ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

本手順の全体的な目的は、Human Protein Atlasのようなハイスループットプロジェクトにおいて、複数の組織からタンパク質発現に関する情報を同時に効率的に取得する方法を用いることです。これは、まずホルマリン固定パラフィン包埋組織の代表的な領域を選択し、次にマークした領域をパンチで抜き取り、選択したコアを単一のパラフィンブロック、すなわち組織マイクロアレイに組み込むことで達成されます。

次に、TMAから切片を作成し、免疫組織化学染色を行います。最後に、タンパク質発現パターンを解析し、そのデータをHuman Protein Atlasで公開します。最終的に、組織マイクロアレイと免疫組織化学染色を通じて、組織および細胞におけるタンパク質発現を示す結果を得ることができます。

単一の組織実質ブロックを用いて免疫組織化学染色を行うなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、貴重な生物学的材料を節約でき、実験の再現性が高まることです。また、本手法のもう一つの利点は、ENTコストおよびラボでの処理時間を削減できることです。組織コアの標準的な長さを取得するための本手順については、当研究室のラボテクニシャンであるIan call Bayが実演します。

スタイレットに印を付けます。適切なパンチを装着してパラフィンに亀裂が入るのを防ぐため、パラフィンブロックの両側に2.5〜3.0 mmの余白を残すことを推奨します。パンチを固定している六角穴付きネジを緩め、パンチハブの溝がプラスチック製Vブロック内の金属棒にしっかりと密着するようにパンチを配置します。

金属クリップの端が水平になるように注意して、ネジを締めます。左側にレシピエントパンチを、右側にドナーパンチを挿入します。XY調整ノブとデジタルマイクロメータの読み取り値を使用して、パンチをX軸およびY軸に沿って移動させます。

装置をリセットするには、インチとミリメートルの切り替えを行うためにインチ・ミリメートルボタンを押し、ゼロ調整ボタンを押します。9×8のテンプレートに1 mmのパンチを使用する場合、受容パンチを押し込みすぎてパンチを損傷させるのを防ぐため、穴の中心間距離で測定した穴の間隔を2 mmにする必要があります。パンチの最大押し込み深さを設定するには、ホルダーに空のカセットを入れ、Zガイド左上にある深度ストップネジを使用して、受容パンチの下端位置をカセットの底から1 mm上に設定します。組織切片上の該当領域を選択してマーキングし、組織マイクロアレイ作製用のテンプレートを設計した後、受容ブロックをホルダーに入れ、最小サイズのドライバーでネジを固定します。

パラフィンがカセットから外れるのを防ぐため、ネジを締めすぎないようにしてください。受容側パンチを受容ブロックに約5 mm押し込み、パンチのハンドルを使用してパンチを前後に回転させます。その後、押し込んでいた圧力をゆっくりと緩め、バネによってパンチが上昇するようにします。

スタイルを用いてパンチ内を空にし、パラフィンコアを廃棄します。次に、ターレットを移動してドナーパンチに切り替えます。続いて、レシピエントブロックホルダーの上に、ドナーブロックを載せたドナーブロックブリッジを配置します。

関心領域がマークされた対応するヘマトキシリン・エオジン染色スライドを使用して、サンプリング対象の組織を特定します。左手でドナーブロックを固定し、右手でパンチを押し込みます。このとき、スタイレット（芯金）を直接押さないでください。デプスストップ（深さ制限）はドナーブロックに対して適切な位置でパンチの動作を停止させないため、スタイレットの2番目のマークが見えた時点で押し込みを停止させることが重要です。

パンチのハンドルをゆっくりと1回回転させます。ドナーブロックをドナーブロックブリッジに保持したまま、下方向への圧力を解除します。ブリッジとドナーブロックを取り出します。

ドナーパンチが先に作成した穴と一致していることを確認してください。セットスクリューを使用してパンチの位置を調整します。ドナーパンチとレシピエントブロックの穴の位置が合っていない場合は、パンチの先端がレシピエントブロックの穴の最上部に達するまで、慎重にパンチを押し下げてください。

この位置を保持したまま、スタイレットを使用して組織コアを孔の中に押し出します。コアの表面がブロックの表面と一致するようにしてください。その後、タレットを受信側のパンチまで戻します。

XY調整ノブで次の位置へ移動し、レシピエントブロックからサンプルをパンチする工程を、アレイが完了するまで繰り返します。レシピエントブロックを取り外すには、ホルダーのネジを緩めます。ブロックをガラススライドの上に裏返しに置き、適切なラックに設置して、42 °Cで40分間加熱します。

スライドとブロックをオーブンから取り出し、ガラススライドで軽く撫でるようにしてブロックの表面を平らにします。ガラススライドを載せたままのブロックを冷却プレートに10分間置きます。ブロックからガラススライドを取り除きます。

ブロックが完成し、切片作成が可能な状態になりました。切片を作成した後、目的のタンパク質に対する抗体を用いて組織マイクロアレイの染色とデジタル化を行います。www.proteinatlas.org のウェブサイトにアクセスし、ヒトプロテインアトラスで目的のタンパク質を検索してください。

目的とするタンパク質のEnsembl ID、UniProtアクセッション番号、またはHGNC名（例：insulin）を入力してください。目的のタンパク質をクリックし、normal tissue and organ summaryまでスクロールします。概要には、膵臓におけるタンパク質発現が表示されます。

タブをクリックしてください。「More tissue data」を選択すると、器官別にソートされた正常組織のビューが表示されます。

膵臓をクリックして、同一のタンパク質に対する3種類の抗体を用いたIHCの結果を確認してください。画像をクリックすると、膵臓の高解像度画像が表示されます。この図では、組織マイクロアレイの品質例を示しています。行と列の間、およびパラフィン端との間に十分なスペースがあり、直線的に適切に配置されたアレイが示されています。一方、一部のコアは端に近すぎ、切片作成時に問題が生じたと考えられます。

この組織マイクロアレイは乾燥時間が長すぎたため、適切なテンプレートなしに崩壊してしまいました。ここでは、列が直線的に整った適切に切断された切片を、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色しています。刃が不適切または汚れていると、ここで示されているような裂け目や、このような圧縮された切片が生じることがあります。

リンパ節の胚中心細胞では、適切にタイトレーションされた抗体により、ここに見られるようにバックグラウンドのない特異的な細胞質染色が得られます。一次抗体の濃度が低すぎる場合や、免疫染色した組織に標的タンパク質が存在しない場合は、陰性または弱陽性の染色となります。この組織切片は、一次抗体の濃度が高すぎたため、過剰染色されています。

色が濃いため、スピルオーバーや交叉反応、偽陽性が発生し、細胞内局在の判定が困難になります。このビデオを視聴することで、組織マーカーアレイの作製方法と、免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析での活用方法について深く理解できるはずです。また、Human Protein Atlasを用いて、ヒト組織および細胞におけるタンパク質発現を検索する方法についても十分に理解できるでしょう。