Name: ヒトタンパク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ組織マイクロアレイの作成法と免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析。パラフィン包埋組織からコアを採取しブロック化し、ヒトタンパク質アトラスへのデータ統合も可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、クヌートとアリスウォレンバーグ財団からの補助金によって支えられている。ウプサラ、ストックホルム、インドの人間のタンパク質アトラスセンターの全体のスタッフは、ヒトタンパ​​ク質アトラスを生成するための努力のために承認されています。著者らは、撮影時に特にTMA制作の支援のための写真やエレーヌKarlbergの支援についてはフランクHammarとソフィー·グスタフソンに感謝したいと思います。

<ol><li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitumor+%28sausage%29+tissue+block%3A+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li>
<li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li>
<li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019(2008).</li>
<li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920(2005).</li>
<li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li>
<li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+monospecific+antibodies%3A+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li>
<li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li>
<li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li>
<li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays%3A+a+tool+for+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li>
<li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142(2007).</li>
<li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564(2009).</li>
<li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%25+of+all+colorectal+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937(2011).</li>
<li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+%28TMAs%29+for+high-throughput+molecular+pathology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1(2001).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray%3A+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24(2001).</li>
<li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li>
<li>UniProt. Nucleic acids research. 39, D214(2011).</li>
<li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248(2010).</li>
<li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+in+immunohistology%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37(2011).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

