMを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。次に、培地の中に直接ピペットで加えるよう注意しながら、30 µLのFUgene 6をチューブに添加し、溶液を1秒未満ボルテックスした後、チューブを室温で5分間インキュベートします。次に、本手法のようなレンチウイルス感染のために、6 µgのshRNAコンストラクトと、1.5 µgずつのpVSVG-pmdLGPRREおよびpRSV-revをDMEM/FUgene 6混合液に加えます。溶液を短時間ボルテックスし、再び室温で25分間インキュベートします。最後に、50〜60%コンフルエンスのBosque 23細胞培養物にD-N-A-D-M-E-M FU遺伝子をトランスフェクションします。細胞を混合し、37°C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートしてください。翌日、細胞に5 mLのDMEMを加え、さらに24時間インキュベーターに戻します。トランスフェクションから3日後、10 mLシリンジを用いてトランスフェクションしたbox 23細胞から10 mLの培地を回収し、シリンジの先端に0.45 µmフィルターを取り付けます。ろ過した培地を清潔な15 mLポリプロピレンチューブに回収します。感染の24時間前に、2 × 10⁵ cells/mLのRamos細胞 2 mLを完全RPMI中で6ウェルプレートに播種します。翌日、3 µLの10 µg/mLポリブレン溶液と1 mLのウイルスをRamos細胞に加え、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混ぜ合わせます。非感染コントロールについては、ウイルスの代わりに完全RPMI 1 mLとpoly brain 3 µLをウェルの1つに加えます。また、別のウェルに適合するネガティブコントロールを、さらに別のウェルにGFP含有ベクターを感染させ、FACSによる感染効率を決定します。次に、6ウェルプレートを室温で3000 ×g、90分間遠心分離し、その後プレートをインキュベーターに戻して48時間培養します。最後に、感染させた細胞を15 mLポリプロピレンチューブに入れ、400 Gsで4分間遠心分離します。室温で培地を吸引し、その際細胞ペレットを乱さないように注意して、新鮮なRPMIで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントした後、感染させたRAMO細胞の分注量を10 cells/mLに調整します。各播種プレートにつき、最終容量10 millilitersになるようにRPMIコンディショニング培地とFBSの溶液を調製します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、希釈した細胞を96ウェルプレートの各ウェルに100 microlitersずつ播種します。プレートを37°C、5%二酸化炭素条件下で24時間インキュベートした後、顕微鏡を用いて各ウェルを確認します。単一細胞を特定するための適切な深さを決定するのは困難な場合があるため、細胞の存在を確認してください。まず、96ウェルプレートの底面に印字されているウェル番号に焦点を合わせるようにしてください。その後、2週間後に細胞の探索を試みます。油性ペンを用いて、ウェルの縁に沿って細胞コロニーがあるかを確認してください。細胞の増殖が旺盛なウェルに印を付け、その後、さらなる培養のためにコロニーを1 mLのRPMIが入った24ウェルプレートに移植します。数日間の培養後、細胞を6ウェルプレートに移植し、培養を継続します。6ウェルプレートに細胞コロニーを播種してから3週間後、各ウェルから5×10⁵個の細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。このとき、コントロールおよびHRNAノックダウンの各ウェルから細胞を回収し、さらに無染色コントロール用のサンプルを1つ採取します。次に、室温で400 Gs、4分間、すべての細胞を遠心分離します。2回目の遠心時には、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄してください。2回目の洗浄後、未染色のコントロールペレットを50 µLのPBSに、その他のペレットはPBSにPE標識抗ヒトIgM抗体を1:20に希釈して加えた液に懸濁します。その後、すべての細胞サンプルを氷上で1時間インキュベートします。前述と同様にPBSでさらに2回細胞を洗浄し、上清を捨てて、すべてのペレットを100 µLのPBSで再懸濁します。次に、再懸濁した染色済み細胞およびコントロールの未染色細胞をファルコンチューブに移し、フローサイトメトリーで細胞を分析します。コントロールと比較して、S-H-R-N-Aノックダウン細胞におけるIgM陰性細胞の割合を比較してください。IDのためのレトロウイルス過剰発現ベクターをbosque 23細胞にトランスフェクションしました。その後、ウイルスを回収し、野生型（wt）およびAID過剰発現細胞（AID.High）の両方のRamos細胞に感染させました。シングルセルで播種し3週間培養した後、定量RT-PCRを用いて遺伝子発現を解析しました。予想通り、定量RT-PCRの結果から、AID過剰発現ベクターを感染させた細胞においてAID発現が著しく増加していることが示されました。また、感染細胞におけるIgMの消失をFACsで評価しました。前図の3週時点での表面IgMをFACsで測定し、野生型細胞とAID.High細胞におけるIgM消失率を算出してここにグラフで示しました。予想通り、AID過剰発現細胞では表面IgMのより大きな消失が認められました。別の実験において、コントロールとして無関係なS-H-R-N-Aを含むレンチウイルス、またはSHMを保護すると予想される高忠実度DNA修復因子に対するS-H-R-N-Aを含むレンチウイルスをbosque 23細胞で作製しました。その後、これらのレンチウイルスをRamos細胞のa ID highクローンに感染させました。再度、遺伝子発現を解析したところ、予想通り、当該因子に対する標的S-H-R-N-Aの存在下でDNA修復因子のレベルが低下していることが観察されました。また、修復因子はSHM中の変異に対する保護能を提供すると考えられているため、3週間後に単一細胞クローンにおけるIGM喪失を解析しました。この図で観察されるように、当該因子が存在しない場合、IGM喪失とSHMの増加が起こります。このビデオを視聴することで、raw B細胞株においてOVEREXPRESSIONまたはS-H-R-N-A含有コンストラクトを用いたウイルス感染を行う方法、およびそれらの細胞における体細胞超変異を測定する方法について十分に理解することができます。

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

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学ぶラモスB細胞における遺伝子発現制御と体細胞高頻度変異の評価手法。レトロウイルスまたはレンチウイルス感染を用いて過剰発現やノックダウンを行い、IgM解析と遺伝子シーケンスで変異を測定する。抗体多様化に関与する新規因子の同定に役立つ。

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

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