Name: 異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ アルギン酸マイクロカプセルを用いた3D培養システムでヒト胚性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させる方法。28日間の分化プロトコルにより細胞間相互作用と分化効率が向上し、パーキンソン病治療への応用が期待されます。

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この作品は、医学のNHMRCプログラムグラント＃568969（PSS）と学部、ニューサウスウェールズ大学、幹細胞イニシアティブ（KSS）によってサポートされています。

以下の手順のすべてがクラスIIバイオセーフティキャビネット内無菌技術を使用して行われている。使用する試薬や機器は、以下の表に記載されています。 1。 1.1％アルギン酸（w / v）の準備<ol><li>滅菌した50mlのチューブにアルギン酸ナトリウム（高グルクロン酸含有量≥60％、粘度&gt; 200メガパスカル秒、エンドトキシン≤100 EU / g）を精製した0.275グラムを追加し、25 mlの滅菌0.1パーセントゼラチン溶液、事前に準備を追加（0.5グラムgelatin/500ミリリットルミリ-Q H 2 O、オートクレーブで溶解したもの）。 </li><li>部分的にアルギン酸塩粉末を溶解するのに約30秒間ボルテックスチューブは一晩、10×gで軌道ミキサー上にチューブを置きます（室温）。 </li><li>アルギン酸塩溶液25mlの9％滅菌食塩（NaCl/50ミリリットルミリ-Q H 2 O 4.5 g）の2.778ミリリットルを追加します。 5分95×gで遠心分離し、続いて約30秒間ボルテックスチューブを。 </li><li> 4でアルギン酸塩溶液を保存°、短期記憶（1-2ヶ月）または-20℃で長期保管（年程度）のC。 </li></ol> 2。 CaCl 2を析出槽の準備<ol><li>ミリ-Q H 2 Oの1リットルのCaCl 2の14.7グラム。2H 2 OとHEPESの2.38グラムを溶かす</li><li> 7.4のpHレベルを調整します。 </li><li> 0.22μmのフィルターを使用してソリューションを殺菌する。 </li><li>沈殿槽は室温（6-12ヶ月）で保存することができます。 </li></ol> 3。カプセル化解除溶液の調製<ol><li>ダルベッコのリン酸500mlに生理食塩水（D-PBS）をバッファ、0.5M EDTA 50mlと1M HEPES、5 mlを加える。 </li><li> 20分間121℃0.22μmのフィルターまたはオートクレーブ°Cを使用して滅菌する。 </li><li>室温（6-12ヶ月）でカプセル化解除ソリューションを保存します。 </li></ol> 4。血清代替物（SR）培地の調製<ol><li>前のカプセル化には、DEのように事前にSR培地を調製特定の試薬や機器の表にスクライブ。 </li></ol> 5。 ROCK阻害剤の調製（Y-27632） <ol><li>ヒトD-PBSで（HSA）血清アルブミン5 mM溶液を作るため0.1％Y-27632の粉末を希釈する。 </li></ol> 6。カプセル化のためのhESCの準備<ol><li> 37°C（光から保護）で2時間ROCK阻害剤（RI）の10μMを添加した培養培地で細胞を事前に扱います。 </li><li> RI処理後、37℃で10分間accutaseで酵素的に二回D-PBSで細胞を洗浄し、培養プレートから細胞を除去する</li><li>静かにピペットやセルスクレーパーで細胞をこすり、15 mlチューブに収集されます。 1:1の比率でSR培地でaccutaseを中和する。 </li><li>単一細胞懸濁液を調製し、40μmのフィルターを用いて中和し、細胞をフィルタリングし、新鮮な50 mlの遠心チューブに集める。 </li><li>血球計を使用して、ソリューション内のセルの合計数を計算します。 </LI&gt; <li> 5分間細胞懸濁液を95×gで遠心し、慎重に、その後上清を捨てる。予め温めておいた0.9％のNaClで細胞を洗浄します。 5分95×gで遠心し、上清を捨てる。 </li></ol> 7。細胞のカプセル化<ol><li> 14G×2 &quot;IVカテーテルの軟質プラスチックチューブに取り付けられた1 mlの注射器を準備します。これは、図1に示すように、シリンジポンプにロードされて細胞懸濁液を吸引するために使用されます。 </li><li> 125万細胞/ mlアルギン酸塩の密度で予め温めておいたアルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。静かに注射器で混ぜて泡を作成することは避けてください。 </li><li>図1に示すように、ビーズジェネレータ、シリンジポンプとエアフローメータを設定します。これらのデバイスの詳細については、特定の試薬や機器の表に記載されています。 </li><li>シリンジに吸引し、細胞と、IVカテーテルのプラスチックチューブを廃棄し、カプセルマシンにシリンジを接続します。 10 cmの隙間ががあることを確認してください<html>図1に示すように、カプセル化マシンとコレクションポイントの終了をトゥイーンする。 </li><li> 20ミリリットル/時間、8 L / minで、100 kPaの（カプセルのサイズは空気の流量を変えることによって変更することができます）の圧力の空気流量でシリンジポンプを設定することにより、細胞をカプセル化します。 </li><li>カプセルを安定させるための7分間予め温めておいた沈殿槽の20mlを充填したペトリ皿（100×15ミリメートル）にカプセル化された細胞を収集します。 </li><li>の0.9％NaCl 20mlを充填し50 mlの遠心チューブに穏やかな吸引によってカプセル化されたセルを転送します。 </li><li>ゆっくり、上清を捨てるカプセルがチューブの底に沈殿することができます。の0.9％NaClで洗浄プロセスを繰り返します。 </li><li>培養フラスコにRI（10μM）、転送を補充し、37℃/ 5％CO 2でインキュベート予め温めておいた培養培地中にカプセル化された細胞を再懸濁します。 </li></ol> 8。 DAニューロンにカプセル化されたhESCの分化ve_content &quot;&gt;カプセル化されたhESCが分化する前に3日間のRIで処理される。 <ol><li>シードマウス間質細胞株、0.1％ゼラチンコートT75フラスコおよび条件24時間の分化前にDA神経分化培地中のPA6細胞（材料表）で1.0×1cm 2当たり10 4の密度でPA6細胞。 </li><li> 50 mlの遠心管にカプセルを転送し、それらがチューブの底に沈殿することができます。 </li><li>上清を捨て、PA6細胞エアコンDA神経分化培地中でカプセルを懸濁します。 </li><li>その後4日目のメディアの変化と隔日で28日間培養PA6細胞単層（7.5×10 5 PA6細胞あたり9×10 6ヒトES細胞）とカプセル化のhESC（各時間は培地の半分だけを変更します）。 </li><li> PA6細胞と培養中の3週間後、残りの週に100 ng / mlのSHHおよび100 ng / mlのFGF8aでDA神経分化培地を補足するものです。 </LI&gt; </ol> 9。カプセル化されたhESCのカプセル化解除<ol><li> 15 mlの遠心管にカプセルを吸引し、それらをチューブの底に沈殿することができます。その後、慎重に上清を捨てる。 </li><li>二回D-PBSでカプセルを洗浄します。その後、上清を除去するカプセルがチューブの底に沈殿しましょう​​。 </li><li>カプセルへの解決策をdecapsulating 5ミリリットルを追加します。 4から5分間室温でインキュベーションする前に吸引を介して完全に懸濁液を混ぜる。 </li><li> 3分95 xgでカプセル化が解除された細胞を遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 3分95×gで遠心分離し、続いてD-PBSで細胞ペレットを洗浄します。繰り返します。 </li><li>カプセル化が解除された細胞はさらに、単層として培養されたまたは下流の分析に使用することができます。 </li></ol> 10。代表的な結果アルギン酸マイクロカプセルの直径は400から500μmである。カプセル内の細胞の数はestimatでした一回のカプセルの総数で割った細胞の総数を計算することによってED。したがって、カプセル当たり約5.0×10 4個の細胞を推定した。このことから、我々はカプセルに含めることができるセルの最大数は、約1.0×10 5であることを想定しています。カプセル化されたhESCの生存率はカルボキシフルオレセインジアセテートsuccinimidlyエステル（CFDA）/ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイを用いて使用することにより決定&gt; 80％（図2）のとおりです。我々は1.1％に2.2％からアルギン酸塩濃度を減少させることによってと塩化バリウムの塩化カルシウムを沈殿槽を変更することにより、hESCのカプセル化の条件を最適化しました。これらの条件から、我々は1.1％アルギン酸カルシウムでカプセル化された細胞のみが生き残ることができることを示した、増殖し、in vitroで 1 に EBを形成しています。さらに条件を最適化するために、培養媒体とRIの効果は、Y-27632を調べた。図2および3に示すように、データは、RIのpreventeを実証D解離誘導アポトーシスと細胞の生存と昇格クラスター形成1,6を維持した 。さらに、HFF-CM + RIで培養したカプセル化されたhESCの生存率は、RIの補充せずに他のグループよりも有意に高かった。しかしながら、これはSR + RIで培養されたカプセル化されたhESCに有意差はなかった。同様に、BrdUアッセイを使用して、細胞増殖は、クラスタ（図3）へと発展して、単一の細胞として25％から75％に増加した。 TUNELによるアポトーシスアッセイは、HFF-CMから取得したクラスタでは、TUNELのために主に陰性であったのに対し、SR培地で培養したマイクロカプセル内の単一の細胞（データは示さず）アポトーシスであることを明らかにした。ある程度までは、bFGFを添加したHFF-CMには、Y-27632が存在しない場合にカプセル化されたヒトES細胞の生存と増殖を促進した。しかし、Y-27632による治療カプセル化の前に（2時間）と後（追加の4日間）が著しく強化された生存率、増殖およびカプセル化されたhESCのクラスター形成1.1％アルギン酸カルシウムマイクロカプセルインチ以前に我々は、カプセル化されたhESCのが正常胚体内胚葉1に分化させることができることを実証した。ここでは、DAニューロンにカプセル化されたのhESCを区別するために、3Dのプラットフォームとして、細胞カプセル化の応用を検討した。カプセル中の胚様体（EB）が分化した直接的、記載の条件下でカプセル化解除に形成されたhESCのは、90％以上の生存率との文化の2-3日後に進行性の神経細胞の形態（図4）を示した。 neuroprogenitorマーカー、PAX6およびDA神経マーカー、THは、分化の7日間（図5A）の後にアップレギュレートされている間の遺伝子発現解析では、多能性マーカーのダウンレギュレーション、OCT4を示した。免疫蛍光染色は、分化したhESCは、7日目にPAX6陽性（&gt; 80％）が、OCT4陰性であったことを明らかにした。さらに分化hESCの21日後のTH陽性（&gt; 90％）ニューロン（図5B）を示した。ウェスタンブロット解析でも示された14日からTH発現のアップレギュレーション（図5C）PAX6発現は、21日後のダウンレギュレーションであった。比較では、同様の条件下で2次元（2D）の環境下で培養した細胞（例えば、前の分化〜3日2時間RI後処理のためにRIの前処理）PAX6陽性細胞（の割合が高いの&gt; 80を維持して％）、分化期間中およびカプセル化（図5AおよびC）が提供する3D環境のようにTH陽性細胞（&lt;60％）に分化のように効率的ではありませんでした。