免疫組織化学は、はるかにTMASための最も一般的に使用されるアプリケーションです。大規模な患者のコホートから組織サンプルに基づいて、IHCとTMASの組み合わせは、いくつかの異なる設定で使用することができ、組織7 8および細胞9 10におけるタンパク質発現パターンの例：ハイスループットスクリーニング、バイオマーカー探索の研究11 12とより基本的な腫瘍の生物学異なる表現型/遺伝子型、分化段階、進行や転移13を含む研究では、。 TMASを使用する利点の1つは大規模コホートからその材料が貴重な生物学的材料を節約し、より再現性の実験を確実に両方、一度に分析することができます。また、TMA技術の使用は、試薬コストや研究室の処理時間を節約できます。 TMAのみが組織の限られた量が含まれているため、組織の不均一性が問題です。組織と対処すべき問題の種類に応じて、いくつかのサンプルが同じspecimeから必要になることがありますN。それは全体の組織切片を13 14の表現で高精度をもたらすことが示されているように腫瘍組織については、各標本二から四までのコアの使用をお勧めします。組織の組成に応じてパンチ（0.6ミリメートルから2ミリメートルまでの範囲）の直径を調整することができます。組織は、いくつかの異なる種類の細胞、構造および細胞外マトリックスの両方の複雑で構成されています。脂肪の可変量を含む、それぞれ異なる組織型の組成物は、血管、結合組織、軟骨などは、独立したコアをパンチングして収集するために必要な圧力に影響を与えます。それが意図した実験のために定義されている組織とTMAを生成する前に、任意の値ではありません材料にすべての手順を練習するに重要である。 1 TMAブロック内の異なる組織の様々なセクショニング時にブロックの構成は、高品質のセクションを取得する能力に影響を与える可能性がある。 CErtain組織、例えば皮膚、骨髄、脂肪、脳、乳房、セクションでは、水浴中で伸ばす方法差押質感の違いの影響を受けることにより困難にTMAブロックの切片とどのように異なる硬度レンダリングは、ブレード等により切断されしたがって、1 TMAは、該当するに似た機能などの脂質の豊富な組織を持つグループ組織することを推奨します。癌組織の大半はこの意味で同質であり、これは癌のTMASの切片が容易になります。組織の異種タイプのTMAを取り扱う際にはマイクロアレイコアを安定させるための代替的切断法を採用することができる。粘着テープの使用は、断面のTMAのコアと秋アウトの損失を避けるために役立ちます。テープ断面のコアの厚さに影響を与え、その後も、IHC染色15の結果できるので、粘着テープの使用は、慎重に使用すべきである。 9x8の人間のタンパク質アトラスのセットアップTMAテンプレート（マーカーを除く）コアのAReが使用されます。それは、セクションの最大数を取得し、ブロック全体で表されるすべての組織を維持するために重要である。試薬とスキャン時間を節約するために、2つのセクションは、9x8の最大のテンプレートを可能にする1スライドガラス上に配置されています。 タンパク質については、ユニバーサルタンパク質リソース16の主要なリポジトリでは、唯一の約66％がタンパク質レベルでの証拠を持っているのは約20.300件のヒトタンパク質のエントリが含まれています。また、タンパク質レベルでの存在の証拠があるのための遺伝子の大半は、希少またはタンパク質の機能と発現の分布に関する情報があります。今後の重要な課題は、分布パターンとヒト組織の様々なタイプのこれらの未知のタンパク質の相対量を分析することです。そのようなUNIPROT、ENSEMBL、PubMedから出版されたデータなどのデータベースからの情報は、免疫組織化学的染色パターンに対する抗体を使用している場合を確立するためのガイドとして使用することができます病棟未知のタンパク質は、目的の標的タンパク質の実際のタンパク質プロファイルを表しています。さらに、いくつかの他の検証戦略は、タンパク質配列、ウェスタンブロット、免疫蛍光法、免疫沈降やプルダウン実験の例では抗体の機能のために、抗体の機能を確保するために必要とされている。おそらく、抗体の機能を検証するための最も重要なツールでは、ペアの抗体を使用すること、すなわち2つの異なる抗体は、アッセイに固有の結果17を比較するために、同じ標的タンパク質上の別個の、重複しないエピトープに対して提起した。 コンパイルされた情報に基づいて、抗体はIHCの標準と人間のタンパク質アトラスプロジェクトの35.000抗体を介してテストおよび検証の経験に基づいてテストされ、滴定されています。タンパク質プロファイルを持つすべての遺伝子の20％以上の場合は、ペア抗体（同じタンパク質上の非重複エピトープに向かって2つ以上の抗体）からのデータは、最高の推定値を決定するために使用されています対応するタンパク質の発現パターンのメイト。ペアの抗体は、特定の免疫組織化学ベースのタンパク質発現パターンを検証するための究極の戦略を提供しています。基本的なスクリーニングに含まれている別の組織の多くは、交差反応のリスクを増加させるので、この戦略は、貴重なものです。それは特定の組織は、一般的にバックグラウンド染色例、マクロファージ、平滑筋、肝臓、腎臓及び肝細胞の遠位尿細管を表示する傾向があることにも留意すべきである。偽陰性または不適切なポジティブIHC染色パターンになることがアーカイブ材料から採取した組織のために時間をかけて組織の処理技術のバリエーションを含んで考慮すべきその他の問題。この現象は、大規模なセクション分析で検出されました。正および負の両方のコントロールが不可欠であり、可能な限り使用する必要があります。対応するTRの機能解析、強制発現細胞株および特定のノックダウンを含む、より深い研究のためのanscripts（siRNA技術）は、コントロールを作成するために使用することができます。ホルマリン固定、架橋などの様々な化学修飾、抗原18をマスキングシッフ塩基の加水分解を誘導するため、IHCで最適な結果を得るためには、それが抗原検索システムをテストし、使用することが重要です。 結論として、TMA技術およびIHCを採用した抗体ベースのプロテオミクスでは、大規模なタンパク質の発現データを生成するための強力な戦略です。人間のタンパク質アトラスプロジェクトは、ヒト正常組織および癌におけるヒトタンパ​​ク質発現のマップを作成するように設定されている。このプロジェクトの目的は、2015年までに包括的なヒトタンパ​​ク質アトラスの最初の草案を提示することである。正常な臓器や組織中のタンパク質プロファイルを提供することに加えて、この努力は、臨床バイオマーカー探索の努力を含む生物医学研究プロジェクトの出発点を提供します。究極の目標は、ヒトゲノム配列の上に次の情報レイヤーを追加することですwiを様々な疾患状態の根底にある生物学をより深く理解するために重要である、および新規診断·治療ツールを開発するための基礎を提供するでしょう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>洗浄バッファーを</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td>バッファpH6でのクエン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td>抗体希釈液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRPポリマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB基質を加えたシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td>ウルトラVブロック</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td>一次抗体エンハンサー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td>メイヤーズヘマトキシリン</td><td> HistolAB </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>マニュアル組織マイクロアレイヤー</td><td> Estigen、ビーチャーインストゥルメント</td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td>滝ミクロトーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>マイクロモルHM 355S </td></tr><tr><td>自動化されたイメージスキャナ</td><td>アペリオ·テクノロジーズ</td><td> XT </td></tr><tr><td>自動化されたスライドの染色システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> deparafinizationと脱水のために自動化されたスライドの染色システム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td>自動化されたガラスcoverslipper </td><td>ライカビオスystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking室</td><td>バイオケア·医療</td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

