Name: 哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 学ぶ哺乳類のリンカーヒストンH1サブタイプ発現解析法。RT-qPCRと逆相HPLCを用いてmRNAとタンパク質レベルを同時定量し、クロマチン構造と遺伝子発現制御の理解を深める。

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この作品は、NIHの助成金GM085261とグルジアがん連合著名な学者賞（YFまで）でサポートされています。

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

アッセイのセットは、哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現レベルの包括的な分析を可能にするここで提示した。適切に設計された定量RT-PCRアッセイは、任意の哺乳動物ヒストンH1遺伝子からのRNAメッセージの機密性の高い正確な測定を提供しています。リンカーヒストンサブタイプ遺伝子の定量RT-PCRアッセイの重要な部分は、逆転写をベースにランダムプライマーを用いて、cDNAの調製である。最もH1遺伝子を含むほとんどのヒストン遺伝子のmRNAは、長いポリ他の細胞のmRNAに提示尾が含まれていません。したがって、オリゴ-dTプライマーを用いて従来の逆転写方法は、効率的にH1のcDNAを生成しません。ポリなどのH1 0として尾を含むmRNA転写産物でいくつかのH1遺伝子の発現解析は、おそらく、H1 RNAの高い豊富による定量RT-PCR（ 図3）に基づいてランダムヘキサマーと同様に効果的です。それにもかかわらず、oligo-dTプライマーとRT反応のためのランダムヘキサマーの混合物るには定量RT-PCRにより解析した遺伝子の広い範囲を可能にする、低コピー数であるポリアデニル化mRNAのRT...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> RNaseのザップ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td>インビトロジェン</td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBRグリーン</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI </td><td>シグマ</td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td>マイクロシール96ウェルPCRプレート</td><td>バイオ·ラッド</td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td>マイクロシール &#39;B&#39;粘着シール</td><td>バイオ·ラッド</td><td> MSB-1001 </tD&gt; </tr><tr><td>スクロース</td><td> Agrosオーガニック</td><td> AC40594 </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性水和物し（Na 2 HPO 4·7H 2 O） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP332 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01915 </td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム水和物（のNaH 2 PO 4·7H2O） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310 </td></tr><tr><td>完全なミニプロテイナーゼインヒビターカクテル錠</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E-5134 </td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF） </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01620 </td></tr><tr><td>ノニデット-40（NP-40） </td&gt; <td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB01425 </td></tr><tr><td>塩化カリウム（KCl） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP366 </td></tr><tr><td>トリス[ヒドロキシメチルアミノメタン] </td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB02000 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム（MgCl2を） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP214 </td></tr><tr><td>硫酸（H2SO4） </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム（NH 4 OH） </td><td> Agrosオーガニック</td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradfordタンパク質アッセイ</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸（TFA） </td><td> JTBaker </td><td> 9470から01 </td></tr></tbody></table>

哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

リンカーヒストンH1は高次構造にクロマチンの折り畳みを促進する、ヌクレオソームコア粒子とリンカーDNAに結合する。 H1は、哺乳動物の開発1に必須であり、 生体内 2-4 に 、特定の遺伝子発現を調節する。高度に保存されたヒストンタンパク質のうち、H1リンカーヒストンの家族は最も異質グループです。差動、開発中に、異なる種類の細胞で規制されている哺乳類の11のH1サブタイプがあります。これらのH1サブタイプは、5体H1S（H1A-E）、交換H1 0、4生殖細胞特異的H1サブタイプ、およびH1x 5があります 。 DNA結合親和性とクロマチンの圧縮能力6-9に異なる複数のH1サブタイプの存在は、クロマチン機能の変調の追加レベルを提供します。したがって、個々のH1サブタイプの定量的な発現解析、mRNAとタンパク質の両方が、それ以上の規制をより良く理解するために必要です注文クロマチンの構造と機能。 ここでは、個々のH1サブタイプ（ 図1）の発現レベルを分析するために設計されたアッセイのセットを記述する。様々なH1バリアント遺伝子のmRNAの発現は、より速くより正確に、ノーザンブロット分析の代替的アプローチと比べてはるかに少ないサンプルを必要とする高感度かつ定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）アッセイのセットにより測定されます。他のほとんどの細胞mRNAのメッセージとは異なり、H1遺伝子の大部分を含むほとんどのヒストン遺伝子、のmRNAは、長いポリAテールを欠いているが、3 &#39;非翻訳領域（UTR）10時ステム-ループ構造が含まれています。したがって、cDNAをランダムプライマーの代わりにオリゴdTプライマーを用いて逆転写によって全RNAから調製されています。各H1サブタイプに特異的なプライマー（ 表1）リアルタイムPCRアッセイは、個々のH1サブタイプのmRNAレベルの高い定量的な測定を得るために実行されます。だ。ハウスキーピング遺伝子の発現が正常化するためのコントロールとして解析されています。 各H1亜型とコアヒストンのタンパク質の相対量は、11月13日 、哺乳動物細胞から抽出した全ヒストンの逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）解析によって得られます。 HPLC法と溶出条件は、マウスのH1サブタイプの最適分離を与えるここで説明する。 HPLCプロファイルを定量化することによって、我々はH1ファミリー内の個々のH1サブタイプの相対的な割合を計算し、同様に細胞内でヌクレオソーム比にH1を決定します。

