Name: 神経形態形成の研究のための方法：エキソビボ RNAiのエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶエクスビボ電気穿孔法によるRNAiを用いた大脳皮質発達における遺伝子機能評価。マウス胎児脳のオルガノタイプ切片で神経発生と移動を観察し、GFP標識で神経細胞の形態形成を解析する。

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我々はpSil-GFPコンストラクト、 図1の説明のために博士アルパーウズン、共焦点顕微鏡のためのルダックバイオイメージング機能を提供するための博士シリンBonniに感謝します。 EMMは、バロウズ·ウェルカム財団、NARSAD若手研究者賞、およびNIH NCRR COBRE P20 RR018728-01から医学のためのキャリア賞でサポートされています。 SBLは、NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01でサポートされており、PHS NRSA 5T32MH019118-20からの支援を受けています。

1。 （ないビデオで）培養液とメディアの準備<ol><li> 1X HBSS、2.5 mMのHepes緩衝液（pH7.4）、30mMのD-グルコース、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4をおよび4mM NaHCO 3を含む完全ハンクス平衡塩溶液（HBSS）の1リットルを準備します。蒸留水（DDH 2 O）を追加します。 4で0.2μmフィルターや店舗℃で滅菌するフィルタリング</li><li>基礎培地イーグル培地の35mLの、完全なHBSSの12.9 mLを、20mMのD-グルコース（1 M溶液1.35 mL）を、1mMのグルタミン（200 mM溶液0.25 mL）を、ペニシリンの0.5ミリリットルを使用して、スライス培養培地を準備します。 - ストレプトマイシン100×ストック。 0.2μmのフィルターで滅菌ろ過し、次いで、5％の最終濃度に血清熱不活馬を追加します。 </li><li>滅菌蒸留脱イオン水で1 mg / mLとラミニンのストック溶液を作ることによってラミニンワーキング溶液を調製します。 -80℃で0.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに100μLのアリコートを準備し、凍結℃の</li><li>ので、作業ポリ-L-リジンの準備1 mg / mLのストック溶液を作るためにポリ-L-リジンの5mgに滅菌H 2 O 5mLを追加することにより、lution。 -20℃で1 mLを分注し、凍結を準備します。 </li><li>滅菌水で12 mLの最終的なボリュームにポリ-L-リジンの1 mLおよびラミニンの100μLに希釈してコーティング溶液を調製します。毎回新鮮なこのソリューションを作成します。 </li></ol> 2。器官スライスを挿入します（ないビデオ）の準備<ol><li>よく滅菌ピンセットを使って1つのカルチャーインサートを持つ2つの6ウェルプレートを準備します。カルチャーインサート下に無菌のddH 2 O 2 mLを追加します。 </li><li>穿刺に膜を気にしないながら膜の上にコーティング溶液の1 mLを加える。 37℃および5％CO 2の加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。 </li><li>コーティングメディアを取り出し、滅菌H 2 0 3回膜を洗浄する。使用前に乾燥を挿入してみましょう。 37スライス培養培地と場所の1.8 mLを°Cインキュベーターを追加します。パラフィルムで使用されていないプレートをラップと4週間まで4℃で保存。 </li></ol> 3。 （ないビデオ）エレクトロポレーションの準備<ol><li>エレクトロポレーションのためにRNAiコンストラクトを準備します。二重鎖RNAヘアピンインサートはpSilencerベクターにクローニングした。プラスミド含まれています：1）二本鎖RNAの生成を駆動するU6プロモーターおよび2）GFP発現カセットは、CMVプロモーター8,9によって駆動される。このプラスミドは、以前小西ら9と他の7,8で説明されている。プラスミドはキアゲンマキシプレップキットを用いて精製し、1 mg / mLの濃度で使用されています。 </li><li>それを注入しながらDNAを可視化するために、0.5％ファストグリーン染料溶液を調製し、（通常は速いグリーンの1μLのDNAの20μL）を注入するDNAで1:20でそれを使用しています。 DNA-ファストグリーン染料の混合物を介して左週間までは-20℃で保存することができます。 </li><li>きれいな解剖領域dissectingのツールと​​70％エタノールでビブラトーム容器。それは氷冷になるように、完全なHBSSを冷やす。急速な冷却のためのいくつかの水でビブラトーム内側にその周りに氷を詰めることによってビブラトーム容器を冷やす。完全なHBSSを用いて3％低融点アガロースを準備します。 1分間電子レンジ。沸騰する上で避ける。使用するまで42℃水浴中で保管してください。 </li><li>エレクトロポレーションパラメータは次のように設定されています。 E15胚を使用する35 V、5パルス、100 msの長さ、パルス間の900ミリ秒間隔の。古い動物については、エレクトロポレーションを確保するため、50 Vに高い電圧を使用するか、または最大8パルスにパルス数を増やします。若い動物では組織の損傷を防ぐために、25のいずれかに少ないパルスまたは最大2つのパルスと低い電圧を使用V.これらのパラメータは変化し、動物の年齢に応じて経験的に決定することができる。 </li></ol> 4。解離およびエレクトロポレーション（ビデオで） <ol><li>妊娠中の女性の安楽死した後、氷冷HBSSを完全に胚を解剖する。 KE個々の胎盤気嚢内の各胚をEP。 </li><li>胚を解剖し、最初の椎骨の後に頭を切り落とした。氷冷HBSSを完全にしてください。 </li><li>注射のために、ペトリ皿の上にパラフィルムの一部に頭を置きます。皮質の小胞の両方の側脳室を埋めるために第三脳室を介して高速の緑染料·ミックス（ 表Iを参照）ハミルトンシリンジたカスタムを使用すると、DNAの約6〜8μLを注入します。また、注射は、それぞれの側脳室に直接行うことができます。 </li><li> ex vivoでのエレクトロポレーションでは、BTX-ピンセット白金電極を使用しています。あなたは背側皮質のヘッドすなわち上部をエレクトロポたい大脳皮質の側に向かって正極を配置します。 </li><li>エレクトロポレーションした後、解剖前に、少なくとも5分間氷上に頭をインキュベートします。 </li><li>氷冷HBSSby頭部の側面に小さな切開を作り、頭の両側から皮膚を剥離の脳を解剖する。と、次のそっと皮離れて細かい鉗子脳からPIA。皮質に損傷を与えないように注意しながら、頭蓋骨から無傷の脳を削除します。 </li></ol> 5。 （ビデオで）を埋め込むとエレクトロポ野のセクショニング<ol><li>氷上に置いた大規模な金型に3％低融点アガロースを転送します。モールドの底部はモールドの底に沈んでダウンから脳を防ぐことができますどの速く固化し始めることになります。穏やかに、微細な鉗子キムワイプまたは濾紙で余分なバッファーを除去した後、一つずつで脳を転送します。アガロースと脳組織間の最大インタフェースを確保するために金型内の渦の脳を、10μLピペットチップを使用しています。 </li><li>すべての頭脳を確保するために東洋の脳は同じ向きに、アガロースでほぼ同じレベルである。アガロースは、約5分間固化しましょう​​。嗅球が立っされるようにアガロースブ​​ロックを接続する接着剤（クレイジー接着剤）を使用します。ブロックが接続されたら、すぐに私を追加CE冷HBSSと個々のスライスは、各脳に対して得られていることを確認するアガロースをトリミングします。 </li><li>ブロックをスライスするには、低速（約半分の最大値）にビブラトームの速度を設定し、最高設定でブレードの振動周​​波数を設定します。 250μmの厚さの冠状スライスを生成します。曲がった細かいへらを使用してスライスを取得し、微細なブラシや鉗子で組織のウェルに移す。 </li><li>組織培養フードには、コーティングされたインサートにスライスを転送します。転送を容易にするために、各インサートにスライス培養培地の500μLを追加します。最大5つのスライスには、挿入ごとに配置することができます。スライスの上から余分なメディアを削除し、37℃で加湿インキュベーター中でインキュベートする。 </li></ol> 6。文化や器官スライスの解析（ビデオで） <ol><li>健全なスライスを維持するために、新鮮なメディアは、メディアごとに時間の半分を置き換えることにより、膜の下に少なくとも一日おきに追加する必要があります。 </li><li> Dの後にスライスを分析するために、文化のesired日、膜のスライスを修正します。 10分間°Cを3回、毎回37℃で1×リン酸食塩緩衝液（PBS）で洗浄する。次に、4℃または室温で1時間、一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。 </li><li>スライスは、異なる細胞のマーカーで分析またはエレクトロポレーションと非エレクトロポレーションした細胞を可視化するだけではヘキストで染色することができます。透過性、10％ヤギ血清、穏やかに振盪しながら1×PBS中0.1％のトリトン、室温で2時間のスライスをブロックします。 </li><li>室温で1時間ヘキストで染色し、それぞれの時間が穏やかに振盪しながら1×PBSで10分間で3回洗浄します。 </li><li>マウントするにはスライスがメスで膜を切り取り、水チャンバ内の曇りガラスのスライドにスライスを含む膜を転送するために微細な鉗子を使用しています。最大5つのスライスは、スライドガラスごとに配置することができます。余分な水分を除去し、各脳切片へFlourmount溶液の液滴を追加します。穏やかに脳スライスの上にカバースリップを配置し、削除するyの気泡。共焦点顕微鏡を使用してスライスを分析します。 </li></ol> 7。器官スライスの代わりにパラフィン包埋（いないビデオ） <ol><li>器官のスライスはまた、上述したようにこの目的のために器官のスライスを含む膜を4％PFAで固定することができ、より細かい形態素解析のためにパラフィンのために埋め込むことができます。 </li><li>固定のスライスは、1％アガロース（37℃にあらかじめ温め）に埋め込まれ、30分間氷中で固化されています。アガロースブ​​ロックは、その後30分間、4℃で4％PFAで後固定することができます。 </li><li>器官スライスを含有するアガロースブロックはその後パラフィンに埋め込 ​​まれており、前述の10のように免疫のために処理されます。 </li></ol> 8。代表的な結果器官のスライスのマウス皮質と文化のエレクトロポレーションの概略を図1に示されています。このメソッドは、RAPIのために有用な戦略である神経発達11に関与する遺伝子の機能のD評価。 DNAエレクトロポレーションの量とエレクトロポレーションでは胚の段階に応じて、トランスフェクション効率は異なる場合があります。スライスは、少なくとも8時間後にエレクトロポレーションと細胞は培養中の神経のイベント（増殖、遊走、初期の神経分化）の正常シーケンスを受けることになるGFPを発現するが開始されます。 図2は、pSilencer-GFPコントロールを発現しているエレクトロポレーションの脳スライスを示しています。ベクトルと1つの神経前駆細胞、移行するニューロンとスライスに分化したニューロンを観察することができます。彼らは膜上の優れたメディアのエア·インタフェースで維持され、培養中に少なくとも5日まで使用することができるように器官のスライスがあれば、その形態を維持します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> 図1。 ex vivoでのエレクトロポレーションおよび器官スライスのイラスト培養アッセイ。E14.5胚を切り出し、個別に注射部位を可視化するために、速いグリーン染料を混合したDNAを注入されています。図や第三脳室に示すようにDNAは、側脳室を埋めるために、両方の側脳室に注入することができます。注入後、脳は、脳の所望の側に正極を配置し、方形波のエレクトロとエレクトロポレーションされています。脳は3％低融点アガロースとビブラトームを用いて切片に埋め込まれています。 250μmの脳スライスは、0.4μmのインサート上に配置され、週にまで培養されています。 GFPは、8時間後にトランスフェクション後に観察することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> 図2。エレクトロ脳スライスの分析。エレクトロポ脳スライスはHoescht染色した。背側皮質脳室帯（VZ）でエレクトロポレーション神経前駆細胞を示しています。コルティ内のニューロンCALプレート（CP）は辺縁帯（MZ）で区切られています。白い矢印は移行ニューロンを示しています。このケースでは、脳はE15.5で注入したとpSilencer GFPコントロールベクターでエレクトロポレーション。のセクションでは、4日、エレクトロポレーション後、皮質外植片を表しています。スケールバーは100μm。 トラブルシューティング： <ol><li> トランスフェクション効率が低い：少なくとも1μg/μLのに使用されるDNAの濃度を調整します。必要なDNAを精製するためにエンド - フリーQuiagen社のキットを使用する場合は、常に最大の準備から、非常にクリーンなDNAを使用しています。 </li><li> 細胞が所望のものとは異なる脳領域でトランスフェ：電極をエレクトロポレーションする脳の側に向かって正極の位置に正しく配置されていることを確認します。 </li><li>毎日の変更、メディアやスライスがメディアに浮動小数点ではありませんを確認してください。器官のスライスは、形態を失う </li><li> 彼らはviでカットされているようにスライスがアガロースから来るbratome：低融点アガロースで脳を埋め込 ​​むときに良好な界面が行われていることを確認します。 </li></ol>

