神経形態形成の研究のための方法：エキソビボ RNAiのエレクトロポレーション
2012年5月18日
大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明 ex vivoでエレクトロポレーション。このプロトコルは、神経新生、神経細胞の移動と樹状突起と軸索伸長を含むニューロンの形態として、神経発達のさまざまな側面の研究に適している。
次の実験の全体的な目標は、器官型スライスを使用して大脳皮質の発達における遺伝子機能の迅速な評価を行うことです。これは、プラスミド、COEX、発現および阻害性RNA、およびA GFPマーカーを大脳皮質に導入することによって達成されます。短い電気バーストが脳に印加され、プラスミドDNAがニューロン前駆細胞にトランスフェクションできるようになります。
次に、脳を解剖し、埋め込み、切片化して、ex vivoでニューロンの形態形成を経験できる器官型スライスを作製します。器官型スライスは、GFP標識細胞を直接観察することにより、遊走性または形態学的欠陥を有する皮質ニューロン亜集団を検索することができる。こんにちは、今日はブラウン大学の分子生物学部の私の研究室へようこそ、ライザ博士と2人の学生、Kat ZerとMark Sebaが、神経発達研究に非常に有用な技術であるex vivoエレクトロポレーション技術と器官型スライス培養を実演します。
この方法は、ニューロン新生、ニューロンの移動、ニューロンの形態形成など、神経発達のさまざまな側面における重要な質問に答えるのに役立ちます。この解析はIBU環境の近似値で行われるため、機能不明の遺伝子のトランスジェニック動物やノックアウト動物を作製するための低コストで迅速な代替手段を提供します。最後に、in vivo電気操作技術と比較して、これらの生体内電気操作実験の成功は、熟練した手術やスキル開発に依存せず、より短いトレーニング時間とスキルで実施できます。
妊娠中の雌マウスを安楽死させた後、胚を氷のように冷たく完全なHBSSに解剖し、個々の胎盤袋に入れます。次に、冷たいHBSS溶液で、袋から胚を解放し、注射のために最初の椎骨の後にその頭を切り取り、カスタムメイドのハミルトン注射器を使用してペトリ皿の上のパラフォーム紙の上に頭を置きます。6〜8マイクロリットルのDNAファストグリーンミックスを第3脳室に注入します。
そこから、混合物は皮質小胞の両側脳室を満たします。エレクトロポレーションには、BTXピンセットの白金電極が使用されます。正極をエレクトロポレーションされる皮質の側に向けて配置します。
たとえば、電極は背側皮質の頭の上にある必要があります。トランスフェクション効率を高めるには、DNAの濃度を常に1マイクロリットルあたり1マイクログラムに調整し、Maxi調製から単離されたDNAを使用してください。必要に応じて、エンドトキシンフリーキットを使用して、エレクトロポレーション後のDNAを精製します。
頭を氷の上で少なくとも5分間インキュベートしてから解剖します。エレクトロポレーションを行う際には、若い胚の脳に損傷を与えないように、適切な量の電気パルスと電流を使用することが非常に重要です。エレクトロポレーション後、組織は非常に壊れやすくなります。
皮膚や学校が皮質小胞の髄膜を引っ張る可能性があり、頭蓋骨から除去するときに皮質小胞を損傷する可能性があるため、解剖を非常に慎重に行うことが重要です。5分後、冷やして脳を解剖します。HBSSは、頭の側面に小さな切開を行い、頭の側面から皮膚を剥がすことから始めます。
次に、細い鉗子で、脳からピアをやさしく剥がします。頭蓋骨から無傷の脳を取り出します。終了したら、脳を氷冷HBSSに保ち、組織を埋め込む準備をします。
3%の低融点で金型の充填を開始します。アグロス。型を氷の上に置いて、アグロスが型の底近くで固まるようにします。まず、脳が支えられ、中心に留まるようにすることです。
細かい鉗子を使用して、HBSSから脳をそっと取り出し、キムワイプまたはフィルターペーパーで余分なバッファーを吸収し、脳を低融点に設定します。アグロス。次に、ピペットチップを使用して型内で脳を回転させ、アグロスと組織の間の接触を最大化します。すべての脳を移植したら、各脳を金型内でほぼ同じ向きと深さに配置します。
アロスは約5分で固まります。ですから、すぐに作業してください。アロスが完全に固まるまで、氷上でさらに5分間インキュベートします。
ブロックを取り付ける前に、余分なarosをトリミングします。次に、高速接着プラスチック接着剤を使用してアグロスブロックを互いに取り付け、スタック内の各脳を嗅球を上向きに配置する必要があります。ブロックが取り付けられたら、アロをトリミングして、各脳がビブラートでスライスされるようにします。
その後、すぐにそれらを氷冷HBSSに浸します。ブロックをスライスするには、ビブラートの速度を最大の約半分の低速に設定し、ブレードの振動周波数を最高に設定します。次に、厚さ250ミクロンのコロナルスライスを生成し、曲げた細いヘラを使用してスライスを取り出し、細いブラシまたは鉗子で組織ウェルに移します。