組織マイクロアレイ（TMA）技術は、複数の組織や細胞のハイスループット分析のための手段を提供します。技術は、グローバルな正常ヒト組織におけるタンパク質発現パターンの解析、癌および細胞株、ヒトのタンパク質アトラスプロジェクト内で使用されます。ここでは、単一の受信TMAブロックに微視的に選択された代表的な組織から取得した1 mmのコアのアセンブリを、紹介します。 TMAブロックの数とコアのサイズは約40 2ミリメートルのコアから0.6ミリメートルのコアを最大数百個に変化させることができる。 TMA技術を使用する利点は、そのデータの大量を急速に実験的な変動を避けるために、単一の免疫染色プロトコルを使用して得ることができる。重要なのは、希少な組織の限られた量が大きな患者コホート1の分析のために可能にする、必要とされる。約250の連続した​​切片（4μmの厚さ）TMAブロックからカットし、免疫組織化学的stainiに使用することができます250種類の抗体に特定のタンパク質の発現パターンを決定するためにNG。人間のタンパク質アトラスプロジェクトでは、抗体は、すべてのヒトタンパ​​ク質に向かって生成され、ヒトの癌の20の最も一般的な形式を表す216別の患者から、144の個人および癌組織の両方から正常なヒトの組織で対応するタンパク質のプロファイルを取得するために使用されています。免疫組織化学的にスライドガラス上に染色されたTMAのセクションは、病理医は免疫組織化学の結果を解釈し、注釈を付けることができ、そこから高解像度の画像を作成するためにスキャンされます。一緒に対応する病理学ベースの注釈データを持つイメージは、人間のタンパク質アトラスポータル（を通じて研究コミュニティのための公に利用できるようになります<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ）（ 図1）3。ヒトタンパ​​ク質アトラスは、人体内のタンパク質の分布と相対量を示す地図を提供しています。現在のバージョンシオンは、ヒトのゲノムによってコードされるすべてのタンパク質以上の61パーセントに相当する12.238ユ​​ニークな蛋白質のタンパク質発現データと1,100万件以上のイメージが含まれています。

組織マイクロアレイは、組織の多数からの同時情報を得るために効率的な方法が可能になります。組織の代表的な部品は、単一のパラフィンブロックに組み立てられます。ブロックからのセクションは、タンパク質の発現パターンの免疫組織化学および分析のために使用されます。デジタルスキャンは、データの分布に対応する画像を生成する。