<ol><li>Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li>
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<li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li>
<li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders%3A+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

器官のスライスの二本鎖RNAヘアピン8と文化をコードするプラスミド4のex vivoでのエレクトロポレーションを含むこれらのメソッドは、いくつかの明確な利点を提供しています。最初に、これらのメソッドは、RNAiから派生した表現型の迅速な評価を可能にします。二本鎖RNAのヘアピンを駆動するU6プロモーターを含む同じpSilencerベクター中の発現カセットのエンコーディングGFPを含めることは、RNAiベクターをエレクトロポレーションした細胞の迅速な同定と特性評価が可能になります。時間効率に加えて、これらのメソッドは、いくつかのノックアウトラインの世代に比べて費用対効果の高いです。第二に、より長いトレーニングや能力開発は、動物とエレクトロポレーションの成功の生存を確保する必要が生存エレクトロポレーション技術を12と比較して、メソッドはここで説明する短いトレーニング時間とスキルで行うことができます。 生体内生存s のurgeriesは、動物（母とPUP）の罹患率に関連付けることができるベースラインの故障率で陥っています。こ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31ゲージ、長さ0.5インチ、PT-4（ポイントベベルのレベル）、10μlの体積</td></tr><tr><td>プラチナtweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45から0489 </td><td> 5ミリメートルサイズ</td></tr><tr><td> ECM830エレクトロ</td><td> BTX </td><td> 45から0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTXフットスイッチ</td><td> BTX </td><td> 45から0208 </td><td> ECM830エレクトロで使用するために</td></tr><tr><td>振動刃ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - インサートで使用するだけでなく料理</td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td>インサートに適合するようにノッチが含まれています</td></tr><tr><td>組織培養インサート</td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0.4マイクロメートル</TD&gt; </tr><tr><td>速いグリーン</td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNAグレード</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td>基礎培地イーグル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> CaとMgせずに10倍のHBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-遊離酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; rnaiのエレクトロポレーション

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

大脳皮質は、より高い認知機能を指示します。この6層構造は、最後に生まれたニューロンは脳1の表面に向かって最初の生まれのニューロンを越えて移行する際、最初の生まれたニューロンは脳室に近いままでいる内に、最初に、外から最後の方法で生成されます。ニューロン移動2に加えて、正常な皮質機能のキープロセスでは、ニューロンの形態3の規制です。神経細胞の形態形成は初代培養の in vitro で検討することができますが、これらのプロセスは、組織の環境では規制されている方法から学ぶべき多くがあります。 我々は大脳皮質4,6の器官スライスの神経細胞移動および/ ​​または形態を分析する手法について説明します。 pSilencer変更されたベクトルは、二本鎖ヘアピンRNAを駆動するU6プロモーターとbを駆動するGFP蛋白質をコードする別の発現カセットの両方が含まれている使用されている屋CMVプロモーター7-9我々のアプローチは、候補遺伝子の特定のノックダウンによって神経突起伸長の欠陥を迅速に評価することができ、正常に神経突起伸長の8レギュレータの画面で使用されています。細胞のサブセットのみがRNAiコンストラクトを表現されるため、器官のスライスは、潜在的な表現型のモザイク解析を可能にします。この分析は、 生体内環境に近い近似値で行われるため、また、それは未知の皮質機能の遺伝子のための低コストおよびトランスジェニックやノックアウト動物の世代への迅速な代替手段を提供します。最後に、in vivoでのエレクトロポレーション技術と比較して、ex vivoでのエレクトロポレーション実験の成功は、熟練した外科手術のスキル開発に依存しないで、短いトレーニング時間とスキルで行うことができます。