我々はH1リンカーヒストンの発現レベルを分析するためのアッセイのセットを記述します。 H1ヒストンのタンパク質定量をHPLC分析することによって達成される一方、個々のH1遺伝子のmRNAを定量的、リアルタイムPCRに続いてランダムプライマーに基づいて逆転写反応によって測定される。

リンカーヒストンH1は、ヌクレオソームコア粒子およびリンカーDNAに結合し、クロマチンの高次構造への折り畳みを促進する。H1は不可欠であり……

本手順の全体的な目的は、H1 mRNAレベルの解析とH1タンパク質レベルの測定の両方を通じて、ヒストンH1サブタイプの発現レベルを分析することです。mRNA解析を行うため、まず培養細胞またはマウス組織から全RNAを抽出します。手順の第2ステップでは、ランダムプライマーを用いて全RNAの逆転写を行い、続いて各H1サブタイプ遺伝子の定量リアルタイムPCRアッセイを実施します。ヒストンH1タンパク質の解析は、マウス組織または培養細胞から全ヒストン抽出物を調製することから始まります。続いて、逆相HPLC分析により、各H1サブタイプおよびコアヒストンH2Bの分画および定量を行います。最終的に、定量的リアルタイムPCRおよび逆相HPLC分析を用いて、各H1サブタイプのmRNAとタンパク質双方の発現レベルを示します。私たちはジョージア工科大学生物学部のDr.Yuhan FES研究室の大学院生です。本日は、哺乳類のH1サブタイプにおけるH1の発現解析のための包括的なアッセイセットをご紹介します。これらの一連のアッセイを通じて、さまざまなH1サブタイプにおけるmRNAとタンパク質の両方の発現レベルを定量的に測定することができます。ヒストンH1は、高次クロマチン折り畳みを促進する主要なクロマチン構造タンパク質です。細胞の分化や発生過程において、さまざまな発現パターンを持つ複数のヒストンH1バリアントが存在します。これらのH1サブタイプの発現プロファイリングは、高次クロマチン構造および機能の調節をより深く理解するために不可欠です。それでは、始めていきましょう。RNA抽出を行う前に、すべての作業面とピペットを70% ethanolで拭き取り、RNA除染溶液で処理してください。この処置により、RNAのコンタミネーションおよび分解の可能性を低減できます。さらに、すべての手順において手袋を着用してください。接着細胞培養からのRNA抽出を開始し、培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄します。次に、ウェルからPBSを除去します。高品質なRNAを得るには、十分な量のトライオール試薬が必要です。6ウェルプレートの1ウェルからRNAを抽出する場合、1 mLのトライオール試薬を使用し、トライオール試薬の取扱説明書に従って細胞からRNAを抽出してください。RNA抽出後、NanoDrop 1000を用いてRNA濃度を測定します。一般的な収量は、培養細胞 1×10⁶ 個あたり 5〜15 µg の RNA です。cDNA 合成に進む前に、微量のゲノム DNA による RNA 汚染の可能性を排除するため、GE 電気泳動により RNA の品質を分析し、メーカーの指示に従って RNA free DN で RNA サンプルを処理して、全 RNA を cDNA へ逆転写させます。メーカーの指示に従い、superscript 3 first strand synthesis system を使用してください。ほとんどの H1 遺伝子の mRNA にはポリ A 尾部がないため、プライマーとして oligo dT ではなくランダムヘキサマーを使用することが不可欠です。cDNA合成において、逆転写後のcDNA増幅は、qPCRアッセイに先立ちSYBR Green染料で検出されるqRT-PCRを通じて行うことができます。各H1遺伝子および内部標準遺伝子に特異的なフォワードおよびリバースPCRプライマーを設計し、記述されたプロトコルに従って標準曲線法によりプライマー効率を検証しました。プライマー、cDNA、およびSYBR Green Superを混合し、各PCR反応液を調製してください。micros EAL 96ウェルPCRプレート内で反応液を十分に混合し、micros EAL B粘着シールを使用してプレートカバーを確実に密封します。次に、密封したプレートをボルテックスし、反応混合液を短時間遠心して集液します。その後、プレートをMy IQシングルカラーリアルタイムPCR検出システムにセットし、qPCRを行います。QPCRの条件を設定し、増幅後の本文に記載された指示に従ってランを実行します。