異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

このプロトコルは、多能性ヒト胚性幹細胞をカプセル化し、それらを3Dシステム内でドーパミン作動性ニューロンに分化するように最適化されています。まず、コロニーを岩石阻害剤またはRIで処理し、アルギン酸ナトリウムと混合したacuateで単一細胞に結合し、カプセル化装置を通過します。RI処理を3日間継続し、カプセル化した細胞をPA6細胞に移し、28日間分化します。

最終的に、遺伝子およびタンパク質発現解析は、ドーパミン作動性ニューロンの生成効率が高いことを示しています。既存の2D分化プロトコルに対するこの特定の手法の主な利点は、3D環境下でこれらの細胞を増殖および分化させようとすること、および3D環境が細胞を高密度に増殖できる機会を提供することです。そして、分化のためのより良い細胞間相互作用を持つ機会も与えます。

そして第三に、トラックでの差別化の効率も向上します。また、この特定の手法は、3D環境で伝播できる他のタイプの細胞にも適用できると付け加えることができます。例えば、この特定の技術は、細胞のアポトーシスを防ぎ、培養皿からの細胞の剥離を防ぐ特定の岩石阻害剤の使用に基づいて最適化されていることも覚えておいてください。

一般に、この手法に不慣れな個人は、この技術が通常組織培養で行われないため、最初は苦労するでしょう。以下のカプセル化技術は、Dr.Dean Dr.Chadのアルギン酸R阻害剤タイプの適用、アルギン酸塩濃度、およびカプセル化デバイス設定に関する概要研究に基づいて最適化されています。Jamieと私たちの研究室の博士課程の学生であるKimが、このプロトコルを実演します。

滅菌50ミリリットルのチューブボルテックスで275ミリグラムの精製アルギン酸ナトリウムに25ミリリットルの滅菌0.1%ゼラチン溶液を加えて、アルギン酸粉末を部分的に溶解します。次に、チューブをオービタルミキサーにGの10倍で一晩置きます。次に、アルギン酸溶液に9%滅菌塩化ナトリウムを加えます。

30秒間ボルテックスした後、Gの95倍で5分間遠心分離します。アルギン酸溶液を摂氏4度で保存します。まず、暗い環境で、ヒト胚性幹細胞を10マイクロモルの岩石阻害剤を添加した培養培地で前処理します。

摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、細胞をDPBSで2回洗浄して、細胞を酵素的に除去します。アキュテインを加え、10分間インキュベートします。

摂氏37度で、細胞スクレーパーで細胞をやさしく収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。アキュテインを等量のSLメディウムで中和します。次に、中和した細胞を40ミクロンのフィルターに通し、新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。

次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞を列挙します。遠心分離により細胞をペレット化し、穿孔器を慎重に廃棄する。次に、細胞を予温して一度洗います。

0.9%塩化ナトリウム。ゲインを遠心分離し、仰臥位を廃棄します。ヒト胚性幹細胞をカプセル化するには、まずResusが細胞を温熱アルギン酸溶液で懸濁します。

これを行うには、20ミリリットルのシリンジを軟質プラスチックチューブに取り付け、シリンジにアルギン酸塩を吸引します。次に、シリンジを使用して、気泡を作らずに細胞懸濁液を穏やかに混合します。次に、細胞をシリンジに吸引します。

プラスチックチューブを廃棄してから、シリンジをカプセル化機に取り付けます。ビーズジェネレーター、シリンジポンプ、エアフローメーター、塩化カルシウム沈殿槽の設置機器に進みます。カプセル化機の端とペトリ皿の収集ポイントとの間に10センチメートルの隙間があることを確認します。

次に、シリンジポンプを毎時10ミリリットルに設定します。毎分8リットルの空気流量と100キロパスカルの圧力。カプセル化された細胞を予熱沈殿槽に7分間集めます。

次に、20ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを含む50ミリリットルの遠心分離チューブに穏やかに吸引して移し、カプセルをチューブの底に沈殿させ、仰臥位を静かに廃棄し、0.9%塩化ナトリウムで一度洗浄します。カプセル化された細胞を、岩石阻害剤を添加した温熱培養培地に再懸濁します。培養フラスコに移し、3日間インキュベートします。

マウス間質線PAに6つの細胞を0.1%ゼラチンでコーティングしたT75フラスコに播種し、ドーパミン作動性神経分化培地を24時間コンディショニングします。カプセルを50ミリリットルの遠心分離管に移し、チューブの底に沈殿させます。す ?? 酸を廃棄し、カプセルをPA6細胞条件ドーパミン作動性神経分化に再懸濁します。.

ミディアムカルチャー。ヒト胚性幹細胞をPA 6細胞単層で21日間カプセル化しました。メディア交換を補充するとき。

毎回、培地の半分だけがドーパミン作動性神経分化でPA6細胞を培養し続けます。培地に誘導因子を1週間補充しました。まず、カプセルを吸引し、15ミリリットルの遠心チューブに移します。

カプセルが底に落ち着いたら、 ?? 下を捨てます。.DPBSで2回洗い、 ?? 下を捨てます。.次に、5ミリリットルのデキャップ溶液を加え、懸濁液を完全に混合します。

室温で5分間インキュベートします。ペレットを遠心分離した後、デキャップ細胞とDPBSで2回洗浄した後、デキャップ細胞を単層培養として使用するか、または即時下流分析のために使用します。一般的な調製物では、アルギン酸マイクロキャップの直径は400〜500ミクロンです。

ここでは、C-F-D-A-P-Iアッセイです。結果は、カプセル化されたヒト胚性幹細胞の生存率、増殖、およびアポトーシスの80%で緑色の生存細胞を決定し、異なる時点での培養条件を最適化するのに役立ちます。興味深いことに、岩石阻害剤の効果は、解離によるアポトーシスを防ぎ、細胞生存率を維持し、H-F-F-C-M plus riで培養されたカプセル化されたヒト胚性幹細胞の優れた増殖を示しています。

この例では、細胞カプセル化を3Dプラットフォームとして適用し、カプセル化されたヒト胚性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化します。予想通り、胚体のサイズは時間とともに増加し、decカプセル化細胞は、培養の2〜3日後に進行性のニューロン形態を示し、90%以上の生存率を示します。遺伝子発現解析では、多能性マーカーOCT 4のダウンレギュレーションが示されています。

重要なことに、神経前駆細胞マーカーPAC sixとドーパミン作動性ニューロンマーカーthは、分化の7日後もアップレギュレーションされたままです。さらに分化したヒト胚性幹細胞は、21日後に90%THを超える陽性ニューロンを示しています。ウェスタン損失解析により、3D細胞培養システム対2D細胞培養システムにおけるTHおよびPAC sixの良好な発現パターンが確認されています。

一度習得すれば、このテクニックは2時間で効果的に実行できます。カプセル化の前後に細胞を岩石阻害剤で処理することを忘れないでください。バリアント誘導剤または阻害剤は、将来の実験のために3D分化プロトコルを調整できます。

この特定の技術は、ヒトESLをカプセル化し、3D環境下で区別するか、多くの疾患、特にパーキンソン病の細胞治療の可能性を探ります。