Name: 哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 学ぶ哺乳類のリンカーヒストンH1サブタイプ発現解析法。RT-qPCRと逆相HPLCを用いてmRNAとタンパク質レベルを同時定量し、クロマチン構造と遺伝子発現制御の理解を深める。

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この作品は、NIHの助成金GM085261とグルジアがん連合著名な学者賞（YFまで）でサポートされています。

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

アッセイのセットは、哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現レベルの包括的な分析を可能にするここで提示した。適切に設計された定量RT-PCRアッセイは、任意の哺乳動物ヒストンH1遺伝子からのRNAメッセージの機密性の高い正確な測定を提供しています。リンカーヒストンサブタイプ遺伝子の定量RT-PCRアッセイの重要な部分は、逆転写をベースにランダムプライマーを用いて、cDNAの調製である。最もH1遺伝子を含むほとんどのヒストン遺伝子のmRNAは、長いポリ他の細胞のmRNAに提示尾が含まれていません。したがって、オリゴ-dTプライマーを用いて従来の逆転写方法は、効率的にH1のcDNAを生成しません。ポリなどのH1 0として尾を含むmRNA転写産物でいくつかのH1遺伝子の発現解析は、おそらく、H1 RNAの高い豊富による定量RT-PCR（ 図3）に基づいてランダムヘキサマーと同様に効果的です。それにもかかわらず、oligo-dTプライマーとRT反応のためのランダムヘキサマーの混合物るには定量RT-PCRにより解析した遺伝子の広い範囲を可能にする、低コピー数であるポリアデニル化mRNAのRT...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> RNaseのザップ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td>インビトロジェン</td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBRグリーン</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI </td><td>シグマ</td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td>マイクロシール96ウェルPCRプレート</td><td>バイオ·ラッド</td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td>マイクロシール &#39;B&#39;粘着シール</td><td>バイオ·ラッド</td><td> MSB-1001 </tD&gt; </tr><tr><td>スクロース</td><td> Agrosオーガニック</td><td> AC40594 </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性水和物し（Na 2 HPO 4·7H 2 O） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP332 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01915 </td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム水和物（のNaH 2 PO 4·7H2O） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310 </td></tr><tr><td>完全なミニプロテイナーゼインヒビターカクテル錠</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E-5134 </td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF） </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01620 </td></tr><tr><td>ノニデット-40（NP-40） </td&gt; <td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01425 </td></tr><tr><td>塩化カリウム（KCl） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP366 </td></tr><tr><td>トリス[ヒドロキシメチルアミノメタン] </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB02000 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム（MgCl2を） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP214 </td></tr><tr><td>硫酸（H2SO4） </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム（NH 4 OH） </td><td> Agrosオーガニック</td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradfordタンパク質アッセイ</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸（TFA） </td><td> JTBaker </td><td> 9470から01 </td></tr></tbody></table>

哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

リンカーヒストンH1は高次構造にクロマチンの折り畳みを促進する、ヌクレオソームコア粒子とリンカーDNAに結合する。 H1は、哺乳動物の開発1に必須であり、 生体内 2-4 に 、特定の遺伝子発現を調節する。高度に保存されたヒストンタンパク質のうち、H1リンカーヒストンの家族は最も異質グループです。差動、開発中に、異なる種類の細胞で規制されている哺乳類の11のH1サブタイプがあります。これらのH1サブタイプは、5体H1S（H1A-E）、交換H1 0、4生殖細胞特異的H1サブタイプ、およびH1x 5があります 。 DNA結合親和性とクロマチンの圧縮能力6-9に異なる複数のH1サブタイプの存在は、クロマチン機能の変調の追加レベルを提供します。したがって、個々のH1サブタイプの定量的な発現解析、mRNAとタンパク質の両方が、それ以上の規制をより良く理解するために必要です注文クロマチンの構造と機能。 ここでは、個々のH1サブタイプ（ 図1）の発現レベルを分析するために設計されたアッセイのセットを記述する。様々なH1バリアント遺伝子のmRNAの発現は、より速くより正確に、ノーザンブロット分析の代替的アプローチと比べてはるかに少ないサンプルを必要とする高感度かつ定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）アッセイのセットにより測定されます。他のほとんどの細胞mRNAのメッセージとは異なり、H1遺伝子の大部分を含むほとんどのヒストン遺伝子、のmRNAは、長いポリAテールを欠いているが、3 &#39;非翻訳領域（UTR）10時ステム-ループ構造が含まれています。したがって、cDNAをランダムプライマーの代わりにオリゴdTプライマーを用いて逆転写によって全RNAから調製されています。各H1サブタイプに特異的なプライマー（ 表1）リアルタイムPCRアッセイは、個々のH1サブタイプのmRNAレベルの高い定量的な測定を得るために実行されます。だ。ハウスキーピング遺伝子の発現が正常化するためのコントロールとして解析されています。 各H1亜型とコアヒストンのタンパク質の相対量は、11月13日 、哺乳動物細胞から抽出した全ヒストンの逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）解析によって得られます。 HPLC法と溶出条件は、マウスのH1サブタイプの最適分離を与えるここで説明する。 HPLCプロファイルを定量化することによって、我々はH1ファミリー内の個々のH1サブタイプの相対的な割合を計算し、同様に細胞内でヌクレオソーム比にH1を決定します。

