同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ
2012年4月26日
ミバエ、キイロショウジョウバエは、その口吻または足根から糖刺激に応答して供給するために、その長い鼻を拡張します。私は、私たちは行動観察と同時に、脳内のニューロンの活動を監視することができ、カルシウムイメージング法を用いた口先拡張応答（PER）の観測を組み合わせている。
この手順の全体的な目標は、摂食行動の観察と同時にカルシウムイメージングによってニューロンの活動を監視することです。これは、最初にハエをハエ装置に挿入することによって達成されます。次に、ハエの頭を解剖して脳を露出させます。
次に、解剖されたハエを備えたハエの装置を顕微鏡ステージ上に配置します。手順の最後のステップは、砂糖の芯でプロボアを刺激することです。最終的には、行動のビデオ撮影を通じてProbus伸展と相関するカルシウムイメージングを通じて、同定されたニューロンの活性化を示す結果を得ることができます。
この方法を思いついたのは、水面を泳ぐビールを打つ目のことを考えたときでした。私たちビールは目が裂けていて、水面の上と下の両方を見ることができます。私の実験の難しい点は、脳とSCUが互いに接近していることですが、ビールを飲む人の目のようにきれいに離れていれば、脳が衛星にさらされている間、SCUを乾燥状態に保つことができます。
これは、SCUのすぐ上に非常に簡単な仕切りを作り、乾燥した面を幅の部分から分離し、35ミリメートルのハヤブサ皿の蓋からサイドウォールを溶かして彫刻することでプラットフォームを形作り、適切な角度と厚さを形成します。プラットフォームに穴を開けてフライヘッドを受け入れ、口の部分がチャンバーの外側に自由に露出するようにします。ピペットマンの先端をハエの体を受け入れるのに十分な幅に切り、先端をプラットフォームに接着します。
大人が飢えた後、摂氏25度で24時間飛ぶ。フライを15ミリリットルのプラスチックチューブに入れ、鉗子を使用して氷の上に立って麻酔をかけます。ハエをハエの部屋に挿入し、ハエが動かなくなるまでそっと押し込みます。
近位のプロボスまたは吻の周囲を穴の内側の端に密封するには、吻の側面と上に少量の光硬化接着剤を塗布し、まつげまたは同様のツールを使用して接着剤を慎重に広げます。また、ハエの内側から頭の背側部分と穴の内側の端との間のスペースに接着剤を塗ります。最後に、フライの損傷を避けるために硬化するのに十分な青色光の最も弱い照明で接着剤を硬化させます。
ハエの頭を安定させ、SOGの腹側部分を露出させるために、吻を部分的に持ち上げた状態で保持するための糸を取り付けます。フライを所定の位置に置き、プラットフォームの表面をショ糖を含まない生理食塩水で満たします。ヘッドカプセルを開けて、タングステンブレードと鋭利な先端を持つ鉗子を使用してSOGを露出させます。
Scisジッパー。これは、比較のためにキムワイプから繊維をカットするシスジッパーのデモンストレーションです。これは、最初に視野内の虹彩はさみで行われ、次に1ミリメートルの目盛り付き定規の前で行われます。
まず、タングステンブレードを使用して、後端を切開します。次に、鋭利な鉗子を使用して側面と前端を切り取ります。切っておいたキューティクル片を鉗子で持ち上げて取り出します。
鉗子を使用してアンテナとアンテナ神経を切断します。次に、SOGとキューティクルの間のエアサックを選択的に取り外して、脳を安定させ、運動アーチファクトを防ぎます。次に、咽頭と脳の間の接続を取り除くために、咽頭に向かって食道の端を切断し、SOGに入る端
で食道を切断します。次いで、筋肉16を特定して引き抜いた後、脳とキューティクルとを繋げている任意の気管を剥離する。フライを回転ディスク共焦点顕微鏡のステージに置き、イメージング用の水浸レンズに切り替えます。次に、関心領域に集束する491ナノメートルの励起レーザーを使用して、露光時間122ミリ秒で4ヘルツの単一の光学切片を取ります。
シリンジ針と小さな和の芯を使用します。彼女はハエにショ糖を提供するために先端から紙が突き出ていたのでしょうか?スクロース溶液を少量の液滴を芯に排出し、ジョイスティックマニピュレーターを使用して針を保持するための柔軟なチューブを介して針に接続されたインジェクターで吸引します。
浸したウォッシュペーパーウィックをプローブの先端に塗りますが、一瞬だけです。満腹感を避けるため。カルシウムイメージングと同時に解剖顕微鏡に取り付けたCCDカメラを用いて、PROBUSの伸展応答やPERの挙動をモニタリングし、解剖後1時間以内にデータを収集するようにしてください。
ここに示されているのは、100ミリモルのスクロースを含むWICによる刺激に対する典型的なボア伸展反応です。G CAMP蛍光用の491ナノメートルレーザーを使用してイメージングされた水溶液。ここで最初に刺激前と刺激後に示すプロサ伸展応答行動中の同時カルシウムイメージングにより、吻筋分度器の運動ニューロンにおけるショ糖誘発GAMP 3.0応答の視覚化が可能になります。
スクロース誘発GAMP3.0応答の状態定量化では、運動ニューロンがショ糖刺激に反応して蛍光が急激に増加し、続いてベースラインまで数秒の回復期が続くことが示されています。このプラットフォームは、電気生理学、光遺伝学、心理遺伝学、ニューロンの化学的活性化、GFP標識構造のTimeLapseラボイメージングなどの他の方法を可能にし、シナプスの可塑性と記憶の相関関係などの追加の質問に答えることができます。
概要
この研究は、カルシウムイメージング技術を用いて、ショウジョウバエの摂食行動中のニューロン活動を調査します。砂糖刺激に対する口器伸展反応（PER）を観察することで、研究者はニューロンの活性化と行動反応の相関関係を見出すことができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- カルシウムイメージング
背景
- ショウジョウバエは、ニューロン機能を研究するためのモデル生物です。
- 口器伸展反応（PER）は、よく記録された摂食行動です。
- カルシウムイメージングは、ニューロン活動のリアルタイム観察を可能にします。
- ニューロン反応の理解は、摂食メカニズムへの洞察を提供します。
研究目的
- ショウジョウバエの摂食行動中のニューロン活動をモニターすること。
- 口器伸展反応とニューロン活性化の相関関係を確立すること。
- 行動観察と同時イメージングの方法を開発すること。
使用された方法
- ショウジョウバエの解剖による脳の露出。
- スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いたカルシウムイメージング。
- 砂糖溶液を用いた口器の刺激。
- 口器伸展反応を分析するための行動のビデオ撮影。
主要な結果
- カルシウムイメージングにより、砂糖刺激に対するニューロンの活性化が明らかになりました。
- 口器伸展行動は、ニューロン活動と共に正常にモニターされました。
- 結果は、PER中の運動ニューロンにおける蛍光の急激な増加を示しました。
- この方法は、シナプス可塑性と記憶のさらなる探索を可能にします。
結論
- この研究は、摂食行動におけるニューロン活動を研究する新しいアプローチを提供します。
- 結果は、摂食反応の神経メカニズムの理解に貢献します。