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

マウス胚性幹細胞とのhESCを使用して、いくつかの研究は、生体材料と組織工学2,3の3D培養システムの利点を実証した。我々は、アルギン酸バリウムよりもアルギン酸カルシウムでカプセル化されたときのhESCが有意に高い生存率を示したので、アルギン酸バリウムと比較してhESCの増殖と分化を研究するのに適した3Dプラットフォームとしてアルギン酸カルシウムマイクロカプセルを使用していました。この培養系は、また、膜7を越えて栄養分と酸素の高密度細胞培養と交換することができます。カプセル内で自発的な分化が以前に観察されている、それが未分化hESCのようにカプセル内で増殖し続けることが想定される、細胞がカプセルとフォーム奇形腫の1最終的にはブレイクアウトになります。カプセル化のもう一つの臨床応用は、ホストの受信者からの移植細胞の免疫防御を提供することです。それが予想されているのhESCと目の移植EIR誘導体は、未分化hESCのMHCクラスI抗原の発現の低レベル以来、免疫学的拒絶反応につながる可能性があります分化8の後に増加しています。また、移植は通常、免疫拒絶のプロ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アルギン酸塩（MVG UP Pronova） </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td>高いグルクロン酸含有量≥60％、粘度&gt; 200メガパスカル秒、エンドトキシン&lt;100 EU / gで</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0.9％のNaCl </td><td>バクスターヘルスケア</td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td>タイプJ1ビーズジェネレータ</td><td> Niscoエンジニアリング株式会社</td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td>マルチフェイザーシリンジポンプ</td><td>新時代のポンプシステム株式会社</td><td>モデルNE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> EZIフロー医療計</td><td>ガスコーニュ語システム</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td>メルク</td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td>ミリポア</td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G×2 &quot;IVカテーテル</td><td>テルモ</td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト-DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 10829-018 </td><td> SR培地（基礎）の</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td> SR培地（2 mM）を用</td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> SR培地（20％）の</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15070063 </td><td> SR培地（2.5 U / ml）を用</td&gt; </tr><tr><td>インスリン - トランスフェリン - セレン（ITS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 41400045 </td><td> SR培地（1x）を用</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td> SR培地（0.1 mm）の</td></tr><tr><td> MEM NEAAソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td> SR培地（5mM）を用</td></tr><tr><td>グラスゴー最小必須培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11710035 </td><td> DA神経分化培地（基礎）の</td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> DA神経分化培地（10％） </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11360070 </td><td> DA神経分化培地（1mM）を用</td></tr><tr><td> MEM NEAAソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td> DA nのeural分化培地（0.1 mM）を</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td> DA神経分化培地（0.1 mm）の</td></tr><tr><td>ソニックヘッジホッグ（SHH） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> DA神経分化（100 ng / ml）を用</td></tr><tr><td>線維芽細胞増殖因子8A（FGF8a） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 4745-F8-050 </td><td> DA神経分化（100 ng / ml）を用</td></tr></tbody></table>

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hescの）の伝播との差別化のための3dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

彼らは無限に培養で増殖し、身体の任意のセルのタイプに区別することができますので、ヒト胚性幹細胞（hESCの）は、細胞補充療法のための魅力的な代替供給源として浮上している。生体の様々なタイプも幹細胞のニッチ1-3模倣 ​​微小環境を提供するために、幹細胞培養に使用されている。後者は、カプセル化などの3次元（3D）環境4を提供することにより、特定の系統だけでなく、組織の組織に細胞間相互作用、細胞増殖、分化を促進するために重要である。細胞のカプセル化の原理は、3D文化2で半透膜の範囲内で生きている細胞の捕捉が含まれます。カプセルの孔径よりも大きくなり、ホストからの抗体および免疫細胞は、5除外されているのに対し、これらの膜は、膜を横切って栄養素、酸素と刺激の交換を可能にします。ここでは、事前に文化へのアプローチを送り、アルギン酸マイクロカプセルを用いた3次元微小でhESCのDAニューロンを区別します。我々は、カプセル化されたhESCの生存率を向上させる培養条件2を変更しました。我々はこれまでに大幅にカプセル化されたhESCの生存率を高め、3DプラットフォームP160-Rhoの関連コイルドコイルキナーゼ（ROCK）阻害剤、Y-27632およびヒト胎児線維芽細胞エアコン血清代替培地（HFF-CM）を加えていることが示されているている細胞は胚体内胚葉マーカー遺伝子1を表明した。我々は今、DAニューロンへのhESCと効率的な分化の伝播のために、この3Dプラットフォームを使用している。タンパク質および遺伝子発現解析は、DA神経分化の最終段階の後にチロシン水酸化酵素の発現の増加（TH）、DAニューロンのマーカーで、2週間後&gt; 100倍を示した。我々は、アルギン酸マイクロカプセルを使用して、我々の3Dプラットフォームは増殖を研究するために有用であるという仮説を立てたとの差別化を指示様々な系統にhESCの。この3Dシステムでは、分化の過程でのhESCからフィーダー細胞を分離することができ、また、将来的には移植時の免疫単離するための可能性を秘めています。

我々は、内胚葉とドーパミン（DA）ニューロンへの伝播および胚性幹細胞の分化のための効果的な3Dプラットフォームとしてマイクロカプセル化技術を最適化しました。また、移植時にホストからの細胞の免疫単離するための機会を提供しています。このプラットフォームは、他の細胞型に適応することができます。