我々はH1リンカーヒストンの発現レベルを分析するためのアッセイのセットを記述します。 H1ヒストンのタンパク質定量をHPLC分析することによって達成される一方、個々のH1遺伝子のmRNAを定量的、リアルタイムPCRに続いてランダムプライマーに基づいて逆転写反応によって測定される。

リンカーヒストンH1は、ヌクレオソームコア粒子およびリンカーDNAに結合し、クロマチンの高次構造への折り畳みを促進する。H1は不可欠であり……

本手順の全体的な目的は、H1 mRNAレベルの解析とH1タンパク質レベルの測定の両方を通じて、ヒストンH1サブタイプの発現レベルを分析することです。mRNA解析を行うため、まず培養細胞またはマウス組織から全RNAを抽出します。手順の第2ステップでは、ランダムプライマーを用いて全RNAの逆転写を行い、続いて各H1サブタイプ遺伝子の定量リアルタイムPCRアッセイを実施します。ヒストンH1タンパク質の解析は、マウス組織または培養細胞から全ヒストン抽出物を調製することから始まります。続いて、逆相HPLC分析により、各H1サブタイプおよびコアヒストンH2Bの分画および定量を行います。最終的に、定量的リアルタイムPCRおよび逆相HPLC分析を用いて、各H1サブタイプのmRNAとタンパク質双方の発現レベルを示します。私たちはジョージア工科大学生物学部のDr.Yuhan FES研究室の大学院生です。本日は、哺乳類のH1サブタイプにおけるH1の発現解析のための包括的なアッセイセットをご紹介します。これらの一連のアッセイを通じて、さまざまなH1サブタイプにおけるmRNAとタンパク質の両方の発現レベルを定量的に測定することができます。ヒストンH1は、高次クロマチン折り畳みを促進する主要なクロマチン構造タンパク質です。細胞の分化や発生過程において、さまざまな発現パターンを持つ複数のヒストンH1バリアントが存在します。これらのH1サブタイプの発現プロファイリングは、高次クロマチン構造および機能の調節をより深く理解するために不可欠です。それでは、始めていきましょう。RNA抽出を行う前に、すべての作業面とピペットを70% ethanolで拭き取り、RNA除染溶液で処理してください。この処置により、RNAのコンタミネーションおよび分解の可能性を低減できます。さらに、すべての手順において手袋を着用してください。接着細胞培養からのRNA抽出を開始し、培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄します。次に、ウェルからPBSを除去します。高品質なRNAを得るには、十分な量のトライオール試薬が必要です。6ウェルプレートの1ウェルからRNAを抽出する場合、1 mLのトライオール試薬を使用し、トライオール試薬の取扱説明書に従って細胞からRNAを抽出してください。RNA抽出後、NanoDrop 1000を用いてRNA濃度を測定します。一般的な収量は、培養細胞 1×10⁶ 個あたり 5〜15 µg の RNA です。cDNA 合成に進む前に、微量のゲノム DNA による RNA 汚染の可能性を排除するため、GE 電気泳動により RNA の品質を分析し、メーカーの指示に従って RNA free DN で RNA サンプルを処理して、全 RNA を cDNA へ逆転写させます。メーカーの指示に従い、superscript

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このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

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3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

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哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析

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