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明<em&gt; ex vivoで</emプラスミドをマウス胚性皮質に阻害RNA（RNAi）をとGFPを共発現の&gt;エレクトロポレーション。このプロトコルは、神経新生、神経細胞の移動と樹状突起と軸索伸長を含むニューロンの形態として、神経発達のさまざまな側面の研究に適している。

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

大脳皮質は高次認知機能を制御しています。この6層構造は、内側から外側へと順に形成される方式で生成され、そこでは…

本実験の全体的な目的は、オルガノタイプ切片を用いて、大脳皮質の発達における遺伝子機能を迅速に評価することです。これは、抑制性RNAおよびGFPマーカーを発現するプラスミドをマウスの大脳皮質に導入することで達成されます。脳に短時間の電気パルスを印加することで、プラスミドDNAを神経前駆細胞にトランスフェクションさせます。次に、脳を解剖、包埋し、切片を作成して、ex vivoで神経形態形成が起こり得る組織型スライスを作製します。GFPで標識された細胞を直接観察することで、移動能や形態に欠陥のある皮質ニューロンのサブポピュレーションを組織型スライスから探索できます。こんにちは。本日はブラウン大学分子生物学部の私の研究室にようこそ。Liza博士と2人の学生、Kat ZerとMark Sebaが、神経発達研究において非常に有用な手法であるex vivoエレクトロポレーション法と組織型スライス培養について実演します。本手法は、神経発生、ニューロンの移動、およびニューロンの形態形成を含む、神経発達の様々な側面における重要な疑問を解消するのに役立ちます。この解析はIBU環境に近似した状態で行われるため、機能未知の遺伝子に対するトランスジェニック動物やノックアウト動物の作製に代わる、低コストで迅速な選択肢となります。最後に、in vivo 電穿孔法（エレクトロポレーション）技術と比較して、これらの vivo 電穿孔実験の成功は、熟練した手術手技やスキル習得に依存せず、より短いトレーニング期間と習熟度で実施することが可能です。妊娠した雌マウスを安楽死させた後、胚を氷冷した完全HBSS内に摘出し、個々の胎盤嚢に保持したままにします。次に、冷たいHBSS溶液中で、胚を嚢から取り出し、注射を行うために第一頸椎の後方で頭部を切断します。特注のハミルトンシリンジを用いて、ペトリ皿の上に敷いたパラフォーム紙の上に頭部を配置します。第三脳室を通じて、6〜8 µLのDNA fast greenミックスを注入します。そこから、混合液は皮質胞の両側脳室を満たします。電極法（エレクトロポレーション）には、BTX製ピンセット白金電極を使用します。陽極を、電極法を適用する皮質の側に配置してください。例えば、背側皮質を対象とする場合は、電極を頭頂部に配置してください。高い導入効率を得るために、DNA濃度は常に1 µg/µLに調整し、Maxi prepで精製したDNAを使用してください。必要に応じて、エレクトロポレーション後にエンドトキシンフリーキットを用いてDNAを精製してください。解剖する前に、頭部を氷上で5分以上静置します。低年齢の胚の脳への損傷を防ぐため、エレクトロポレーション時に適切なパルス数と電流を用いることが非常に重要です。エレクトロポレーション後、組織は非常に脆弱になります。皮膚や頭蓋骨が皮質小胞の髄膜を牽引し、頭蓋骨から取り出す際に皮質小胞を損傷させる可能性があるため、解剖は細心の注意を払って行うことが重要です。5分後、冷えた HBSS 内で脳を摘出します。まず、頭部の側面に小さな切開を入れ、頭部の側面から皮膚を剥がすことから始めてください。次に、微細ピンセットを用いて、脳から軟膜を慎重に剥離します。頭蓋骨から損傷のない脳を取り出します。完了後、脳を氷冷したHBSSに保持し、組織の包埋準備を行います。3%低融点アガロースを型に充填し始めます。アガロースを型の底部付近で凝固させるため、型を氷上に置きます。まず、脳が支持され、中心に位置していることを確認してください。次に、微細ピンセットを用いて、HBSSから脳を慎重に取り出し、キムワイプまたはろ紙で余分な緩衝液を吸い取ってから、低融点アガロースの中に入れます。その後、ピペットチップを使用して、アガロースと組織の接触を最大にするように、モールド内で脳をかき混ぜます。すべての脳を移し終えたら、各脳をモールド内でほぼ同じ方向および深さに配置します。アガロースは約5分で凝固します。そのため、迅速に作業を行ってください。