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

ヒト胚性幹細胞（hESC）は、培養による増殖が可能であるため、細胞置換療法の有望な代替ソースとして注目されています。

本プロトコルは、ヒト多能性胚性幹細胞を3Dシステム内で封入し、ドーパミン作動性ニューロンへと分化させるために最適化されています。まず、コロニーをROCK阻害剤（RI）で処理し、単一細胞に解離させた後、アルギン酸ナトリウムと混合して封入デバイスに通します。RI処理を3日間継続し、封入された細胞をPA6細胞上に移して28日間分化させます。最終的に、遺伝子およびタンパク質発現解析により、ドパミン作動性ニューロンの生成効率が向上することが示されました。既存の2D分化プロトコルに対する本手法の主な利点は、これらの細胞を3D環境下で増殖および分化させようとする点にあり、この3D環境によって細胞を高密度に増殖させることが可能になります。また、これにより分化に向けてより良好な細胞間相互作用を得る機会も提供されます。そして第三に、その後の分化効率を向上させることができます。また、補足いたしますと、この手法は3D環境で増殖可能な他の種類の細胞にも応用可能です。なお、この手法は、細胞のアポトーシスを防ぎ、培養皿からの細胞の剥離を防止する特定のROCK阻害剤を用いて最適化されている点に留意してください。一般的に、この手法に慣れていない方は、この技術が組織培養で通常行われるものではないため、最初は苦労されることでしょう。以下のカプセル化技術は、Dean博士とChad博士による、R阻害剤型アルギン酸の適用、アルギン酸濃度、およびカプセル化装置の設定に関する要約研究に基づいて最適化されています。それでは、当研究室の博士課程学生であるJamieとKimが、このプロトコルを実演します。滅菌済みの50 mLチューブに入った275 mgの精製アルギン酸ナトリウムに、25 mLの滅菌済み0.1%ゼラチン溶液を加え、ボルテックスしてアルギン酸粉末を部分的に溶解させます。その後、チューブをオービタルミキサーに設置し、10 Gで一晩撹拌します。次に、アルギン酸溶液に9%滅菌塩化ナトリウムを加えます。30秒間ボルテックスし、次いで95×gで5分間遠心分離します。アルギン酸溶液は4°Cで保存してください。まず暗所で、10 µMのROCK阻害剤を添加した培地を用いてヒト胚性幹細胞を前処理します。37 °Cで2時間インキュベートします。次に、細胞を酵素的に剥離させるため、DPBSで2回洗浄します。Accutaneを添加し、10分間インキュベートします。37 °Cで、セルスクレイパーを用いて細胞を穏やかに回収し、15 mLチューブに移します。等量のSL培地を加えてAccutaneを中和します。その後、中和した細胞を40 µmフィルターを通して、新しい50 mL遠心チューブに回収します。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を注意深く除きます。その後、あらかじめ加温しておいた緩衝液で細胞を1回洗浄します。0.9%塩化ナトリウム。遠心分離して上清を除きます。ヒト胚性幹細胞を封入するため、まず、あらかじめ温めておいたアルギン酸溶液で細胞を再懸濁します。これを行うには、20 milliliter のシリンジを軟質プラスチックチューブに接続し、アルギン酸をシリンジ内に吸引します。次に、気泡が入らないように注意しながら、シリンジを用いて細胞懸濁液を穏やかに混合します。その後、細胞をシリンジ内に吸引します。プラスチックチューブを廃棄し、シリンジをカプセル化装置に取り付けます。次に、ビーズジェネレーター、シリンジポンプ、エアフローメーター、および塩化カルシウム沈殿浴の装置セットアップを行います。