神経形態形成の研究のための方法：

本実験の全体的な目的は、オルガノタイプ切片を用いて、大脳皮質の発達における遺伝子機能を迅速に評価することです。これは、抑制性RNAおよびGFPマーカーを発現するプラスミドをマウスの大脳皮質に導入することで達成されます。脳に短時間の電気パルスを印加することで、プラスミドDNAを神経前駆細胞にトランスフェクションさせます。

次に、脳を解剖、包埋し、切片を作成して、ex vivoで神経形態形成が起こり得る組織型スライスを作製します。GFPで標識された細胞を直接観察することで、移動能や形態に欠陥のある皮質ニューロンのサブポピュレーションを組織型スライスから探索できます。こんにちは。本日はブラウン大学分子生物学部の私の研究室にようこそ。Liza博士と2人の学生、Kat ZerとMark Sebaが、神経発達研究において非常に有用な手法であるex vivoエレクトロポレーション法と組織型スライス培養について実演します。

本手法は、神経発生、ニューロンの移動、およびニューロンの形態形成を含む、神経発達の様々な側面における重要な疑問を解消するのに役立ちます。この解析はIBU環境に近似した状態で行われるため、機能未知の遺伝子に対するトランスジェニック動物やノックアウト動物の作製に代わる、低コストで迅速な選択肢となります。最後に、in vivo 電穿孔法（エレクトロポレーション）技術と比較して、これらの vivo 電穿孔実験の成功は、熟練した手術手技やスキル習得に依存せず、より短いトレーニング期間と習熟度で実施することが可能です。

妊娠した雌マウスを安楽死させた後、胚を氷冷した完全HBSS内に摘出し、個々の胎盤嚢に保持したままにします。次に、冷たいHBSS溶液中で、胚を嚢から取り出し、注射を行うために第一頸椎の後方で頭部を切断します。特注のハミルトンシリンジを用いて、ペトリ皿の上に敷いたパラフォーム紙の上に頭部を配置します。第三脳室を通じて、6〜8 µLのDNA fast greenミックスを注入します。

そこから、混合液は皮質胞の両側脳室を満たします。電極法（エレクトロポレーション）には、BTX製ピンセット白金電極を使用します。陽極を、電極法を適用する皮質の側に配置してください。

例えば、背側皮質を対象とする場合は、電極を頭頂部に配置してください。高い導入効率を得るために、DNA濃度は常に1 µg/µLに調整し、Maxi prepで精製したDNAを使用してください。必要に応じて、エレクトロポレーション後にエンドトキシンフリーキットを用いてDNAを精製してください。

解剖する前に、頭部を氷上で5分以上静置します。低年齢の胚の脳への損傷を防ぐため、エレクトロポレーション時に適切なパルス数と電流を用いることが非常に重要です。エレクトロポレーション後、組織は非常に脆弱になります。

皮膚や頭蓋骨が皮質小胞の髄膜を牽引し、頭蓋骨から取り出す際に皮質小胞を損傷させる可能性があるため、解剖は細心の注意を払って行うことが重要です。5分後、冷えた HBSS 内で脳を摘出します。まず、頭部の側面に小さな切開を入れ、頭部の側面から皮膚を剥がすことから始めてください。

次に、微細ピンセットを用いて、脳から軟膜を慎重に剥離します。頭蓋骨から損傷のない脳を取り出します。完了後、脳を氷冷したHBSSに保持し、組織の包埋準備を行います。

3%低融点アガロースを型に充填し始めます。アガロースを型の底部付近で凝固させるため、型を氷上に置きます。まず、脳が支持され、中心に位置していることを確認してください。

次に、微細ピンセットを用いて、HBSSから脳を慎重に取り出し、キムワイプまたはろ紙で余分な緩衝液を吸い取ってから、低融点アガロースの中に入れます。その後、ピペットチップを使用して、アガロースと組織の接触を最大にするように、モールド内で脳をかき混ぜます。すべての脳を移し終えたら、各脳をモールド内でほぼ同じ方向および深さに配置します。