増幅曲線を確認し、PCR効率およびサイクル閾値（CT値）を検討します。閾値ラインは、IQ five optical system software version 2.0によって自動的に設定することが可能です。Cyber greenはあらゆる二本鎖DNAを検出するため、プライマーダイマーやコンタミネーションではなく、目的のアンプリコンが確実に増幅・検出されたかを確認するために、qPCRの後に融解曲線分析を行うことが極めて重要です。融解曲線分析プログラムでは、qPCR装置を用いてサンプルを55°Cから95°Cまで0.5°C刻みで加熱し、データを収集します。二本鎖DNAの温度またはTm値はアンプリコンの長さとGC含有量に依存するため、アンプリコンによってTm値は異なります。QPCR産物の微分融解曲線を確認し、目的のアンプリコンの特異的な融解温度および、ノイズアンプリコンピークの不在を確認します。ここでは、TMが86 °CであるH1A PCRアンプリコンの融解曲線を示しています。続いて、IQ5オプティカルシステムソフトウェアを用いてQPCRデータを解析します。H1アイソフォーム遺伝子の発現値をハウスキーピング遺伝子の発現で標準化し、H1遺伝子の相対発現量を得ます。安楽死させたマウスから目的の臓器を摘出した後、氷冷PBSで洗浄します。本デモンストレーションでは、洗浄後の肝臓を用いて全ヒストーンの調製を行います。組織をカミソリで細かく刻みます。刻んだ組織をドゥーンホモジェナイザーに移し、組織1gあたり10mLの容量のスクロース緩衝液をホモジェナイザーに加えます。組織を10〜15回ストロークしてホモジナイズします。ホモジナイズした試料を15 mLチューブに移した後、500 RPMで30秒間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に新しいチューブに移し、2000 RPMで5分間遠心分離します。細胞をペレット化するため、0.5% NP 40を添加した10 mLのスクロースバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。サンプルをダウンホモジナイザーに移し、20分間のインキュベーション中に10回ストロークします。これで、核が回収されます。顕微鏡下で核の品質を確認します。2000 RPMで5分間遠心分離して核をペレット化した後、上清を廃棄します。次に、組織1gあたり3mLの高塩濃度バッファーで核ペレットを再懸濁します。サンプルを小型のダウンホモジナイザーに移し、5〜10回ストロークしてホモジナイズします。懸濁液を3本のエッペンドルフチューブに分注します。チューブを氷上で20分間インキュベートします。インキュベーション後、14,000 RPMで10分間遠心分離し、クロマチンをペレット化します。上清を捨てた後、各クロマチンペレットに0.2 N硫酸を0.8 mL加えて、全ヒストンを抽出します。エプンドールチューブ用ペスルを用いて、ペレットが完全に分散するまで十分に研磨してください。サンプルを回転プラットフォーム上で 4 °C で一晩インキュベートします。遠心分離後、上清を 2 本の EOR チューブに移します。各チューブに氷冷エタノールを 2.5 倍量加えます。サンプルを-20°Cで一晩保存し、翌日に14,000 RPMで10分間遠心分離して全ヒストンをペレット化し、上清を捨てます。ペレットを70% ethanolで3回洗浄した後、チューブの蓋を開けたままベンチ上に20〜30分間置いて風乾させ、直ちにHPLC分析に進みます。逆相カラムの容量およびHPLC装置に応じて、推奨される量の二回蒸留水でヒストンペレットを再懸濁し、14,000 RPMで5分間遠心分離します。不溶性残留物を除去するため、GE ACTA purifier UPC 900などのHPLCシステムの逆相カラムに、50～100 µgの全ヒストンタンパク質を注入します。カラムの目詰まりを防ぐため、過剰な量のタンパク質の添加は避けてください。記述されたプロトコルに従い、アセトニトリルの勾配を上昇させながら、分画8、リンカーヒストン、およびコアヒストンを分離します。流出液は214 nmでモニタリングし、HPLCプロファイルを記録して解析します。また、さらなる解析のために、GE FRAC 920分画オートコレクターを用いてタンパク質分画を回収することも可能です。ここでは、マウス肝細胞およびマウス胚性幹細胞から調製した cDNA を用いた H1 の qPCR 反応の典型的な増幅曲線を示します。