カプセル化装置の末端からペトリ皿の回収点まで、10 centimeterの隙間があることを確認してください。次に、シリンジポンプを10 milliliters per hourに設定します。空気流量を8 liters per minute、圧力を100 kilo pascalsに設定します。カプセル化された細胞を、あらかじめ温めておいた沈殿浴に7分間回収します。その後、緩やかな吸引によって、20 mLの0.9% Sodium chlorideを含む50 mL遠心チューブに移行させます。カプセルをチューブの底に沈殿させ、上清を静かに除いた後、0.9% Sodium chlorideで一度洗浄します。続いて、ROCK阻害剤を添加し、あらかじめ温めておいた培養培地で封入細胞を再懸濁します。培養フラスコに移し、3日間インキュベートします。マウス間質細胞株PA6を0.1%ゼラチンでコートしたT75フラスコに播種し、ドパミン作動性神経分化培地で24時間コンディショニングさせる。カプセルを50 mL遠心チューブに移し、チューブの底に沈殿させる。上清を捨て、PA6細胞でコンディショニングしたドパミン作動性神経分化培地でカプセルを再懸濁する。培地培養。カプセル化したヒト胚性幹細胞をPA 6細胞単層とともに21日間培養します。培地を補充する際は、培地を交換してください。毎回、培地の半分のみを交換し、PA 6細胞をドーパミン作動性神経分化で培養し続けます。誘導因子を添加した培地で1週間培養します。まず、カプセルを吸引し、15 mL遠心チューブに移します。カプセルが底に沈殿したら、上清を捨てます。DPBSで2回洗浄し、その都度上清を捨ててください。その後、5 mLの脱被膜溶液を加え、懸濁液を十分に混合します。室温で5分間インキュベートします。遠心分離してペレットを得た後、脱キャップ細胞をDPBSで2回洗浄し、これらの脱キャップ細胞を単層培養または直後のダウンストリーム解析に使用します。一般的な調製では、アルギン酸マイクロカプセルの直径は400〜500 µmとなります。ここでは、CFDAPIアッセイを用います。結果から、80%の生存率における緑色の生存カプセル化細胞を判定します。異なる時点でのカプセル化ヒト胚性幹細胞の生存率、増殖、およびアポトーシスの解析は、培養条件の最適化に寄与します。興味深いことに、ROCK阻害剤の効果により、解離誘導性アポトーシスが抑制され、細胞生存能が維持されるとともに、HFCMにriを添加して培養したカプセル化ヒト胚性幹細胞で優れた増殖が認められました。この例では、細胞封入を3Dプラットフォームとして適用し、封入されたヒト胚性幹細胞をドパミン作動性ニューロンへと分化させます。予想通り、胚体（embryo bodies）のサイズは時間の経過とともに増大し、脱封入後の細胞は、培養2〜3日後に進行性のニューロン形態を示し、生存率は90%を超えています。遺伝子発現解析では、多能性マーカーであるOCT fourのダウンレギュレーションが示されています。重要な点として、神経前駆細胞マーカーであるPAC sixおよびドーパミン作動性ニューロンマーカーであるthは、分化後7日後も引き続き発現が亢進しています。さらに分化したヒト胚性幹細胞では、21日後に90%以上のTH陽性ニューロンが認められます。ウェスタンブロット解析により、2D細胞培養システムと比較して3DシステムにおいてTHおよびPAC sixの良好な発現パターンが示されました。この手法を習得すれば、2時間で効率的に実施することが可能です。カプセル化の前後に、必ずROCK阻害剤を用いて細胞を処理してください。今後の実験に合わせて、分化誘導剤や阻害剤を変更することで、3D分化プロトコルを最適化できます。この特定の技術は、ヒトESLを封入し、3D環境下で分化させること、あるいは多くの疾患、特にパーキンソン病に対する細胞療法の可能性を目的としています。