アガロースは約5分で凝固します。そのため、迅速に作業を行ってください。さらに5分間氷上で静置し、アガロースを完全に凝固させます。

ブロックを固定する前に、余分なアガロースをトリミングします。次に、速乾性のプラスチック接着剤を使用してアガロースブロックを互いに接着させます。このとき、スタック内の各脳の嗅球が上を向くように配置してください。ブロックの接着後、各脳がバイブレーション切片作成装置でスライスされるように、アガロースをトリミングします。

その後、直ちに氷冷したHBSSに浸します。ブロックをスライスする場合、Vibratomeの速度を最大速度の約半分という低速に設定し、ブレードの振動周波数を最高設定にします。次に、厚さ250 micronの冠状切片を作成し、曲がった極細スパチュラを用いて切片を回収し、細筆またはピンセットで組織用ウェルに転送します。

組織がアグロスから脱落し、組織培養フード内で組織とアグロスの接触が十分に形成されなかった場合は、6ウェルプレートを用意し、1ウェルあたり1.8 mLのスライス培養培地を分注し、各ウェルにラミニンおよびポリリジンでコーティングしたオルガノタイプ・インサートを配置します。オルガノタイプ・スライスインサートの上部に500 µLのスライス培養培地を加えます。その後、各インサートに最大5枚までのスライスを移します。

次に、切片が可能な限り形態を維持し、細胞死を最小限に抑えるために、切片上部の余分な培地を除去します。健全な気液界面を維持し、切片が培地に浮かないようにすることが重要です。最後に、切片を 37 °C の加湿インキュベーターでインキュベートします。

隔日で、メンブレン下の培地容量の半分を交換します。スライスが培地の上に浮いていないようにしてください。エレクトロポレーションされた構築物を発現しているニューロンは、エレクトロポレーション後早ければ8時間で可視化されます。所定の日数培養した後、解析のためにスライスをメンブレンに固定してください。

各有機型インサートを温めたPBSで5分間洗浄します。合計3回のPBS洗浄を行い、その後、4%パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで1時間、組織を固定します。固定後、組織を細胞マーカーで解析するか、あるいは単純に hooks stain で染色します。1時間後、スライスを1×PBSで10分間の洗浄を3回行います。

その後、1×PBSに調製した10%山羊血清溶液中で、室温で2時間、緩やかに振盪しながら切片をブロッキングします。次に、抗体を用いて室温で1時間、緩やかに振盪しながら組織を染色します。待機している間に、1×PBSを用いて10分間の洗浄を3回、緩やかに振盪しながら行い、染色液を除去します。

すりガラススライドを、組織をスライド上に載せた後に浸すのに十分な深さがある水槽に入れます。切片を固定するには、まずメスを用いて膜を切り離します。

次に、微細ピンセットを用いて、水に浸した各スライドに膜結合切片を最大5枚まで転送します。3番目に、各スライドから余分な水分を取り除きます。4番目に、各脳切片に封入剤を1滴滴下します。

最後に、スライスの上にカバーガラスをそっと載せ、気泡を取り除きます。これで、エレクトロポレーションされたDNA量と胚のステージに応じて、顕微鏡観察が可能な状態になります。エレクトロポレーションにおいて、導入効率は変動することが確認されました。

PサイレンサーとGFPベクターでトランスフェクションしてから8時間後に、細胞がGFPを発現し始めました。より長期間の培養期間において、細胞は増殖、遊走、および初期神経分化を含む正常な神経発生イベントの配列を経ていきます。この手順を行う際、培地の気液界面が適切に維持されていれば、これらのスライスは5日間形態を維持しました。

この手順後の細胞死を最小限に抑えるため、動物を安楽死させた瞬間からスライスをメンブレンインサートに設置するまで、実験全体を2時間以内に完了させることが重要です。また、器官培養スライスに外因性因子を添加することで、さまざまな神経発達メカニズムにおける異なる成長因子や薬理学的剤の役割は何か、といった疑問に対する検証を行うことができます。