組織マイクロアレイ（TMA）技術は、多数の組織および細胞の高スループット解析を可能にします。この手法は、... 内で用いられています。

本手順の総合的な目的は、Human Protein Atlasのようなハイスループットプロジェクトにおいて、複数の組織からタンパク質発現に関する情報を同時に取得するための効率的な手法を用いることです。これは、まずホルマリン固定パラフィン包埋組織の代表的な領域を選択し、次にマークした領域をパンチで抜き取り、選択したコアを単一のパラフィンブロック（組織マイクロアレイ）に組み立てることで達成されます。次に、TMAから切片を作成し、免疫組織化学染色を行います。最後に、タンパク質の発現パターンを解析し、そのデータをHuman Protein Atlasで公開します。最終的に、組織マイクロアレイと免疫組織化学染色を通じて、組織および細胞におけるタンパク質発現を示す結果を得ることができます。単一の組織親ブロックから免疫組織化学染色を行うなどの既存の手法と比較して、この手法の主な利点は、貴重な生体試料を節約でき、実験の再現性が高まることです。また、この手法のもう一つの利点は、ENT費用だけでなく、研究室での処理時間も削減できることです。組織コアの標準的な長さを取得するためのこの手順については、私の研究室のラボテクニシャンであるIan call Bayが実演します。スタイレットに印を付けます。適切なパンチを装着させる際、パラフィンが割れるのを防ぐため、パラフィンブロックの両側に2.5〜3.0 mmの余白を設けることを推奨します。パンチを固定している六角穴付きボルトを緩め、パンチハブの溝がプラスチック製Vブロック内の金属ロッドにしっかりと密着するようにパンチを配置します。メタルクリップの端が水平であることを確認しながら、ネジを締めます。左側にレシピエントパンチを、右側にドナーパンチを挿入します。XY調整ノブとデジタルマイクロメーターの読み取り値を使用して、パンチをX軸およびY軸方向に移動させます。装置をリセットするには、zero a BSボタンを押してインチとミリメートルの切り替えを行い、inch millimeterボタンを押してください。9×8のテンプレートに1 mmのパンチを使用する場合、受容パンチを押し込みすぎてパンチを損傷させるのを防ぐため、穴の中心間で測定した穴の間隔は2 mmにする必要があります。パンチの押し込み最大深さを設定するには、ホルダーに空のカセットを挿入し、Zガイドの左上隅にある深さストップネジを使用して、受容パンチの下端の位置をカセットの底から1 mm上に設定します。組織切片上の該当領域を選択してマーキングし、組織マイクロアレイ作製用のテンプレートを設計した後、受容ブロックをホルダーに入れ、最小サイズのドライバーでネジを固定します。パラフィンがカセットから脱落するのを防ぐため、ネジを締めすぎないようにしてください。レシピエントパンチをレシピエントブロックに約5 mm押し込み、パンチのハンドルを使用してパンチを前後に回転させます。その後、押し込んでいた圧力をゆっくりと緩め、スプリングによってパンチが上昇するようにします。スタイルを用いてパンチ内を空にし、パラフィンコアを廃棄します。次に、タレットを移動してドナーパンチに切り替えます。その後、レシピエントブロックホルダーの上に、ドナーブロックを載せたドナーブロックブリッジを配置します。関心領域がマークされた対応するヘマトキシリン・エオジン染色スライドを用いて、サンプリングする組織の位置を確認します。左手でドナーブロックを固定し、右手でパンチを押し込みます。スタイレット部分は押さないでください。デプスストッパーはドナーブロックに対して適切な位置でパンチの動きを停止させないため、スタイレットの2番目のマークが見えた時点で押し込みを止めることが重要です。パンチのハンドルをゆっくりと1回回転させます。ドナーブロックをドナーブロックブリッジに保持したまま、下方への圧力を解除します。ブリッジとドナーブロックを取り除きます。ドナーパンチが、先に作成した穴と一致していることを確認してください。セットスクリューを使用してパンチの位置を調整します。ドナーパンチとレシピエントブロックの穴が一致していない場合は、パンチの先端がレシピエントブロックの穴の上端に達するまで、慎重にパンチを下方へ押し下げてください。この状態を保持しながら、スタイレットを使用して組織コアを穴の中に押し出します。コアの表面がブロックの表面と揃っている必要があります。その後、タレットをレシピエントパンチまで戻します。XY調整ノブを使用して次の位置に移動し、レシピエントブロックからサンプルをパンチし、アレイが完了するまでこの操作を繰り返します。レシピエントブロックを取り出すには、ホルダーのネジを緩めます。ブロックをガラススライドの上に裏向きに置き、適切なラックに配置して、42 °Cで40分間ベイクします。オーブンからスライドとブロックを取り出し、ガラススライドで軽く撫でるようにしてブロックの表面を平らにします。ガラススライドを載せたままブロックを冷却プレートの上に10分間置きます。ブロックからガラススライドを取り除きます。これでブロックが完成し、切片作成が可能な状態になりました。切片を作成した後、目的のタンパク質に対する抗体を用いて組織マイクロアレイの染色およびデジタル化を行います。www.proteinatlas.org のウェブサイトにアクセスし、ヒトプロテインアトラスで目的のタンパク質を検索してください。目的とするタンパク質のEnsembl ID、UniProtアクセッション番号、またはHGNC名（例：insulin）を入力してください。目的のタンパク質をクリックし、「normal tissue and organ summary（正常組織および器官の概要）」までスクロールします。概要には、膵臓におけるタンパク質の発現が表示されます。タブをクリックします。「More tissue data」を選択すると、臓器別にソートされた正常組織のビューが表示されます。膵臓をクリックして、同一のタンパク質に対する3種類の抗体を用いたIHCの結果を確認してください。画像をクリックすると、膵臓の高解像度画像が表示されます。この図では、組織マイクロアレイの品質例が示されており、行と列の間およびパラフィンの端に十分なスペースがあり、直線的に適切に配置されたアレイが示されています。一方、ここでは一部のコアが端に近すぎており、おそらく切片作成時に問題が生じると考えられます。この組織マイクロアレイは、乾燥時間が長すぎたため、適切なテンプレートなしに崩壊してしまいました。ここでは、列が直線的に揃っており適切に切断された切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色（H&amp;E染色）で染色しています。刃が不適切であったり汚れていたりすると、ここに示すような裂け目や、このような圧縮された切片が生じる可能性があります。リンパ節の胚中心細胞では、最適に調整された抗体を用いることで、ここに見られるようにバックグラウンドのない特異的な細胞質染色は得られます。一次抗体の濃度が低すぎる場合や、免疫染色した組織に標的タンパク質が存在しない場合は、陰性または弱陽性の染色となります。この組織切片は、一次抗体の濃度が高すぎたために過剰染色されています。色が濃いと、スピルオーバー、交差反応、および偽陽性が原因で、細胞内局在の判定が困難になります。このビデオを視聴することで、組織マーカーアレイの作製方法と、免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析におけるその使用方法について十分に理解できるはずです。また、ヒト組織および細胞におけるタンパク質発現について、Human Protein Atlasを検索する方法についても十分に理解できるはずです。