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、3次元の足場内でのヒト神経幹細胞の発生と分化を示しています。足場上のラミニンコーティングは細胞の接着を促進し、成長因子を含まない神経培地は細胞分化を誘導し、神経前駆細胞は多孔質構造内でプロセスを多方向に拡張して三次元培養を形成します...

多孔質足場を用いたヒト神経幹細胞の3D培養への分化

このビデオでは、ヒト胚性幹細胞を神経オルガノイドにするための段階的なプロトコールが示されています。この方法では、ニューロンのロゼット形成を誘導し、その後、疎水性膜上で制御された成熟と最終培養を行い、完全に発達した神経オルガノイドを達成します。...

ヒト胚性幹細胞の神経オルガノイドへの分化と成熟

プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。...

回生研究ハーモニックナノ粒子

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

私たちは、多能性幹細胞(PS細胞)を同軸ノズルを用いてアルギン酸ヒドロゲルカプセルに封入する方法を確立しました。 これにより、細胞が過度に凝集するのを防ぎ、浮遊培養で細胞が受けるせん断応力を制限します。...

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。...

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。...

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

学ぶ アルギン酸マイクロカプセルを用いた3D培養システムでヒト胚性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させる方法。28日間の分化プロトコルにより細胞間相互作用と分化効率が向上し、パーキンソン病治療への応用が期待されます。

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