増幅プロットを評価すると、各サンプルの 3 回の qPCR 反応でほぼ同一の CT 値を伴う一貫したシグナルが得られており、高い再現性が示唆されました。RT マイナス qPCR 反応においてアンプリコンの蓄積が見られないことは、ゲノム DNA の混入がなかったか、あるいは最小限であったことを示しています。H1 遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の CT 値を用いて、各 H1 遺伝子の相対的な RNA 発現レベルを算出しました。ここに示されているグラフは、H1A遺伝子およびH1.0遺伝子の算出結果の例です。H1A mRNAの相対的な発現レベルは、マウス肝臓と比較してマウス胚性幹細胞でより高く、一方でH1.0の発現は胚性幹細胞よりも肝臓で格段に高くなっています。マウス胚性幹細胞と成体マウス肝臓におけるH1AまたはH1.0の発現の差は、ヒストンタンパク質のHPLCプロファイルからも明らかです。H10。分化特異的なH1は、成マウスの肝臓に大量に蓄積しています。対照的に、H10タンパク質は未分化のマウス胚性幹細胞にはほとんど存在しません。一方、H1Aは胚性幹細胞で高度に発現しているが、H1ピークの定量化により、成マウスの肝臓では低レベルで存在することが示されている。HPLCプロファイルを用いて、成マウス肝臓におけるH1ファミリー内の各H1サブタイプの相対的な割合を決定する。さらに、対応するH1サブタイプの214 nanometersにおける吸光度の正規化ピーク値と、H2Bの正規化値の2分の1との比から、ヌクレオソームあたりの個々のH1サブタイプの値を算出できる。同様に、ヌクレオソームあたりの全H1についてもこの値を算出することが可能である。習熟すれば、H1サブタイプのQ-R-T-P-C-R解析は1日で完了し、ヒストン抽出およびHPRC解析は適切に行えば3日で完了させることができます。ヒストンH1遺伝子のQ-R-T-P-C-R解析を行う際は、RNAの分解を避け、ゲノムDNAの混入を除去し、そして最も重要な点として、逆転写反応にランダムプライマーを添加することが不可欠です。ヒストンの抽出およびHPOC解析においては、タンパク質の分解を防ぐため、抽出バッファーにタンパク質阻害剤を新鮮な状態で添加することが重要であり、また、ヒストンの完全な抽出を促進するために、クロマチンを完全に分散させることに注意を払う必要があります。このビデオを視聴することで、哺乳類のヒストンH1サブタイプの発現をmRNAおよびタンパク質レベルの両方で包括的に分析する方法について、十分に理解できるはずです。

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生物学

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

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このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

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ヒストンアセチルトランスビシ酵素(HAT、リジンアセチルトランスビセラーゼとも呼ばれる)の阻害剤は、CBP/p300などの、癌を治療するための潜在的な治療薬です。しかし、これらの阻害剤を検証するための厳格な方法が必要です。検証のための3つのin...

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

DNAカーテンは、ハイスループットな1分子イメージング技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用をリアルタイムで可視化するためのプラットフォームを提供します。現在のプロトコルはAbo1の Schizosaccharomycesのpombe のbromodomain含んでいるAAA+...

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このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。...

肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

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