- この方法は、神経科学における他の実験技術にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This methodology enables direct correlation of neuronal activity with quantifiable behavioral outputs in a genetically tractable model, supporting target validation through functional interrogation of neural circuits. By linking calcium signaling dynamics to proboscis extension response—a measurable phenotypic readout—the approach provides mechanistic de-risking for neuroactive compound screening. It establishes a disease-relevant system for studying feeding behavior regulation, offering predictive confidence in target engagement and pathway modulation early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by monitoring real-time neuronal activation in identified feeding center neurons during behavior.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous imaging and behavioral observation, clarifying pathway involvement in PER.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating target modulation with behavioral output, reducing mechanistic ambiguity in neurotarget selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (SOG neurons) for downstream compound screening with quantifiable calcium flux readouts.
- Reproducibility: Standardizes neuronal activity measurement via GCaMP fluorescence, enabling reliable compound evaluation across experiments.
- Scalability: Platform design (FLIES) allows reuse for electrophysiology, optogenetics, or time-lapse imaging, supporting multi-modal assay integration.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models feeding behavior regulation, a conserved process relevant to metabolic disorder target identification.
- Translational Continuity: Bridges discovery (neuronal activity) to preclinical validation by linking synaptic plasticity and memory processes to behavioral output.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by demonstrating target-behavior coupling, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal networks, with outputs informing lead identification through functional target-behavior correlation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing sucrose-induced calcium responses in motor neurons during PER.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative, real-time neuronal activity measurements compatible with compound library screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based readouts and behavioral video data enabling correlation analysis between neural activation and PER magnitude.
- Translational Research: Connects to preclinical work by probing synaptic plasticity and memory mechanisms underlying sustained behavioral responses.
- Enterprise Reuse: FLIES platform serves as a reusable capability for live brain imaging across neuropharmacology, genetics, and circuit mapping initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct observation of neuronal-behavioral coupling in a genetically accessible system.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via immobilized fly preparation and controlled stimulus delivery, minimizing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic uncertainty in neurotarget engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets demonstrating strong correlation between neuronal activity and feeding behavior phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, microsurgery, and calcium imaging techniques for SOG targeting.
- Dependent on spinning disc confocal microscopy with water immersion lens and GCaMP-compatible excitation (491 nm).
- Necessitates cross-team standardization for stimulus delivery (sucrose wick) and behavioral scoring (PER videotaping) to ensure data consistency.
- Adaptation considerations include modifying the FLIES platform for different neuronal targets or behavioral assays beyond proboscis extension.
- Practical limitations include dissection time constraints (data collection within one hour) and potential movement artifacts despite stabilization efforts.