組織がアグロスから脱落した場合、組織培養フード内で組織アグロス接触が十分に形成されていなかった場合は、ウェルあたり1.8ミリリットルのスライス培養培地を含む6ウェルプレートを調製し、それぞれにラミニンポリティリジンの器官型インサートコードを配置します。500マイクロリットルのスライス培養培地を器官型スライスインサートの上部によく加えます。次に、最大5つのスライスを各インサートに移します。
次に、スライスの上部から余分なメディアを取り除きます スライスが可能な限りその形態を保持し、細胞死が最小限に抑えられるようにします。健全な液体空気界面が維持され、スライスが媒体に浮かばないことが重要です。最後に、加湿インキュベーターでスライスを摂氏37度でインキュベートします。
メンブレンの下のメディアの半分を隔日で交換します。スライスは、エレクトロポレーションされた構築物を発現するメディアニューロン上に浮かんではならず、エレクトロポレーション後8時間という早い時期に視覚化することができます。分析のためにスライスをメンブレンに固定します。
各オーガニックタイピックインサートを温かいPBSで5分間洗浄します。PBS洗浄を合計3回行い、4%パラホルムアルデヒドで4°Cで1時間固定します。固定後、組織を細胞マーカーで分析するか、単にフック染色で染色することができます 1時間後、1回のXPBSでスライスを10分間の洗浄を3回行います。
次に、1つのXPBS中の10%ヤギ血清溶液に室温で2時間、穏やかに振とうしながらスライスを透過させます。次に、ティッシュをフックで室温で1時間、穏やかに振って染色します。1回のXPBSで10分間の洗浄を3回行い、待っている間に穏やかに振って汚れを取り除きます。
すりガラスのスライドを、スライドに置いた後、組織を浸すのに十分な深さの水室に置きます。スライスをマウントします。まず、メスで膜を切って取り除きます。
次に、細い鉗子を使用して、最大5つの膜結合スライスを水に浸した各スライドに移します。第三に、各スライドから余分な水分を取り除きます。第四に、各脳のスライスに床置きの溶液を一滴垂らします。
そして最後に、スライスの上にカバースリップをそっと置き、気泡を取り除きます。その後、スライスは、エレクトロポレーションされたDNAの量と胚期に応じて顕微鏡検査の準備が整います。エレクトロポレーションでは、トランスフェクション効率にばらつきがあることがわかった。
Pサイレンサーによるトランスフェクションの8時間後、GFPベクター細胞はGFPを発現し始めました。より長い培養期間中、細胞は増殖、遊走、早期のニューロン分化など、正常な一連の神経原性イベントを経ます。これらのスライスは、この手順を試みている間、メディアエアインターフェースが十分に維持されていれば、5日間その形態を維持しました。
動物が安楽死した瞬間から、スライスが膜インサートに配置される瞬間まで、この手順後の細胞死を最小限に抑えるために、実験全体を2時間以内に実施することが重要です。器官型溶解への外因性因子の追加は、さまざまな神経発達メカニズムにおけるさまざまな成長因子または薬理学的因子の役割は何ですか?
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概要
この研究は、脳皮質の発達における遺伝子機能を評価するための方法を、エクスビボ電気穿孔法を通じて提示しています。阻害RNAとGFPを共発現するプラスミドを使用することで、研究者は神経発生や神経細胞の移動などの神経発達プロセスを調査することができます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経発達
- 遺伝学
背景
- 脳皮質は様々な脳機能にとって重要です。
- 遺伝子機能を理解することは、神経発達の洞察を得るために不可欠です。
- エクスビボ技術により、神経細胞の挙動の詳細な研究が可能になります。
- 電気穿孔は細胞にDNAを導入する方法です。
研究の目的
- 脳皮質の発達における遺伝子機能を迅速に評価すること。
- 神経発生、神経細胞の移動、形態形成を探索すること。
- 神経細胞の変化を観察するために、オルガノタイプスライスを利用すること。
使用された方法
- マウスの胚性皮質におけるプラスミドのエクスビボ電気穿孔。
- トランスフェクションを促進するための短時間の電気バーストの適用。
- オルガノタイプスライスを作成するための脳の解剖と埋め込み。
- GFP標識細胞の観察による神経細胞欠陥の同定。
主な結果
- 神経前駆細胞へのプラスミドの成功的なトランスフェクション。
- 欠陥を持つ皮質ニューロンの亜集団の同定。
- 神経発達におけるエクスビボ技術の有用性の実証。
- GFP標識による神経細胞の形態形成の視覚的確認。
結論
- この方法は遺伝子機能を研究するための迅速なアプローチを提供します。
- エクスビボ電気穿孔は神経発達研究に効果的です。
- 得られた洞察は皮質発達の理解に役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