さらに5分間氷上で静置し、アガロースを完全に凝固させます。ブロックを固定する前に、余分なアガロースをトリミングします。次に、速乾性のプラスチック接着剤を使用してアガロースブロックを互いに接着させます。このとき、スタック内の各脳の嗅球が上を向くように配置してください。ブロックの接着後、各脳がバイブレーション切片作成装置でスライスされるように、アガロースをトリミングします。その後、直ちに氷冷したHBSSに浸します。ブロックをスライスする場合、Vibratomeの速度を最大速度の約半分という低速に設定し、ブレードの振動周波数を最高設定にします。次に、厚さ250 micronの冠状切片を作成し、曲がった極細スパチュラを用いて切片を回収し、細筆またはピンセットで組織用ウェルに転送します。組織がアグロスから脱落し、組織培養フード内で組織とアグロスの接触が十分に形成されなかった場合は、6ウェルプレートを用意し、1ウェルあたり1.8 mLのスライス培養培地を分注し、各ウェルにラミニンおよびポリリジンでコーティングしたオルガノタイプ・インサートを配置します。オルガノタイプ・スライスインサートの上部に500 µLのスライス培養培地を加えます。その後、各インサートに最大5枚までのスライスを移します。次に、切片が可能な限り形態を維持し、細胞死を最小限に抑えるために、切片上部の余分な培地を除去します。健全な気液界面を維持し、切片が培地に浮かないようにすることが重要です。最後に、切片を 37 °C の加湿インキュベーターでインキュベートします。隔日で、メンブレン下の培地容量の半分を交換します。スライスが培地の上に浮いていないようにしてください。エレクトロポレーションされた構築物を発現しているニューロンは、エレクトロポレーション後早ければ8時間で可視化されます。所定の日数培養した後、解析のためにスライスをメンブレンに固定してください。各有機型インサートを温めたPBSで5分間洗浄します。合計3回のPBS洗浄を行い、その後、4%パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで1時間、組織を固定します。固定後、組織を細胞マーカーで解析するか、あるいは単純に hooks stain で染色します。1時間後、スライスを1×PBSで10分間の洗浄を3回行います。その後、1×PBSに調製した10%山羊血清溶液中で、室温で2時間、緩やかに振盪しながら切片をブロッキングします。次に、抗体を用いて室温で1時間、緩やかに振盪しながら組織を染色します。待機している間に、1×PBSを用いて10分間の洗浄を3回、緩やかに振盪しながら行い、染色液を除去します。すりガラススライドを、組織をスライド上に載せた後に浸すのに十分な深さがある水槽に入れます。切片を固定するには、まずメスを用いて膜を切り離します。次に、微細ピンセットを用いて、水に浸した各スライドに膜結合切片を最大5枚まで転送します。3番目に、各スライドから余分な水分を取り除きます。4番目に、各脳切片に封入剤を1滴滴下します。最後に、スライスの上にカバーガラスをそっと載せ、気泡を取り除きます。これで、エレクトロポレーションされたDNA量と胚のステージに応じて、顕微鏡観察が可能な状態になります。エレクトロポレーションにおいて、導入効率は変動することが確認されました。PサイレンサーとGFPベクターでトランスフェクションしてから8時間後に、細胞がGFPを発現し始めました。より長期間の培養期間において、細胞は増殖、遊走、および初期神経分化を含む正常な神経発生イベントの配列を経ていきます。この手順を行う際、培地の気液界面が適切に維持されていれば、これらのスライスは5日間形態を維持しました。この手順後の細胞死を最小限に抑えるため、動物を安楽死させた瞬間からスライスをメンブレンインサートに設置するまで、実験全体を2時間以内に完了させることが重要です。また、器官培養スライスに外因性因子を添加することで、さまざまな神経発達メカニズムにおける異なる成長因子や薬理学的剤の役割は何か、といった疑問に対する検証を行うことができます。

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JoVE Journal

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神経科学

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神経形態形成の研究のための方法：

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