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

プロトコルは、バイオマーカー研究のための組織マイクロアレイの構築と品質を最適化することを目指しています。それは、計画と設計、デジタル病理学、バーチャルスライドアノテーション、自動化された組織アレイ化の態様を含む。...

バイオマーカー研究のための次世代組織マイクロアレイ（ngTMA）プロトコル

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。...

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

ZW10相互作用タンパク質(ZWINT)は、人工スピンドルチェックポイントおよび癌の病因に関与する。ここでは、ヒト肺癌組織におけるZWINTの免疫染色の方法論を紹介し、続いてスライド全体のデジタルスキャンと画像解析を行う。この方法論は、高品質のデジタル画像と信頼性の高い結果を提供することができます。...

ヒト肺組織におけるZW10相互作用タンパク質の免疫染色のデジタル解析

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。...

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

ここでは、腫瘍微小環境をより適切に特徴付け、特定の細胞集団を特定するために、空間オミクス技術の関心領域(ROI)を微調整するためのプロトコルについて説明します。プロテオミクスアッセイでは、カスタマイズされたプロトコルを自動化してROIを選択し、トランスクリプトミクスアッセイでは50 μmのROIを利用して微調整することができます。...

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

このプロトコルは、深さの異なるFFPEドナーブロックを使用して組織マイクロアレイを手動で構築する方法に関するテープ法を概説する。...

テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ

がん免疫療法の時代、腫瘍微小環境ダイナミクスの解明への関心が飛躍的に高まっています。このプロトコルは、その染色およびイメージングステップに関して質量分析イメージング技術を詳述し、高度に多重化された空間分析を可能にする。...

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。...

生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

学ぶ組織マイクロアレイの作成法と免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析。パラフィン包埋組織からコアを採取しブロック化し、ヒトタンパク質アトラスへのデータ統合も可能です。

ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

さらに動画を探す

ヒトタンパク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産