同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ

この手順の全体的な目的は、摂食行動の観察と同時に、カルシウムイメージングによって神経活動をモニタリングすることです。これは、まずショウジョウバエをフライ装置に挿入し、次に、脳を露出させるためにショウジョウバエの頭部を解剖することで達成されます。

次に、解剖したハエを固定した装置を顕微鏡ステージ上に配置します。手順の最終ステップは、糖液浸した芯（sugar wick）を用いて口器（proboscis）を刺激することです。最終的に、行動のビデオ撮影による口器の伸展と、カルシウムイメージングによる特定ニューロンの活性化を相関させることで、結果を得ることができます。

この手法のアイデアを最初に得たのは、水面に浮かんで泳ぐビールの目について考えた時でした。私たちビールは分かれた目を持っており、水面の上と下の両方を見ることができます。私の実験における難しい点は、脳とSCUが互いに近接していることですが、私たちビールの目のようにうまく分離されていれば、脳をサテライトに露出させたまま、SCUを乾燥した状態に保つことができます。

SCUのすぐ上に非常にシンプルな仕切りを作成し、乾燥面と幅のある場所を分離させました。35 mmファルコンディッシュの蓋の側壁を溶かし、適切な角度と厚さになるよう削り出してプラットフォームを形成します。プラットフォームに穴を開けてハエの頭を固定し、口器がチャンバーの外側に自由に露出するようにします。ピペットマンのチップの先端を、ハエの体がちょうど入る幅にカットし、そのチップをプラットフォームに接着します。

成虫のショウジョウバエを25°Cで24時間飢餓状態にします。ピンセットを用いて、氷上に置いた15 mLプラスチックチューブの中にハエを入れ、麻酔をかけます。ハエをチャンバー内に挿入し、動かせなくなるまでゆっくりと押し込みます。

光硬化性接着剤を少量、吻（rostrum）の側面および上部に塗布し、まつげ用ツールなどの器具を用いて慎重に広げることで、近位吻または吻の周囲を穴の内縁に密閉します。また、ハエの内部から、頭部背面と穴の内縁との隙間にも接着剤を塗布します。最後に、ハエへのダメージを避けるため、硬化に十分な最小限の強度の青色光を照射して接着剤を硬化させます。

ハエの頭部を固定し、SOGの腹側を露出させるため、吻を部分的に持ち上げた状態で保持するように糸を固定します。ハエを配置した後、プラットフォームの表面をスクロースフリー生理食塩水で満たします。タングステンブレードと、先端を鋭利にしたピンセット（以下、鋭利化ピンセットと呼ぶ）を用いて頭部カプセルを開き、SOGを露出させます。

Scis zips（シズ・ジップス）について説明します。これは、比較のためにKimwipeから繊維を切り出すScis zipsのデモンストレーションです。まず視野内でアイリス剪刀を用いて行い、次に1mm目盛りの定規の前で実施します。

まず、タングステンブレードを用いて、後縁に切開を加えます。次に、研磨したピンセットを使用して、側縁と前縁を切断します。切断した角質片をピンセットで持ち上げ、除去します。

ピンセットを用いて触角および触角神経を切断します。次に、脳を固定して動きによるアーチファクトを防ぐため、SOGとクチクラの間にある気嚢を選択的に除去します。続いて、咽頭と脳との接続を断つため、咽頭に向かう端とSOGに入る端の両方で食道を切断します。

次に、筋肉16を特定して抽出した後、脳とクチクラを連結している気管をすべて切り離します。ショウジョウバエをスピニングディスク共焦点顕微鏡のステージに置き、撮影用に水浸レンズに切り替えます。その後、491 nanometerの励起レーザーを用い、関心領域に焦点を合わせて、露光時間122 milliseconds、4 hertzで単一の光学切片を撮影します。

針先に小さな日本製の吸水紙（ウィック）を突き出させた注射針を用いて、ショウジョウバエにショ糖を供給します。吸水紙の上にショ糖溶液を少量滴下し、ジョイスティックマニピュレーターで針を保持しながら、柔軟なチューブで針に接続されたインジェクターを用いて溶液を吸引します。

浸した和紙の芯を、飽和を避けるため、一瞬だけPROBUSの先端に接触させます。カルシウムイメージングと同時に、解剖顕微鏡に取り付けたCCDカメラを用いてPROBUSの伸長反応またはPER挙動をモニターし、必ず解剖後1時間以内にデータを収集してください。

100 millimolar の sucrose を含む WIC による刺激に対する、典型的な prob Bois 伸展反応をここに示します。G CAMP 蛍光を観察するため、491 nanometer のレーザーを用いて水溶液をイメージングしました。prob extension 反応挙動中の同時カルシウムイメージングを、刺激前と刺激後の順にここで示すことで、吻牽引筋の運動ニューロンにおける sucrose 誘発性の GAMP 3.0 反応を可視化できます。

定常状態の定量化において、スクロース誘発性のGAMP 3.0応答は、運動ニューロンがスクロース刺激に対して蛍光の急激な上昇で反応し、その後数秒かけてベースラインまで回復する回復相を示すことを明らかにしています。本プラットフォームのショウジョウバエでは、電気生理学、オプトジェネティクス、サイコジェネティクス、あるいはニューロンの化学的活性化や、GFP標識構造のタイムラプスラボイメージングなどの他の手法を用いることが可能であり、シナプス可塑性と記憶の相関といったさらなる疑問を解明することができます。