DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

この手順の全体的な目的は、組織切片において2つの主要なタイプのDNA断裂を標識する、デュアルラベルDNA損傷センサーの組み立て方と使用方法を実証することです。このセンサーは、ZIとルミンでデュアルラベルされた30 ntの腫瘍DNAオリゴヌクレオチドと、自己 assembleする酵素であるワクシニアトポイソメラーゼI（vac topo）で構成されています。VAC topoが30 ntの腫瘍に結合すると、topoが認識配列の3'末端でオリゴヌクレオチドを切断することで作動し、その結果、vac topo活性化fitzy標識ユニットとアミン標識遊離ヘアピンが生成されます。

末端に3'ヒドロキシ基を持つため、これらのユニットは短命であり、速やかに元の構造へと再 assembly され、その後再び切断されます。追加の分子内DNA断裂がない場合、これら2つのユニットは周期的に分離と結合を繰り返します。分子センサーをDNA損傷のある組織切片に適用すると、Fitz標識検出ユニットが、5'ヒドロキシ基を持つ平滑末端のDNA断裂部位に選択的に結合します。

Rドメイン標識検出ユニットは、5'末端リン酸基を持つ平末端切断部位にライゲーションされます。T4 DNAリガーゼが存在する場合、蛍光顕微鏡に基づいて、細胞内におけるDNAの1本鎖切断および2本鎖切断の存在と分布を示す結果が得られます。TUNEL法などの既存のDSB検出法に対するこの手法の主な利点は、より特異性が高く、アポトーシスの自己完結的な相と食細胞による相の両方を標識することで、さらなる情報を提供できる点にあります。

ナノテクノロジーの視点から見ると、このセンサーは、実際の生物学的構造やアーキテクチャを非毒性の分子スケールデバイスの構築に適応させた、バイオ基盤アプローチを例示しています。一般的に、この手法に不慣れな者は、その成功が高活性のToro SOM調製物の使用および、proteinase Kによる過剰消化を避けるための切片の適切な処理に依存するため、困難に直面する可能性があります。本手順に用いる組織切片は、分子デバイスを組み立てる前に準備しておく必要があります。パラアルデヒド固定組織から、厚さ5〜6 µmの切片を作成します。

固定パラフィン包埋組織ブロックの使用が推奨されます。組織切片を載せたスライドをスライドラックに入れ、キシレン中で15分間脱パラフィンします。15分後、新しいキシレン浴に移し、さらに5分間処理します。

スライドを以下の段階的なエタノール濃度に浸し、切片を親水化します。96% ethanolに2回、各5分間。次に80% ethanolに5分間浸し、最後に水に通します。

5分間を2回繰り返します。再水和後、切片をproteinase Kで消化します。切片1枚あたり50 µg/mL溶液を100 µL使用し、加湿チャンバー内で室温で15分間インキュベートします。組織の種類によって消化時間を調整する必要がある場合がありますが、過剰消化になるとシグナルの消失や切片の崩壊を招くため、注意してください。

スライドを蒸留水で2回、各10分間すすぎます。2%BSAを塗布してプレブロッキングを行い、加湿チャンバー内で室温にて15分間インキュベートします。この間に、このビデオで次に示すように分子マシンを組み立てます。

分子マシンの構築に使用するすべての試薬は、平均的なサイズの組織切片1枚の検出に十分な合計容量25 µLに合わせて調整されています。必要に応じて、小さなプラスチックチューブを用いて容量を増やすことができます。以下の試薬を、この順序で蒸留水に加えて混合してください。

15% polyethylene glycol 8,000、T4 DNA Ligase バッファー、二重標識オリゴヌクレオチド、vaccinia topoisomerase I、および T4 DNA Ligase をピペッティングで穏やかに混ぜ合わせます。この溶液中で分子構築物はほぼ瞬時に自己組織化し、室温でそのまま使用可能です。DNA切断部位の標識手順を開始するには、スライドから事前ブロッキング溶液を吸引してください。

各セクションに反応混合液を25 µLずつ滴下します。セクションの上にプラスチックカバーガラスを載せ、スライドを加湿チャンバーに入れます。チャンバーをアルミホイルで包んで遮光し、室温で1時間インキュベートします。

1時間のインキュベーション後にリガーゼとtopoの両方のシグナルが観察されますが、多くの場合、リガーゼのシグナルをさらに増強させることができます。シグナルを増強させるには、vac topoおよびオリゴヌクレオチド1を除き、オリゴヌクレオチド3とT4 DNA Ligaseを含む反応混合液を再適用し、切片上にプラスチック製カバーガラスを載せて、加湿チャンバー内で18時間インキュベートします。翌日、室温でスライドを室温の水が入ったコプランジャーに垂直にそっと浸し、カバーガラスを取り除きます。

次に、切片を蒸留水で10分間ずつ3回洗浄します。その後、切片を炭酸水素ナトリウム緩衝液でリンスします。このアルカリ性溶液によるリンスは、pHに敏感でpH 7以下では著しく低下するfitzy蛍光を増強させます。

最後に、核染色用のDPIを含む抗退色溶液で切片を覆い、カバーガラスを被せます。これで切片は蛍光顕微鏡観察の準備が整いました。この図は、デキサメタゾン処理した胸腺の組織切片を示しており、分子マシンが、アポトーシスが進行している胸腺皮質領域において、DNA-1型およびDNA-2型の鈍端DNA断裂を検出したものです。緑色の細胞質蛍光はDNA-2型の断裂を示しており、アポトーシスを起こした胸腺細胞の核物質を消化している皮質マクロファージがマークされています。

このシグナルはvac topoによって生成され、5'水酸基を含むDNAを持つFGAリソソームに局在します。二本鎖切断は赤色蛍光で示され、DNAの1種類の切断標識として機能し、マクロファージに貪食されていないアポトーシス thymocytes の核を標識します。膨大な数の thymocytes が同時にアポトーシスを起こします。

リガーゼを用いた標識により可視化された、5つのプライムリン酸二本鎖切断の生成を伴っています。これらの切断部位は核周辺に位置し、リング状のパターンを形成しています。すべての細胞核は、DPIによる対比染色により青色に可視化されています。

この手順を行う際は、異なる溶液を添加する間に切片を乾燥させないことが重要です。また、すべての酵素調製液は切片に加えるまで氷上で保持し、蛍光プローブは標識反応および現像後の光から保護してください。この手法により、ヘテロ細胞解離のすべての段階を可視化することが可能となりました。

このセンサー自体は、ナノスケールの粒子、プローブ、およびマシンの設計におけるグリーンナノテクノロジーアプローチの一例です。このアプローチでは、人工的なコンポーネントと天然に存在する分子マシン部品を組み合わせています。その目的は、これら高度に分散したナノ材料の毒性と、有害な生物学的反応性を排除することにあります。